利用實(shí)時(shí)定量-PCR技術(shù)通過(guò)-△△CT-方法分析相對(duì)基因表達(dá)差異優(yōu)質(zhì)資料

利用實(shí)時(shí)定量PCR技術(shù)通過(guò)-△△CT方法分析相對(duì)基因表達(dá)差異優(yōu)質(zhì)資料(可以直接使用，可編輯優(yōu)質(zhì)資料，歡迎下載）

利用實(shí)時(shí)定量PCR技術(shù)通過(guò)2-△△CT方法分析相對(duì)基因表達(dá)差異利用實(shí)時(shí)定量PCR技術(shù)通過(guò)-△△CT方法分析相對(duì)基因表達(dá)差異優(yōu)質(zhì)資料(可以直接使用，可編輯優(yōu)質(zhì)資料，歡迎下載）KennethJ.LivakandThomasD.SchmittgenDepartmentofPharmaceuticalSciences,CollegeofPharmacy.WashingtonStateUniversity,Washington99164-6534現(xiàn)在最常用的兩種分析實(shí)時(shí)定量PCR實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的方法是絕對(duì)定量和相對(duì)定量。絕對(duì)定量通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算起始模板的拷貝數(shù)；相對(duì)定量方法則是比較經(jīng)過(guò)處理的樣品和未經(jīng)處理的樣品目標(biāo)轉(zhuǎn)錄本之間的表達(dá)差異。2-△△CT方法是實(shí)時(shí)定量PCR實(shí)驗(yàn)中分析基因表達(dá)相對(duì)變化的一種簡(jiǎn)便方法。本文介紹了該方法的推導(dǎo)，假設(shè)及其應(yīng)用。另外，在本文中我們還介紹了兩種2-△△CT衍生方法的推導(dǎo)和應(yīng)用，它們?cè)趯?shí)時(shí)定量PCR數(shù)據(jù)分析中可能會(huì)被用到。關(guān)鍵詞：反轉(zhuǎn)錄PCR定量PCR相對(duì)定量實(shí)時(shí)PCRTaqman反轉(zhuǎn)錄PCR（RT-PCR）是基因表達(dá)定量非常有用的一種方法（1－3）。實(shí)時(shí)PCR技術(shù)和RT-PCR的結(jié)合產(chǎn)生了反轉(zhuǎn)錄定量PCR技術(shù)（4，5）。實(shí)時(shí)定量PCR的數(shù)據(jù)分析方法有兩種：絕對(duì)定量和相對(duì)定量。絕對(duì)定量一般通過(guò)定量標(biāo)準(zhǔn)曲線來(lái)確定我們所感興趣的轉(zhuǎn)錄本的拷貝數(shù)；相對(duì)定量方法則是用來(lái)確定經(jīng)過(guò)不同處理的樣品目標(biāo)轉(zhuǎn)錄本之間的表達(dá)差異或是目標(biāo)轉(zhuǎn)錄本在不同時(shí)相的表達(dá)差異。絕對(duì)定量通常在需要確定轉(zhuǎn)錄本絕對(duì)拷貝數(shù)的條件下使用。通過(guò)實(shí)時(shí)PCR進(jìn)行絕對(duì)定量已有多篇報(bào)道（6－9），包括已發(fā)表的兩篇研究論文（10，11）。在有些情況下，并不需要對(duì)轉(zhuǎn)錄本進(jìn)行絕對(duì)定量，只需要給出相對(duì)基因表達(dá)差異即可。顯然，我們說(shuō)X基因在經(jīng)過(guò)某種處理后表達(dá)量增加2.5倍比說(shuō)該基因的表達(dá)從1000拷貝/細(xì)胞增加到2500拷貝/細(xì)胞更加直觀。用實(shí)時(shí)PCR對(duì)基因表達(dá)進(jìn)行相對(duì)定量分析需要特殊的公式、假設(shè)以及對(duì)這些假設(shè)的驗(yàn)證。2-△△CT方法可用于定量PCR實(shí)驗(yàn)來(lái)計(jì)算基因表達(dá)的相對(duì)變化：2-△△CT公式的推導(dǎo),以及實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，有效性評(píng)估在AppliedBiosystemsUserBulletinNo.2(P/N4303859)中有介紹。用2-△△CT方法分析基因表達(dá)數(shù)據(jù)在文獻(xiàn)中也有報(bào)道(5,6)。本文介紹了該方法的推導(dǎo)、假設(shè)以及應(yīng)用。另外，本文還介紹了2-△△CT兩種衍生方法的推導(dǎo)和應(yīng)用，它們?cè)趯?shí)時(shí)定量PCR數(shù)據(jù)分析中都可能被用到。?

2-△△CT方法?

2-△△CT方法的推導(dǎo)PCR指數(shù)擴(kuò)增的公式是：Xn是第n個(gè)循環(huán)后目標(biāo)分子數(shù)。X0是初始目標(biāo)分子數(shù)。Ex是目標(biāo)分子擴(kuò)增效率。n是循環(huán)數(shù)CT代表目標(biāo)擴(kuò)增產(chǎn)物達(dá)到設(shè)定閾值所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)因此：XT是目標(biāo)分子達(dá)到設(shè)定的閾值時(shí)的分子數(shù)。CT,X是目標(biāo)分子擴(kuò)增達(dá)到閾值時(shí)的循環(huán)數(shù)。Kx是一個(gè)常數(shù)對(duì)于內(nèi)參反應(yīng)而言，也有同樣的公式：用XT除以RT得到：對(duì)于使用Taqman探針的實(shí)時(shí)擴(kuò)增而言，XT和RT的值由一系列因素決定：包括探針?biāo)鶐У臒晒鈭?bào)導(dǎo)基團(tuán)、探針序列對(duì)探針熒光特性的影響、探針的水解效率和純度以及熒光閾值的設(shè)定。因此常數(shù)K并不一定等于1。假設(shè)目標(biāo)序列與內(nèi)參序列擴(kuò)增效率相同：或：XN代表經(jīng)過(guò)均一化處理過(guò)的初始目標(biāo)分子量；△CT表示目標(biāo)基因和內(nèi)標(biāo)基因CT值的差異（CT,X-CT,R）整理上式得：最后用任一樣本q的XN除以參照因子（calibrator，cb）的XN得到：在這里對(duì)于一個(gè)少于150bp的擴(kuò)增片斷而言，如果Mg2+濃度、引物都進(jìn)行了適當(dāng)?shù)膬?yōu)化，擴(kuò)增效率接近于1。因此目標(biāo)序列的量通過(guò)內(nèi)均一化處理之后相對(duì)于參照因子而言就是：1.2方法的假設(shè)和應(yīng)用要使△△CT計(jì)算方法有效，目標(biāo)序列和內(nèi)參序列的擴(kuò)增效率必須相等?？磧蓚€(gè)反應(yīng)是否具有相同的擴(kuò)增效率的方法是看他們模板濃度梯度稀釋后擴(kuò)增產(chǎn)物△CT如何變化。圖1顯示的是cDNA樣品在100倍稀釋范圍內(nèi)的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。對(duì)于每一個(gè)稀釋樣本，都用GAPDH和c-myc特異的熒光探針及引物進(jìn)行擴(kuò)增。計(jì)算出c-myc和GAPDH的平均CT值以及△CT值，通過(guò)cDNA濃度梯度的log值對(duì)△CT值作圖，如果所得直線斜率絕對(duì)值接近于0，說(shuō)明目標(biāo)基因和內(nèi)標(biāo)基因的擴(kuò)增效率相同，就可以通過(guò)△△CT方法進(jìn)行相對(duì)定量。在圖1中，直線斜率是0.047，因而假設(shè)成立，△△CT方法可以用來(lái)分析數(shù)據(jù)。如果兩個(gè)擴(kuò)增反應(yīng)效率不同，則需要通過(guò)定量標(biāo)準(zhǔn)曲線和絕對(duì)定量的方法來(lái)進(jìn)行相對(duì)定量；或者也可以重新設(shè)計(jì)引物，優(yōu)化反應(yīng)條件使得目標(biāo)序列和內(nèi)參序列具有相同的擴(kuò)增效率。1.3內(nèi)標(biāo)和參照因子的選擇使用內(nèi)標(biāo)基因的目的是為了對(duì)加入到反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)中的RNA進(jìn)行均一化處理。標(biāo)準(zhǔn)的看家基因一般都可被用作內(nèi)標(biāo)基因。適合于實(shí)時(shí)PCR反應(yīng)內(nèi)標(biāo)基因包括GAPDH，β-actin,β2-microglobulin以及rRNA。當(dāng)然，其它的看家基因也同樣能被用作內(nèi)標(biāo)。我們推薦在應(yīng)用某一基因作為內(nèi)標(biāo)之前首先確證該基因的表達(dá)不會(huì)受實(shí)驗(yàn)處理的影響。驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)處理是否對(duì)內(nèi)標(biāo)基因表達(dá)產(chǎn)生影響的方法在2.2部分有描述。方法中參照因子的選擇決定于基因表達(dá)定量實(shí)驗(yàn)的類型。最簡(jiǎn)單的設(shè)計(jì)就是把未經(jīng)處理的樣品作為參照因子（calibrator）。經(jīng)內(nèi)標(biāo)基因均一化處理后，通過(guò)方法計(jì)算，目標(biāo)基因表達(dá)差異通過(guò)經(jīng)過(guò)處理的樣本相對(duì)于未經(jīng)處理的樣本的倍數(shù)來(lái)表示。對(duì)于未經(jīng)處理的參照樣，△△CT＝0，而20＝1。所以根據(jù)定義，未處理樣本的倍數(shù)變化為1。而對(duì)于那些經(jīng)過(guò)處理的樣本，相對(duì)于參考因子基因表達(dá)的倍數(shù)為。同樣的分析也可用于不同時(shí)相的基因表達(dá)差異，在這種情況下，一般選0時(shí)刻的樣本作為參照因子。有些情況下，并不是比較不同處理樣本基因表達(dá)差異。例如，有的是想看某一器官中特定mRNA的表達(dá)。在這種情況下，參照因子可能是另一器官中該mRNA的表達(dá)。表1顯示了大腦和腎臟總RNA中c-myc和GAPDH轉(zhuǎn)錄本的CT值。在這一個(gè)例子中，大腦被人為的選擇為參照因子，通過(guò)計(jì)算得到腎臟c-myc表達(dá)量經(jīng)GAPDH校正后相對(duì)于大腦的表達(dá)量的結(jié)果。盡管相對(duì)定量方法可用于這種組織之間的比較，但結(jié)果的生物學(xué)解釋是相當(dāng)復(fù)雜的。不同種類細(xì)胞中目標(biāo)和參照轉(zhuǎn)錄本單一的相對(duì)量變化可能在任何特定的組織中都存在。

1.4方法的數(shù)據(jù)分析實(shí)時(shí)定量PCR所得到CT值可以很容易的輸出到表格程序如MicrosoftExcel中去。為了顯示數(shù)據(jù)分析過(guò)程，我們?cè)谶@里給出了一個(gè)基因表達(dá)定量的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)和樣本列表。通過(guò)β-actin均一化處理，我們對(duì)目標(biāo)基因fos-glo-myc的表達(dá)變化進(jìn)行了監(jiān)測(cè)。在8h的時(shí)間范圍內(nèi)，在每一時(shí)間點(diǎn)都取3個(gè)重復(fù)樣本，每一樣本在cDNA合成之后都做定量PCR，數(shù)據(jù)分析用到了公式9，即：Timex表示任意時(shí)間點(diǎn)，Time0表示經(jīng)β-actin校正后1倍量的目標(biāo)基因表達(dá)。0時(shí)刻目標(biāo)基因和內(nèi)標(biāo)基因的平均CT（見圖2第8欄）被用于公式9中。通過(guò)公式9計(jì)算出每一個(gè)樣本目標(biāo)基因表達(dá)通過(guò)β-actin均一化處理后相對(duì)于0時(shí)刻的倍數(shù)（見圖2第9欄）。平均SD，CV由每一個(gè)時(shí)間點(diǎn)所取的三個(gè)重復(fù)樣求得。用這種分析方法，在0時(shí)刻的平均倍數(shù)變化接近于1。我們發(fā)現(xiàn)通過(guò)檢測(cè)在0時(shí)刻平均倍數(shù)變化是否為1可以很方便的驗(yàn)證三個(gè)重復(fù)樣品之間是否有錯(cuò)誤或者誤差。如果得到的結(jié)果與1偏差很大,則表明存在計(jì)算錯(cuò)誤或者是很高的實(shí)驗(yàn)誤差。在前面的例子中，在每一時(shí)間點(diǎn)上分別取了三個(gè)獨(dú)立的RNA樣本進(jìn)行了分析。因此對(duì)每一個(gè)樣本分別處理，通過(guò)計(jì)算后取結(jié)果的平均值就非常重要。如果是同一樣本進(jìn)行PCR擴(kuò)增的重復(fù)，這就需要首先求出平均CT,然后再進(jìn)行計(jì)算。怎么樣計(jì)算平均值就要看目標(biāo)基因和內(nèi)參基因是在同一個(gè)管子中擴(kuò)增還是在不同的管子中擴(kuò)增。表1給出了目標(biāo)基因（c-myc）和內(nèi)參基因（GAPDH）在不同管中擴(kuò)增的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。在這里不應(yīng)該把任一單個(gè)的c-myc管子和GAPDH管子作比較，而應(yīng)該分別計(jì)算出c-myc和GAPDH的平均CT來(lái)計(jì)算△CT。重復(fù)實(shí)驗(yàn)中CT值的估計(jì)偏差通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)的指數(shù)計(jì)算轉(zhuǎn)化成最后結(jié)果中相對(duì)量的變化。但其中的一個(gè)難點(diǎn)是CT值與相應(yīng)的拷貝數(shù)成指數(shù)關(guān)系（見第4部分）,因此，在最后的計(jì)算中，的誤差通過(guò)△△CT加上標(biāo)準(zhǔn)偏差和△△CT減去標(biāo)準(zhǔn)偏差來(lái)評(píng)估，這就使得求得的數(shù)值相對(duì)于平均值呈不對(duì)稱分布。不對(duì)稱分布是因?yàn)榻Y(jié)果經(jīng)指數(shù)處理后轉(zhuǎn)化成量的線性比較造成的。通過(guò)不同熒光染料標(biāo)記的探針，我們可以在同一管中同時(shí)擴(kuò)增目標(biāo)序列和內(nèi)標(biāo)序列。表2給出了目標(biāo)基因（c-myc）和內(nèi)標(biāo)基因（GAPDH）在同一管中擴(kuò)增的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。對(duì)于任意一個(gè)管子，目標(biāo)基因（c-myc）和內(nèi)參基因（GAPDH）擴(kuò)增時(shí)加入的cDNA量都是一樣多的，所以可以分別對(duì)每個(gè)管子計(jì)算△CT值，這些值取平均后再進(jìn)行計(jì)算。在這里估計(jì)誤差值也是一個(gè)不對(duì)稱的范圍，反映了誤差經(jīng)指數(shù)處理轉(zhuǎn)化為線性差異。在表1和表2中，估計(jì)誤差在從△CT到△△CT的計(jì)算中未見有增加，這是因?yàn)槲覀儼褏⒄栈蚝蜋z測(cè)基因的誤差都顯示出來(lái)了。我們把△CT,cb當(dāng)作一個(gè)人為設(shè)定的常數(shù)來(lái)減去，得到△△CT。這樣得到的結(jié)果就與圖2所顯示的在求平均之前對(duì)不同重復(fù)樣本分別通過(guò)各自的CT值求所得結(jié)果相當(dāng)。另一種方法是將參照基因當(dāng)作沒有任何誤差的１倍的量，在這種情況下，平均△CT,cb的誤差值被引入到每一樣本的△△CT中。在表１中，腎臟中△△CT變成－2.50±0.20而經(jīng)過(guò)校正的c-myc量是5.6倍，范圍從4.9到5.6。而在大腦中的結(jié)果是沒有誤差的１倍。2.2-ΔCT’方法2.12-△CT’方法的推導(dǎo)通過(guò)內(nèi)標(biāo)RNA可以對(duì)加入RNA的量的差異進(jìn)行校正。方法的數(shù)據(jù)分析的一個(gè)特點(diǎn)就是能夠利用實(shí)時(shí)PCR實(shí)驗(yàn)的一部分?jǐn)?shù)據(jù)來(lái)完成這種校正。在其它的方法不能定量初始RNA量的時(shí)候：例如，在能得到的RNA量非常有限的時(shí)候或者需要處理高通量的樣品的時(shí)候，這一方法的優(yōu)勢(shì)就格外明顯。當(dāng)然我們也可以利用PCR實(shí)驗(yàn)以外的方法來(lái)完成這種校正。最常用的一種方法就是用紫外吸收來(lái)確定用于cDNA合成的RNA量，然后將相同的RNA反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生的cDNA用于PCR定量反應(yīng)。這種外標(biāo)法校正的一個(gè)應(yīng)用例子就是研究某種實(shí)驗(yàn)處理是否影響內(nèi)標(biāo)基因的表達(dá)。在這里，目標(biāo)基因和內(nèi)標(biāo)合二為一。在這個(gè)例子中，公式[2]不被公式[3]除，公式［5］變成：整理得：任一樣品Ｘ0,q除以參照品X0,cb得：在這里△CT’=CT,q-CT,cb。△CT’與前面計(jì)算中用的△CT（用目標(biāo)基因CT值減去參照基因CT值）相互區(qū)別。就象在1.1部分所描述的，如果條件優(yōu)化較好，效率接近于1，內(nèi)標(biāo)相對(duì)于參照因子為：2.22-△CT’方法的應(yīng)用2-△CT，方法的一個(gè)應(yīng)用就是確定實(shí)驗(yàn)處理對(duì)某一候選內(nèi)標(biāo)基因的影響。為了顯示這一過(guò)程，我們做了血清饑餓/誘導(dǎo)實(shí)驗(yàn)(7)。血清饑餓/誘導(dǎo)是研究某些mRNA降解的常用方法(8)。然而，血清可能影響一些基因的表達(dá)包括標(biāo)準(zhǔn)的看家基因的表達(dá)。在24-h血清饑餓培養(yǎng)之后，在NIH3T3細(xì)胞中加入15%血清誘導(dǎo)基因表達(dá)。從細(xì)胞中提取Poly(A)+RNA，并將之反轉(zhuǎn)錄成cDNA。利用SYBRGreen通過(guò)實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)GAPDH，β2-microglobulincDNA的量。GAPDH和β2-microglobulin各自的相對(duì)量通過(guò)2-△CT‘公式求得。細(xì)胞處理對(duì)于GAPDH的基因表達(dá)有明顯影響，但對(duì)β2-microglobulin沒有什么影響。因此β2-microglobulin很適合做血清刺激定量實(shí)驗(yàn)的內(nèi)標(biāo)，而GAPDH并不適合。這一例子向大家展示了在只研究一個(gè)基因的時(shí)候怎么用2-△CT‘的方法分析基因相對(duì)表達(dá)數(shù)據(jù)。3.實(shí)時(shí)PCR數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)學(xué)分析實(shí)時(shí)PCR最終分析的是閾值循環(huán)或C。CT值通過(guò)PCR信號(hào)的對(duì)數(shù)值和循環(huán)數(shù)來(lái)確定。因此CT值是一個(gè)指數(shù)而非線性概念。因此，在任何統(tǒng)計(jì)分析中都不要用原始的CT值來(lái)表示結(jié)果。正如我們?cè)谇拔闹兴枋龅囊粯樱琍CR相對(duì)量通常和內(nèi)標(biāo)和參照樣本一起計(jì)算而很少直接用CT值來(lái)表示，除非我們想檢驗(yàn)重復(fù)樣本之間的差別。為了向大家顯示這一點(diǎn)，我們用SYBRGreen通過(guò)real-timePCR來(lái)檢測(cè)相同cDNA的96個(gè)重復(fù)反應(yīng)。所有反應(yīng)組分在同一管中混好后分裝到96個(gè)管中，做實(shí)時(shí)PCR分析，得到了每一個(gè)樣本的CT值。為了比較樣品間變化，計(jì)算了96個(gè)樣本的平均±SD，如果通過(guò)原始CT值計(jì)算，平均±SD是20.00±0.193，CV為0.971%。但是如果把原始Ct值用2-CT轉(zhuǎn)化成線性形式，平均±SD是9.08×10-7±1.33×10-7，CV為13.5％。從這個(gè)簡(jiǎn)單的例子我們可以看出，通過(guò)原始CT值來(lái)反映變化是錯(cuò)誤的，應(yīng)該避免。用2-CT將單個(gè)數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)化成線性形式來(lái)說(shuō)明重復(fù)樣本之間的變化和差異更準(zhǔn)確可靠。結(jié)論：實(shí)時(shí)定量PCR實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)和數(shù)據(jù)分析可以采用相對(duì)定量和絕對(duì)定量?jī)煞N方法，研究人員在設(shè)計(jì)實(shí)時(shí)定量PCR實(shí)驗(yàn)分析基因表達(dá)的時(shí)候首先要問的一個(gè)問題就是：數(shù)據(jù)最后會(huì)以一個(gè)什么樣的形式得到。如果需要知道絕對(duì)的拷貝數(shù)，就必須用絕對(duì)定量的方法，否則只需要給出基因表達(dá)相對(duì)量就足夠了。相對(duì)定量可能比絕對(duì)定量要更容易一些，因?yàn)樗恍枰鳂?biāo)準(zhǔn)曲線。本文所給出的公式對(duì)于每個(gè)用相對(duì)定量的方法分析基因表達(dá)差異的研究人員都足夠了。下面，我們總結(jié)一下實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)和評(píng)估中的一些重要步驟：?

選擇一個(gè)內(nèi)標(biāo)基因。?

確定內(nèi)標(biāo)的有效性，確保它不會(huì)受到實(shí)驗(yàn)處理的影響。?

通過(guò)PCR擴(kuò)增目標(biāo)基因和內(nèi)標(biāo)基因RNA或cDNA的一系列梯度稀釋模板確保它們的擴(kuò)增效率相同。最后通過(guò)2-△CT計(jì)算將統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)化成線性形式而不是原始CT值?；蝾l率和基因型頻率的計(jì)算基因頻率和基因型頻率的計(jì)算（一）。根據(jù)基因型或基因型頻率計(jì)算基因頻率：例1。從某個(gè)種群中隨機(jī)抽出１00個(gè)個(gè)體，測(cè)知基因型為AA，Aa和aa的個(gè)體分別是30、60和10個(gè)，求ａ的基因頻率。解析：可以通過(guò)基因型頻率計(jì)算基因頻率。一對(duì)等位基因中的一個(gè)基因的頻率：基因頻率(Ａ)=對(duì)應(yīng)純合子(AＡ）基因型頻率＋雜合子（Aａ）基因型頻率的1/２。１00個(gè)個(gè)體中ＡA為３0個(gè),Aa為６０個(gè)，ａa為10個(gè)，則AA這種基因型的頻率為30÷100=30％；同理，Aa為60％,aa為１0%,則A基因的基因頻率為30％+60％×1／２=60％,ａ基因的基因頻率為10％＋60％×1／2=４0％。答案:A基因的基因頻率為６0％，a基因的基因頻率為40％。變式訓(xùn)練1．已知人眼的褐色（A）對(duì)藍(lán)色（a)是顯性，屬常染色體上基因控制的遺傳。在一個(gè)300０0人的人群中，藍(lán)眼的有3６0０人，褐眼的有26400人,其中純合子有12000人，那么，這一人群中A和a基因的基因頻率分別為—-——--－－———-—--——－—-－—-——－——--—-（）Ａ．64%和36％B.3６%和64％C．５0%和５0％Ｄ．８2％和1８%（二）.在伴性遺傳中有關(guān)基因頻率的相關(guān)計(jì)算：﹡例２.若在果蠅種群中,XB的基因頻率為９0％，Xb的基因頻率為1０％，雌雄果蠅數(shù)相等，理論上ＸbXb、XｂY的基因型比例依次為--－－-——----—-——-－－-－——--－-－－-－-—---—-－--－——-()Ａ.1％、2％B.0。５％、５％C。１0％、10％D．5%、0．5%解析：由于在該果蠅種群中，雌雄果蠅數(shù)相等,所以雌果蠅產(chǎn)生的配子中，XB的基因頻率應(yīng)為9０％,Xｂ的基因頻率為10%。雄果蠅產(chǎn)生的配子中,有約1/2的含Y染色體的配子，另有約1/2的含X染色體的配子,在含Ｘ染色體的雄配子中，ＸＢ與Xb的基因頻率也分別為９0％和１0%。它們配子的結(jié)合情況可從下表中得出:雄配子雌配子Y（1/２)XＢ（1/2）×９０%Xb(１／2）×10%ＸB90％XBY45%XBXB4０．５％XBXb4．５％Xｂ10％XbY５％XBＸb4.5％XｂXｂ0．5％可見,理論上XBＹ基因型比例為45％，XbY的為5％，ＸBXb的為9%，XｂXb的為０.5％。答案：B。變式訓(xùn)練2．對(duì)某校學(xué)生進(jìn)行紅綠色盲遺傳病調(diào)查研究后發(fā)現(xiàn)：78０名女生中有患者23人，攜帶者52人，820名男生中有患者6５人,那么該群體中紅綠色盲基因的頻率是-—－--－()A。４。4％Ｂ。５.１％C.6.８%D。10．2％（三)．利用遺傳平衡定律求解基因頻率和基因型頻率1.對(duì)遺傳平衡的理解：遺傳平衡指在一個(gè)極大的隨機(jī)交配的種群中，在沒有突變發(fā)生,沒有自然選擇和遷移的條件下，種群的基因頻率和基因型頻率在一代一代的遺傳中可以世代保持不變。在遺傳平衡的種群中，某一基因位點(diǎn)上各種不同的基因頻率之和以及各種基因型頻率之和都等于是1。２．遺傳平衡定律公式的推導(dǎo)和應(yīng)用在一個(gè)遺傳平衡的自然種群中,一個(gè)位于常染色體上的顯性基因A的基因頻率為p,與其相對(duì)應(yīng)的隱性基因a的頻率為q,則該種群的后代中ＡA、Aａ、aａ的基因型頻率各是多少？三種基因型頻率之和為多少?分析：依題意，在一個(gè)遺傳平衡的自然種群中,顯性基因A的基因頻率與隱性基因a的基因頻率之和（p+q）應(yīng)等于1，其雌雄個(gè)體向后代傳遞基因A型配子的頻率為ｐ，與其相對(duì)應(yīng)的傳遞隱性基因ａ型配子的頻率為q,則可用下表表示各類配子的組合類型、子代基因型及其出現(xiàn)的概率:雄配子雌配子Ａ（p)a（q）A（p)ＡA（p２)Aa（pq）a（q）Aa（pｑ）Aa(q2）可以得出該種群后代中出現(xiàn)三種基因型AA、Aa、aa，并且三種基因型出現(xiàn)的頻率分別為ｐ2、2ｐｑ、q2，且它們的頻率之和為p2+２pｑ＋q2=(p+q)2=1。又因?yàn)樵摲N群是一個(gè)處于遺傳平衡的自然種群,所以其種群特征應(yīng)與此一致。這樣學(xué)生就很容易理解遺傳平衡定律了。例3．囊性纖維變性是一種常染色體遺傳病。據(jù)統(tǒng)計(jì)，在某歐洲人群中，每２500個(gè)人中就有一個(gè)患此病.現(xiàn)有一對(duì)健康的夫婦生了一個(gè)患有此病的孩子，此后,該婦女又與健康的男子再婚.則該再婚的雙親生一孩子患該病的概率是多少——-—－—--———－-－———－——--－(）A．1／2５B.１/５０Ｃ.1/100Ｄ．1/６25解析：由于雙親正常,卻生一病孩，可推知囊性纖維變性屬于常染色體隱性遺傳病,如把其控制基因記作a，則該婦女的基因型為Ａａ，這個(gè)婦女（Aa)與另一健康男子結(jié)婚,如若也生一病孩,則此健康男子必須是雜舍子（A)才有可能,所以解答本題的關(guān)鍵就在于求出該健康男子是雜合子的概率。根據(jù)題意，如果設(shè)基因ａ的頻率為ｑ，則有基因型aa的頻率=q×q=1／2500,可得q=1/50,基因A的頻率p=１一ｑ＝４9/５0.這樣雜合子Aa的基因型頻率=2pq＝２×49／５0×1／50≈１/25,又考慮到雙親均為雜合子時(shí)后代出現(xiàn)隱性純合子aa的可能性是1／4，由此可算出再生一孩患病的可能性為1／2５×１／4＝1／１0０.答案：C。變式訓(xùn)練3．已知苯丙酮尿癥是位于常染色體上的隱性遺傳病。據(jù)調(diào)查，該病的發(fā)病率大約為1/１00００，請(qǐng)問在人群中該丙苯酮尿癥隱性致病基因（ａ）的基因頻率以及攜帶此隱性基因的攜帶者（Aa)基因型頻率分別是-———－－-－—————--－－－－—－-—-——--—--—-－—--—--（）A．１％和0。９９%B．１%和１。98%C。1%和3。9６％D．1%和０。198%例4.玉米的黃粒(Ｒ)對(duì)白粒(r）是顯性。現(xiàn)將純合的黃色玉米和白色玉米交雜，得Ｆl全是黃色，F(xiàn)1的黃色玉米自交得F2。讓F２代的黃粒玉米之間隨機(jī)交配，則其子代F３中黃粒與白粒玉米的比為：Ａ．1:1B．2:1Ｃ．3：1D.8:１解析：解此題用基因頻率的方法計(jì)算就簡(jiǎn)單多了。在F2的黃粒玉米中，基因型RR占1／3，Rｒ占２／３,所以在群體中產(chǎn)生的雌配子基因型有二種即Ｒ和r，其中含基因R的配子比例為2/３，含基因ｒ的配子比例為1/3；雄配子中含基因R的配子比例為２／3，含基因ｒ的配子比例為1／３。由于F２代的黃粒玉米之間隨機(jī)交配，雌雄配子的結(jié)合是隨機(jī)的，可以用下表表示：黃粒F２的配子雌配子R（2／3)雌配子ｒ（1／3)雄配子R(2／3)RＲ（4／９)Rr（2／9）雄配子r（１/３）Rr(2/9）rr（1／9）從上表可得出子代F3的表現(xiàn)型及比例為:黃粒(ＲR，Ｒr)8／9,白粒（rr）1／9。答案：Ｄ。變式訓(xùn)練4.某豌豆基因型為Dd，讓其連續(xù)兩代自花授粉后，進(jìn)行人工隨機(jī)授粉，則隨機(jī)授粉后的子代中dd占的比例為-－---－-—－——-－－—－－—－－--———－-－—－———--————-—--——（)A.１/4B.1/9C．9/６4D.６／6４三．反饋訓(xùn)練:１.（２007年江蘇高考第15題）果蠅的體色由常染色體上一對(duì)等位基因控制，基因型BB、Bb為灰身,bb為黑身。若人為地組成一個(gè)群體，其中80％為BＢ的個(gè)體,20％為ｂb的個(gè)體，群體隨機(jī)交配,其子代中Ｂｂ的比例是A。２5％Ｂ.３2％C．50％D．64%2.如果在一個(gè)種群中，基因型AA的比例占25％，基因型Aa的比例占50％,基因型ａａ的比例占2５%。已知基因型aａ的個(gè)體失去求偶繁殖能力,則隨機(jī)交配一代后，子代中基因型aａ的個(gè)體所占的比例為－—－—-－———－—-－－-———－-－——-—--—--—－----———-－-－－－-—-——－-－－（）A。1/16Ｂ.1/8C．１／9D．３。假設(shè)某中心血防站調(diào)查了1７８8個(gè)MN血型血樣本，其中397人是M型（LMLM）,86１人是MN型(ＬMＬＮ),５30人是N（ＬＮＬＮ）型，則LＭ和LN的基因頻率分別是—--－————---－－()A．43．７%、56．3%B.56．3％、43。7%C。５3。7％、46。3%D．４6。3％、53.7％4.（２007年廣東高考第2０題）某常染色體隱性遺傳病在人群中的發(fā)病率為１%，色盲在男性中的發(fā)病率為７％?，F(xiàn)有一對(duì)表現(xiàn)正常的夫婦,妻子為該常染色體遺傳病致病基因和色盲致病基因攜帶者。那么他們所生小孩同時(shí)患上述兩種遺傳病的概率是A。1/88B。１/22C5．經(jīng)調(diào)查統(tǒng)計(jì)某地區(qū)人群中藍(lán)眼(aａ）1600人，純合褐眼（ＡA)1４０0人,雜合褐眼（Aａ）7000人,那么該地區(qū)人群中藍(lán)眼基因和褐眼基因的基因頻率分別是-—－———－--－———－—-－－(）Ａ。51％和49％??B．４３％和5７％C．32％和68％? ?D.２8%和７2%6.(2００7年唐山二模)某植物種群,ＡA基因型個(gè)體占30%，aa基因型個(gè)體占20％，則:(1）植物的A、a基因頻率分別是、。（２）若該植物自交,后代中AA、ａa基因型個(gè)體分別占、。這時(shí)，A、a的基因頻率分別是。(3）依據(jù)現(xiàn)代生物進(jìn)化理論，這種植物在兩年中是否發(fā)生了進(jìn)化？,原因是。（4）由此可知，生物進(jìn)化的基本單位是,進(jìn)化的原材料由提供，是否發(fā)生進(jìn)化決定于，進(jìn)化的實(shí)質(zhì)是。參考答案:變式訓(xùn)練:１.A２．C3.B4．A反饋訓(xùn)練：１。Ｂ2。C３。D4．A5.A6．（1）５5%、45%（2）42.5%32.5%５5％、45％（３)沒有發(fā)生進(jìn)化基因頻率沒有發(fā)生改變（4）種群突變和基因重組自然選擇種群基因頻率的改變作者簡(jiǎn)介：左延柏,男，中學(xué)高級(jí)教師,中國(guó)教育工作者協(xié)會(huì)會(huì)員，江蘇省南京市高三生物教學(xué)研究核心小組成員.地址：江蘇省南京市大橋南路16號(hào)郵編：２１０015電話：Emａｉl：zｙb210０15＠16３。coｍ?施工作業(yè)指導(dǎo)書? 差異化分析表施工作業(yè)指導(dǎo)書名稱《一般土石方工程作業(yè)指導(dǎo)書》施工作業(yè)指導(dǎo)書編號(hào)TSFGC-01具體內(nèi)容:適用范圍:一般土石方工程作業(yè)指導(dǎo)書滿足要求.編寫依據(jù):一般土石方工程作業(yè)指導(dǎo)書滿足要求.作業(yè)流程圖:一般土石方工程作業(yè)指導(dǎo)書滿足要求.安全風(fēng)險(xiǎn)辨析與預(yù)控:表4.1作業(yè)任務(wù)安全基準(zhǔn)風(fēng)險(xiǎn)指南中的第12、13、16項(xiàng)與現(xiàn)場(chǎng)實(shí)際不符，本工程不需要風(fēng)鎬機(jī)，基坑內(nèi)無(wú)巖石，以及沒有用到打夯機(jī)夯實(shí)。作業(yè)準(zhǔn)備：作業(yè)前施工條件以及人員、主要工具器和儀器儀表配置均與作業(yè)指導(dǎo)書所列相符。作業(yè)方法：一般土石方工程作業(yè)指導(dǎo)書滿足施工要求。質(zhì)量控制措施及檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn):一般土石方工程作業(yè)指導(dǎo)書滿足要求.?施工作業(yè)指導(dǎo)書? 差異化分析表施工作業(yè)指導(dǎo)書名稱《電纜管道作業(yè)指導(dǎo)書》施工作業(yè)指導(dǎo)書編號(hào)DLTJ-02具體內(nèi)容:適用范圍:作業(yè)指導(dǎo)書滿足施工要求.編寫依據(jù):作業(yè)指導(dǎo)書滿足施工要求.作業(yè)流程圖:作業(yè)指導(dǎo)書滿足施工要求.安全風(fēng)險(xiǎn)辨析與預(yù)控:表4.1作業(yè)任務(wù)安全基準(zhǔn)風(fēng)險(xiǎn)指南中的第10、17項(xiàng)與現(xiàn)場(chǎng)實(shí)際不符，本工程不需要風(fēng)鎬機(jī)，起重作業(yè)沒有用到起重機(jī)。作業(yè)準(zhǔn)備：作業(yè)前施工條件以及人員、主要工具器和儀器儀表配置均與作業(yè)指導(dǎo)書所列相符。作業(yè)方法：本工程作業(yè)方法與作業(yè)指導(dǎo)書中的作業(yè)方法第7項(xiàng)不符，工程沒有采用支撐墩的作業(yè)方法，其他項(xiàng)作業(yè)方法與書中所列一致。質(zhì)量控制措施及檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn):作業(yè)指導(dǎo)書滿足施工要求.?施工作業(yè)指導(dǎo)書? 差異化分析表施工作業(yè)指導(dǎo)書名稱《電纜井作業(yè)指導(dǎo)書》施工作業(yè)指導(dǎo)書編號(hào)DLTJ-03具體內(nèi)容:適用范圍:作業(yè)指導(dǎo)書滿足施工要求.編寫依據(jù):作業(yè)指導(dǎo)書滿足施工要求.作業(yè)流程圖:作業(yè)指導(dǎo)書滿足施工要求.安全風(fēng)險(xiǎn)辨析與預(yù)控:表4.1作業(yè)任務(wù)安全基準(zhǔn)風(fēng)險(xiǎn)指南中的第17、20項(xiàng)與現(xiàn)場(chǎng)實(shí)際不符，本工程不需要用到砂漿攪拌機(jī)以及打夯機(jī)。作業(yè)準(zhǔn)備：作業(yè)前施工條件以及人員、主要工具器和儀器儀表配置均與作業(yè)指導(dǎo)書所列相符。作業(yè)方法：本工程作業(yè)方法與作業(yè)指導(dǎo)書中的作業(yè)方法第7項(xiàng)不符，工程沒有采用圈梁混凝土澆筑的作業(yè)方法，其他項(xiàng)作業(yè)方法與書中所列一致。質(zhì)量控制措施及檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn):作業(yè)指導(dǎo)書滿足施工要求.?施工作業(yè)指導(dǎo)書? 差異化分析表施工作業(yè)指導(dǎo)書名稱《電纜支架作業(yè)指導(dǎo)書》施工作業(yè)指導(dǎo)書編號(hào)PWDK-01具體內(nèi)容:適用范圍:作業(yè)指導(dǎo)書滿足施工要求.編寫依據(jù):作業(yè)指導(dǎo)書滿足施工要求.作業(yè)流程圖:作業(yè)指導(dǎo)書滿足施工要求.安全風(fēng)險(xiǎn)辨析與預(yù)控:表4.1作業(yè)任務(wù)安全基準(zhǔn)風(fēng)險(xiǎn)指南中的第2、3、5項(xiàng)與現(xiàn)場(chǎng)實(shí)際不符，本工程為室內(nèi)電纜溝支架安裝。作業(yè)準(zhǔn)備：作業(yè)前施工條件以及人員、主要工具器和儀器儀表配置均與作業(yè)指導(dǎo)書所列相符。作業(yè)方法：作業(yè)指導(dǎo)書滿足施工要求。質(zhì)量控制措施及檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn):作業(yè)指導(dǎo)書滿足施工要求.?施工作業(yè)指導(dǎo)書? 差異化分析表施工作業(yè)指導(dǎo)書名稱《電纜敷設(shè)作業(yè)指導(dǎo)書》施工作業(yè)指導(dǎo)書編號(hào)DLFS-01具體內(nèi)容:適用范圍:作業(yè)指導(dǎo)書滿足施工要求.編寫依據(jù):作業(yè)指導(dǎo)書滿足施工要求.作業(yè)流程圖:作業(yè)指導(dǎo)書滿足施工要求.安全風(fēng)險(xiǎn)辨析與預(yù)控:作業(yè)指導(dǎo)書滿足施工要求。作業(yè)準(zhǔn)備：施工現(xiàn)場(chǎng)與作業(yè)指導(dǎo)書中的表5.1中第6項(xiàng)所提電纜橋架內(nèi)容不適用，表5.2中第3項(xiàng)施工船、牽引機(jī)、埋設(shè)機(jī)、高壓水泵等不適用，其他內(nèi)容均相符。作業(yè)方法：作業(yè)指導(dǎo)書滿足施工要求。質(zhì)量控制措施及檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn):作業(yè)指導(dǎo)書滿足施工要求.?施工作業(yè)指導(dǎo)書? 差異化分析表施工作業(yè)指導(dǎo)書名稱《電力電纜試驗(yàn)作業(yè)指導(dǎo)書》施工作業(yè)指導(dǎo)書編號(hào)DQSY-07具體內(nèi)容:適用范圍:作業(yè)指導(dǎo)書滿足施工要求.編寫依據(jù):作業(yè)指導(dǎo)書滿足施工要求.作業(yè)流程圖:作業(yè)指導(dǎo)書滿足施工要求.安全風(fēng)險(xiǎn)辨析與預(yù)控:作業(yè)指導(dǎo)書滿足施工要求。作業(yè)準(zhǔn)備：作業(yè)指導(dǎo)書滿足施工要求。作業(yè)方法：作業(yè)指導(dǎo)書滿足施工要求。質(zhì)量控制措施及檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn):作業(yè)指導(dǎo)書滿足施工要求.?施工作業(yè)指導(dǎo)書? 差異化分析表施工作業(yè)指導(dǎo)書名稱《冷縮電纜中間接頭制作安裝作業(yè)指導(dǎo)書》施工作業(yè)指導(dǎo)書編號(hào)DLFJAZ-03具體內(nèi)容:適用范圍:作業(yè)指導(dǎo)書滿足施工要求.編寫依據(jù):作業(yè)指導(dǎo)書滿足施工要求.作業(yè)流程圖:作業(yè)指導(dǎo)書滿足施工要求.安全風(fēng)險(xiǎn)辨析與預(yù)控:現(xiàn)場(chǎng)實(shí)際與表4.1中第6、7項(xiàng)不符，本工程沒有隧道。作業(yè)準(zhǔn)備：作業(yè)指導(dǎo)書滿足施工要求。作業(yè)方法：作業(yè)指導(dǎo)書滿足施工要求。質(zhì)量控制措施及檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn):作業(yè)指導(dǎo)書滿足施工要求.?施工作業(yè)指導(dǎo)書? 差異化分析表施工作業(yè)指導(dǎo)書名稱《冷縮電纜終端接頭制作安裝作業(yè)指導(dǎo)書》施工作業(yè)指導(dǎo)書編號(hào)DLFJAZ-01具體內(nèi)容:適用范圍:作業(yè)指導(dǎo)書滿足施工要求.編寫依據(jù):作業(yè)指導(dǎo)書滿足施工要求.作業(yè)流程圖:作業(yè)指導(dǎo)書滿足施工要求.安全風(fēng)險(xiǎn)辨析與預(yù)控:作業(yè)指導(dǎo)書滿足施工要求。作業(yè)準(zhǔn)備：作業(yè)指導(dǎo)書滿足施工要求。作業(yè)方法：作業(yè)指導(dǎo)書滿足施工要求。質(zhì)量控制措施及檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn):作業(yè)指導(dǎo)書滿足施工要求.?施工作業(yè)指導(dǎo)書? 差異化分析表施工作業(yè)指導(dǎo)書名稱《電纜防火封堵作業(yè)指導(dǎo)書》施工作業(yè)指導(dǎo)書編號(hào)DLFHFD-01具體內(nèi)容:適用范圍:作業(yè)指導(dǎo)書滿足施工要求.編寫依據(jù):作業(yè)指導(dǎo)書滿足施工要求.作業(yè)流程圖:作業(yè)指導(dǎo)書滿足施工要求.安全風(fēng)險(xiǎn)辨析與預(yù)控:施工現(xiàn)場(chǎng)與表4.1中第1、2項(xiàng)不符，本工程沒有隧道。作業(yè)準(zhǔn)備：作業(yè)指導(dǎo)書滿足施工要求。作業(yè)方法：作業(yè)指導(dǎo)書滿足施工要求。質(zhì)量控制措施及檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn):作業(yè)指導(dǎo)書滿足施工要求.?施工作業(yè)指導(dǎo)書? 差異化分析表施工作業(yè)指導(dǎo)書名稱《電纜終端頭接地及保護(hù)管安裝作業(yè)指導(dǎo)書》施工作業(yè)指導(dǎo)書編號(hào)DLFJAZ-05具體內(nèi)容:適用范圍:作業(yè)指導(dǎo)書滿足施工要求.編寫依據(jù):作業(yè)指導(dǎo)書滿足施工要求.作業(yè)流程圖:作業(yè)指導(dǎo)書滿足施工要求.安全風(fēng)險(xiǎn)辨析與預(yù)控:作業(yè)指導(dǎo)書滿足施工要求。作業(yè)準(zhǔn)備：作業(yè)指導(dǎo)書滿足施工要求。作業(yè)方法：作業(yè)指導(dǎo)書滿足施工要求。質(zhì)量控制措施及檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn):作業(yè)指導(dǎo)書滿足施工要求.?施工作業(yè)指導(dǎo)書? 差異化分析表施工作業(yè)指導(dǎo)書名稱《戶外隔離開關(guān)安裝作業(yè)指導(dǎo)書》施工作業(yè)指導(dǎo)書編號(hào)HWDQSB-02具體內(nèi)容:適用范圍:作業(yè)指導(dǎo)書滿足施工要求.編寫依據(jù):作業(yè)指導(dǎo)書滿足施工要求.作業(yè)流程圖:作業(yè)指導(dǎo)書滿足施工要求.安全風(fēng)險(xiǎn)辨析與預(yù)控:作業(yè)指導(dǎo)書滿足施工要求。作業(yè)準(zhǔn)備：作業(yè)指導(dǎo)書滿足施工要求。作業(yè)方法：作業(yè)指導(dǎo)書滿足施工要求。質(zhì)量控制措施及檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn):作業(yè)指導(dǎo)書滿足施工要求.?施工作業(yè)指導(dǎo)書? 差異化分析表施工作業(yè)指導(dǎo)書名稱《接地工程作業(yè)指導(dǎo)書》施工作業(yè)指導(dǎo)書編號(hào)JDGC-01具體內(nèi)容:適用范圍:作業(yè)指導(dǎo)書滿足施工要求.編寫依據(jù):作業(yè)指導(dǎo)書滿足施工要求.作業(yè)流程圖:作業(yè)指導(dǎo)書