免疫組化染色質(zhì)量控制在鼻咽組織切片中的應(yīng)用

免疫組化染色質(zhì)量控制在鼻咽組織切片中的應(yīng)用

鼻咽組織;免疫組織化學(xué);標(biāo)準(zhǔn)化;質(zhì)量控制

QualityControlofImmunohistochemicalStainiginSliceofNasopharynxTissues

Abstract：ObjectiveToestablishastandardempiricalprocessofimmunohistochemicalstainingandslicemakingofnasopharynxtissuescateringtotherequirementforpathologicaldiagnosisandresearchintheIntroducingthemethodsofimmunohistochemicalstainingandslicemakingofnasopharynxtissuesaswellasthelinkofqualitycontrolindetail.ResultsTheresultsshownthatmethodhasthreefeatures:stableandreliable,strongspecificity，andhighsensitivity.ConclusionThismethodcanimprovethequalityofimmunohistochemicalstainingofnasopharynxtissue.

Keywords:Nasopharynxtissue;Immunohistochemistry;Qualitycontrol

鼻咽癌是我國(guó)華南地區(qū)常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，其發(fā)生的病因、發(fā)病機(jī)制以及發(fā)生發(fā)展也是我們廣東醫(yī)學(xué)院病理學(xué)教研室一直關(guān)注和研究的課題。由于鼻咽組織活檢時(shí)不易大量取材，且組織中淋巴細(xì)胞較多，組織質(zhì)地較脆，石蠟切片常出現(xiàn)組織碎裂、染色發(fā)白、模糊不清、細(xì)胞固縮等現(xiàn)象，另外淋巴細(xì)胞、網(wǎng)狀細(xì)胞表面上的Fc受體及一些反應(yīng)性淋巴細(xì)胞干擾免疫組化的結(jié)果，導(dǎo)致制作滿意的鼻咽組織石蠟切片及其免疫組化染色較為困難，繼而影響病理診斷及后續(xù)的科研工作。為此，我們摸索自己實(shí)驗(yàn)室的工作條件及各種抗體最佳的實(shí)驗(yàn)條件來(lái)制定標(biāo)準(zhǔn)化實(shí)驗(yàn)流程，穩(wěn)定鼻咽組織石蠟切片及其免疫組化染色的質(zhì)量，現(xiàn)報(bào)道如下。

1材料與方法

1．1材料來(lái)自廣東醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院臨床送檢的鼻咽標(biāo)本。

1．2主要儀器輪轉(zhuǎn)切片機(jī)(德國(guó),Leica)、家用高壓鍋(廣州)。

1．3主要試劑p53、PCNA、Ecadherin等鼠抗人單克隆抗體、多克隆抗體及免疫組化染色SP試劑盒、濃縮型DAB試劑盒、抗體稀釋液均購(gòu)自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。

1．4組織切片的制備鼻咽組織離體時(shí)立即用生理鹽水輕輕洗去組織上的血液及黏液,隨后即用4%中性緩沖甲醛液固定,并及時(shí)送病理科作進(jìn)一步處理。4%中性緩沖甲醛液固定不宜超過(guò)18h。脫水從低濃度乙醇到高濃度乙醇梯度脫水,級(jí)差以10%為宜，一般從60%乙醇開(kāi)始30min,70%乙醇30min,80%乙醇25min,95%乙醇25min,無(wú)水乙醇Ⅰ20min,無(wú)水乙醇Ⅱ20min;二甲苯Ⅰ10min,二甲苯Ⅱ10min;58℃石蠟浸蠟，期間最好更換1次，浸蠟3h后60℃石蠟包埋制成蠟塊。一次性刀片進(jìn)行切片，切片厚度為2μm～3μm,40℃以下水溫展片,65℃溫箱烤片1h～4h。

1．5免疫組化染色方法切片烤片后脫蠟至水，然后蒸餾水洗兩次，高壓鍋內(nèi)放約5cm深的自來(lái)水，大火加熱至沸騰，再將檸檬酸鹽緩沖液(200ml～400mlpH)倒入搪瓷杯中，把切片置于耐高溫塑料切片架上放入盛有緩沖液的搪瓷杯中，蓋上鍋蓋，扣上壓力閥，繼續(xù)中火加熱至噴氣，從噴氣開(kāi)始記時(shí)1min后，壓力鍋離開(kāi)火源，冷卻至室溫(稍冷后,可在自來(lái)水龍頭下流水加速冷卻)，取出切片，先用蒸餾水沖洗兩次之后用PBS(pH～)沖洗，余下按免疫組化步驟選擇不同的抗體進(jìn)行染色。

2結(jié)果

鼻咽切片組織無(wú)收縮、開(kāi)裂，組織結(jié)構(gòu)、細(xì)胞形態(tài)清晰，鼻咽癌癌細(xì)胞及各種炎癥細(xì)胞能清晰辨認(rèn)，HE染色鮮艷，細(xì)胞核呈鮮明的藍(lán)色,細(xì)胞質(zhì)被伊紅染成深淺不同的粉紅色、桃紅色，核仁呈紅色，對(duì)比度良好(見(jiàn)圖1)。免疫組化染色結(jié)果為病變組織結(jié)構(gòu)完整、無(wú)脫片現(xiàn)象，陽(yáng)性與陰性對(duì)比明顯，陽(yáng)性物質(zhì)定位準(zhǔn)確；背景干凈、清晰，無(wú)非特異性著色(圖2),組織結(jié)構(gòu)與細(xì)胞輪廓完整、清晰，染色結(jié)果穩(wěn)定可靠、敏感性高、特異性強(qiáng)、細(xì)胞核呈藍(lán)色、適合顯微照相等。

圖1鼻咽癌組織(HE400)

圖2Ecadherin在鼻咽慢性炎上皮的強(qiáng)陽(yáng)性表達(dá)(SP400)

3討論

免疫組織化學(xué)由于其具有的復(fù)雜性，在技術(shù)應(yīng)用過(guò)程中存在不少問(wèn)題，直接或間接地影響了最終的病理診斷，應(yīng)予以重視以下幾方面，才能從總體上保證鼻咽組織免疫組化染色的質(zhì)量。

制作優(yōu)質(zhì)石蠟切片是做好鼻咽組織免疫組化染色的基礎(chǔ)取材時(shí)鼻咽組織上的血液及黏液將影響固定液的滲透和干擾免疫組化染色的結(jié)果，而且鼻咽組織由于組織中淋巴細(xì)胞比較豐富和致密，間質(zhì)成分較少是難以制作優(yōu)質(zhì)石蠟切片的主要原因，所以組織固定的好壞是影響免疫組化結(jié)果的關(guān)鍵因素。因此有條件時(shí)，鼻咽組織離體時(shí)立即用生理鹽水洗去組織上的血液和黏液，并用4%中性緩沖甲醛液固定；或者用4%中性緩沖甲醛液固定后及時(shí)送病理科做進(jìn)一步處理：即輕輕晃動(dòng)瓶?jī)?nèi)固定液,利用原有固定液洗去鼻咽組織上的血液及黏液,再換一次4%中性緩沖甲醛液固定。乙醇脫水盡可能從較低濃度起始，以免組織過(guò)度收縮。常溫下二甲苯透明時(shí)間≤30min，不然組織變脆。制片嚴(yán)格按操作程序進(jìn)行，否則是免疫組化產(chǎn)生假陽(yáng)性、假陰性或脫片的主要原因。

鼻咽組織蠟塊的管理因?yàn)橐紤]患者的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)，經(jīng)病理確診后的病例做免疫組化染色不普遍，鼻咽組織做免疫組化染色絕大部分是教師或研究生的研究課題需要。為了檔案資料的齊全和避免醫(yī)療糾紛，＜2mm組織的蠟塊一般不允許再切片。教師或研究生選擇做免疫組化的鼻咽組織蠟塊要通過(guò)觀察HE染色切片的組織形態(tài)的基礎(chǔ)上來(lái)決定，根據(jù)診斷來(lái)選擇，不要選擇組織壞死和出血多的蠟塊，所有需要做免疫組化的鼻咽組織切片均由有經(jīng)驗(yàn)的專業(yè)技術(shù)員切片，以防組織蠟塊切削過(guò)多。切片完畢后組織蠟塊要及時(shí)封蠟歸檔，力求科研工作有延續(xù)性和檔案資料的完整性。

免疫組化切片的質(zhì)量控制要求免疫組化染色使用的玻片必須用飽和的重鉻酸鉀濃硫酸液浸泡3d以上，撈出后用自來(lái)水徹底清洗干凈，再經(jīng)95%乙醇過(guò)一遍，晾干后涂防脫片劑烘干備用。裱片時(shí)切片片膜不能留有氣泡，烤片時(shí)溫度過(guò)低、時(shí)間過(guò)短，則易脫片，溫度過(guò)高、時(shí)間過(guò)長(zhǎng)則對(duì)抗原有破壞，烤片后用專用二甲苯、乙醇脫蠟至水洗，脫蠟要徹底。我們?cè)捎梦⒉訜岬确椒ㄟM(jìn)行抗原修復(fù)，但效果不如高溫高壓抗原修復(fù)法理想。另外高溫高壓加熱時(shí)間的長(zhǎng)短很重要，從組織切片放入緩沖液到高壓鍋離開(kāi)火源的總時(shí)間控制在3min內(nèi)，時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，可能會(huì)使染色背景加深。檸檬酸緩沖液不能重復(fù)使用，且容量必須保證所有切片都能浸泡到，整個(gè)染色過(guò)程不要讓切片干涸。顯色在鏡下控制，時(shí)間約3min～7min，在陽(yáng)性明確的部位著淡黃色即終止顯色，此時(shí)顯色程度較佳，能有效地避免背景著色。蘇木素復(fù)染后要充分返藍(lán)，否則背景呈紫紅色(見(jiàn)圖3)。

圖3蘇木素復(fù)染未充分返藍(lán)、背景呈紫紅色

增強(qiáng)特異性著色、降低非特異性染色是免疫組化的質(zhì)量保證抗體是免疫組織化學(xué)最核心的試劑，其質(zhì)量直接影響免疫組織化學(xué)的結(jié)果判斷繼而影響診斷，由于鼻咽組織中的淋巴細(xì)胞、網(wǎng)狀細(xì)胞會(huì)產(chǎn)生非特異性染色。因此要選擇特異性強(qiáng)、效價(jià)高的一抗，新購(gòu)進(jìn)的抗體儲(chǔ)存在4℃冰箱并進(jìn)行預(yù)實(shí)驗(yàn)，摸索出最佳實(shí)驗(yàn)條件?？贵w的稀釋包括特異性一抗、中間聯(lián)結(jié)抗體及標(biāo)記抗體，其稀釋度與抗體的濃度、質(zhì)量及有效期、孵育時(shí)間和采用的方法等。防止失效的抗體進(jìn)入實(shí)驗(yàn)室，此外要選擇病變典型的做免疫組化染色對(duì)照，一定要每一批免疫組化均設(shè)有已知陽(yáng)性對(duì)照和用PBS代替一抗的空白對(duì)照。

免疫組織化學(xué)結(jié)果的判讀結(jié)果的判斷免疫組化切片應(yīng)是陽(yáng)性標(biāo)記強(qiáng)而非特異性染色淡或無(wú),兩者形成鮮明的對(duì)比,陽(yáng)性表達(dá)必須在細(xì)胞或組織特定的部位,細(xì)胞邊界清楚;每批染色都要有陽(yáng)性對(duì)照、陰性對(duì)照和自身對(duì)照才能對(duì)染色結(jié)果作出正確判斷。判斷標(biāo)準(zhǔn)常根據(jù)陽(yáng)性細(xì)胞的百分比或陽(yáng)性細(xì)胞的染色深度來(lái)判斷,其顏色深淺反映抗原量的多少。免疫組化染色結(jié)果還要結(jié)合組織形態(tài)學(xué)判斷是真正的陽(yáng)性染色而非其他著色。陽(yáng)性反應(yīng)分布總是有規(guī)律、局限、定位準(zhǔn)確和一定形態(tài)特征的,如細(xì)胞膜著色呈圓形;典型的細(xì)胞核著色為均質(zhì)狀,核仁和染色質(zhì)呈顆粒狀著色。

免疫組織化學(xué)陽(yáng)性庫(kù)的建立為了保證陽(yáng)性對(duì)照的可靠性，在日常工作中要收集各種抗原的陽(yáng)性組織和陽(yáng)性切片，逐步建立陽(yáng)性對(duì)照切片庫(kù)及相應(yīng)的電子檔案庫(kù)。如預(yù)期結(jié)果為陰性或病理形態(tài)診斷與免疫組化結(jié)果相反時(shí)，必須要有陽(yáng)性對(duì)照才能作出正確的病理診斷，陽(yáng)性對(duì)照能說(shuō)明染色技術(shù)和陰性結(jié)果的可靠性，不是由于標(biāo)本處理不當(dāng)導(dǎo)致的抗原喪失、方法錯(cuò)誤、技術(shù)不熟練等造成的假陰性。鼻咽組織免