實(shí)驗(yàn)室reading食品生物技術(shù)

本研究為國(guó)家農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系建設(shè)專項(xiàng)項(xiàng)目（nycytx-30-zy-05）和高?；究蒲袠I(yè)務(wù)費(fèi)專項(xiàng)項(xiàng)目（2012RC019和摘葡萄（VitisL.）霜霉?。╠ownymildew，DM）由葡萄霜霉菌（smoparaviticola(Berk.andCurt.)Berl.anddeToni，PV）引起，是危害葡萄生產(chǎn)的重要病害之一。本 現(xiàn)，霜霉菌侵染后，圓葉葡萄葉片上未發(fā)現(xiàn)任何霜霉病發(fā)病癥狀，而歐亞種葡萄和野生種葡萄（變?nèi)~葡萄和刺葡萄）發(fā)病非常嚴(yán)重。其它的8個(gè)中國(guó)野生種葡萄則出現(xiàn)中等到極輕度的霜霉病顯微觀察結(jié)果，本實(shí)驗(yàn)中研究的葡萄品種/株系分為5個(gè)抗性等級(jí)：（i）免疫；（ii）高抗；（iii）中抗；（iv）低抗；和（v）感病通過(guò)搜索，在‘黑比諾’組上找到8個(gè)葡萄胼胝質(zhì)合成酶（callosesynthase，CalS）基因。實(shí)時(shí)定量研究發(fā)現(xiàn)，其中兩個(gè)，CalS1和CalS10，在兩個(gè)圓葉葡萄‘Noble’和‘Carlos’表達(dá)量無(wú)顯著變化。在兩個(gè)免疫圓葉葡萄品種中，CalS7和CalS9受霜霉菌誘導(dǎo)后表達(dá)趨勢(shì)變化有所不同，CalS7在圓葉葡萄‘Carlos’中表現(xiàn)為先上調(diào)再下調(diào)表達(dá)而在‘Noble’中表后的不同時(shí)間點(diǎn)也呈上調(diào)表達(dá)。CalS9在免疫圓葉葡萄‘Carlos’中下調(diào)表達(dá)而在‘Noble’中表達(dá)量顯著升高，且在除了圓葉葡萄外的其它葡萄品種中的表達(dá)量變化均在2倍以內(nèi)。CalS3、通過(guò)瞬時(shí)侵染葡萄葉片實(shí)驗(yàn)研究不同抗性葡萄品種中CalS1和CalS10的啟動(dòng)子活性。圓葉葡萄‘Noble’的CalS1啟動(dòng)子受ABA誘導(dǎo)上調(diào)但不受霜霉菌和GA誘導(dǎo)，歐亞種葡萄‘霞多麗’種葡萄‘霞多麗’的CalS10啟動(dòng)子上都具有菌誘導(dǎo)作用元件，但二者的啟動(dòng)子活性均不受霜霉菌 /susceptibilityofgrapevinestodownymildew(DM)causedbysmoparaviticola(PV)werecomparedamongdifferentcultivars/accessionsbelongingtoVitisvinifera,V.rotundifoliaandtenorientalVitisspecies.AfterinoculationwithPVpathogen,nosymptomwasfoundinV.rotundifoliagrapevines.LikeV.vinifera,theorientalgrapespeciesV.davidiiandV.piasezkii,weresusceptibletoDMdisease,whiletheothereightorientalVitisspeciesshowedvariouslevelsof Intra-specificvariationsofDMwerealsoobservedamongthecultivars/clonesinvestigatedinV.amurensis.MicroscopeswereusedtostudythehostresponsestoPVinoculationongrapeleaves.NoP.viticolahyphawasobservedinV.rotundifoliacultivars,whilesymptomswithvariabledegreesofseveritywereobservedamongtheEuvitisspecies.Ingeneral,theDMresistantorientalspeciesshowedaslowerdevelopmentofhyphaandlessformationofhaustoriathanDMsusceptibleV.viniferagrapevines.MesophyllcellswithdistinctiveflourescencewereobservedinV.rotundifoliaandtheorientalspeciesV.pseudoreticulata,andcallosedepositswereobservedinV.rotundifolia,V.pseudoreticulata,andV.amurensisgrapevines.Basedontheresultsofmorphologicalobservationsandmicroscopystudies,weconcludedthattherewerefivelevelsofgrapevinetoP.viticolapathogen:(i)immune;(ii)extremelyresistant;(iii)resistant;(iv)partlyresistant;and(v)susceptible.Eightgrapevinecallosesythase(CalS)geneswereselectedforgeneexpressionysisusingtherealtimePCRtechnology.AfterP.viticolainfection，CalS1andCalS10wereup-regulatedintwoV.rotundifoliacultivars‘Carlos’and‘Noble’andtheresistantV.amurensis‘Shuanghong’,whiletheirexpressionlevelswerenotchangedinV.vinifera‘Chardonnay’.GenesCalS7andCalS9showeddifferentregulatoryexpressionlevelsamongthegrapesstudied.CalS7wasup-regulatedinV.rotundifolia‘Carlos’anddown-regulatedin‘Noble’.Thisgenewasalsoup-regulatedinpartiallyresistantV.amurensis‘Zuoshanyi’andsusceptibleV.vinifera‘Chardonnay’atvarioustimepointsafterinfection.Incontrast,CalS9wasdown-regulatedinV.rotundifolia‘Carlos’andup-regulatedin‘Noble’,anditsexpressiondifferenceswerewithintwofoldsinothergrapescultivars/linesbeforeandafterPVinfections.Other3genes,CalS3,CalS8andCalS11,wereeithernochangedorslightlydown-regulatedafterP.viticolainfectioninthetwoV.rotundifoliacultivarsandtheresistantV.amurensis‘Shuanghong’,whiletheywereup-regulatedinthepartiallyresistantV.amurensis‘Zuoshanyi’,DMsusceptibleVA-VVhybrid‘Zuoyouhong’andV.vinifera‘Chardonnay’.TheexpressionofCalS5genewastoolowtobedetected.ThepromoteractivitiesofCalS1andCalS10werestudiedbytransientinfection/expressionexperiment.TheCalS1promoterwasup-regulatedbyABAinV.rotundifolia‘Noble’,anditwasdown-regulatedbyABAandGAinV.vinifera.TheactivityofCalS10promoterwasnotregulatedbyP.viticolaneitherinV.rotundifoliaorinV.vinifera,althoughthepathogenresponseelementexistedintheCalS10promoterofbothgrapes.:smoparaviticola,fluorescenceandelectronicmicroscopicobservations,callose,callosesynthasegenes,real-timePCR,transientexpression英文縮 英文名 中文名 4-甲基傘型 abscisicacid Callose downy 霜霉 daypost gibberellic 赤霉 卡那 smopara X- Acid,Cyclohexylammonium

摘 縮略語(yǔ)及中英文對(duì) 第一章文獻(xiàn)綜 葡萄霜霉 葡萄霜霉 胼胝質(zhì)合成 立論依 第二章不同葡萄品種對(duì)霜霉病抗性鑒 材料與方 實(shí)驗(yàn)材 實(shí)驗(yàn)儀器與設(shè) 霜霉菌侵染過(guò) 結(jié)果統(tǒng)計(jì)分 實(shí)驗(yàn)結(jié) 討 第三章霜霉菌侵染葡萄葉片的顯微觀 材料與方 實(shí)驗(yàn)材 實(shí)驗(yàn)儀器與設(shè) 實(shí)驗(yàn)試 霜霉菌侵染與取 統(tǒng)計(jì)分 實(shí)驗(yàn)結(jié) 討 第四章葡萄CALS及其表達(dá)譜研 材料與方 實(shí)驗(yàn)材 實(shí)驗(yàn)儀器與設(shè) 實(shí)驗(yàn)試 CTAB法提取葡萄 cDNA合 葡萄及其它植物CalS查 實(shí)時(shí)熒光定量PCR（Real-TimePCR）分 統(tǒng)計(jì)分 實(shí)驗(yàn)結(jié) 葡萄CalS序列的查找與分 葡萄CalS編碼的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)分 討 第五章葡萄CALS1和CALS10啟動(dòng)子克隆及活性分 材料與方 實(shí)驗(yàn)材 實(shí)驗(yàn)儀器與設(shè) 實(shí)驗(yàn)試 葡萄葉片DNA提取與純 葡萄CalS1和CalS10啟動(dòng)子序列的獲 回收片段的克隆........................................................................................瞬時(shí)表達(dá)載體構(gòu) 葡萄瞬時(shí)轉(zhuǎn)化葉片GUS活性檢 實(shí)驗(yàn)結(jié) 葡萄CalS1和CalS10啟動(dòng)子序列克隆與分 葡萄CalS1和CalS10啟動(dòng)子瞬時(shí)表達(dá)分 討 本文結(jié) 參考文 致 作者簡(jiǎn) 葡萄霜霉45.13715.15一（晁無(wú)疾，2009）。因此葡萄的栽培和管理越來(lái)越受重視。葡萄的生長(zhǎng)常多種病害危害，3010（賀普超，1999）。這些病害會(huì)嚴(yán)重影響葡萄果實(shí)產(chǎn)量和品質(zhì)。如果葡萄在生長(zhǎng)季節(jié)早期發(fā)病，在沒(méi)有噴施殺真菌劑防治的情況下，會(huì)造成50-75%的產(chǎn)量損失（McRche，1978）。1970年代早期，隨抗根瘤蚜的美洲砧木傳入歐洲，（McRitchie，1978）。1882年傳遍法國(guó)1885年到整個(gè)歐洲大陸。伴隨著歐洲種葡萄向全球引種栽培，霜霉病幾乎遍及各大洲的葡產(chǎn)區(qū)。我國(guó)最早在1899年記載了葡萄霜霉病的發(fā)生（雷百戰(zhàn)等，2004），而在20世紀(jì)80年代葡萄霜霉病一般發(fā)生在5、689早落、早衰，從而影響樹(shù)勢(shì)和植株的營(yíng)養(yǎng)儲(chǔ)藏。此外，霜霉菌還可以侵染新梢、花序、果實(shí)等，造成新梢、卷須、花序的生長(zhǎng)停滯、、枯死，果粒變褐、脫落等，最終導(dǎo)致葡萄品質(zhì)和產(chǎn)量的大幅度下降（王忠躍，2009）葡萄霜霉菌（smoparaviticola(Berk.andCurt.)Berl.anddeToni）屬于鞭毛菌亞門，卵菌綱，（劉延琳，1996。葡萄霜霉菌的侵染循環(huán)包括有性繁殖和無(wú)性繁殖兩個(gè)階段。在冬季，卵孢子隨病葉或其他的病殘組織在土壤中越冬，這是病害的初侵染源（Buruano，2000810蔓延，并形成4-10微米瘤狀吸器從寄主細(xì)胞內(nèi)吸取營(yíng)養(yǎng)。這個(gè)侵染過(guò)程稱為初次侵完成后，經(jīng)過(guò)平均5-10天的潛育期產(chǎn)生初次病斑。在初次病斑的氣孔處會(huì)伸出多個(gè)多核的孢子的成熟孢子囊（Burruano，2000）。這些成孢子囊能夠通過(guò)水或風(fēng)的作用，到達(dá)其他健部，二次侵染（Gobbin，2004）。二次侵染的過(guò)程完成了葡萄霜霉菌的無(wú)性繁殖（圖1-1）。1-1葡萄霜霉菌生活史Fig.1-1Thelifecycleofsmoparaviticola(Gobbin,2255100518度2001）19100在2003年之前，國(guó)內(nèi)外的研究大都是對(duì)霜霉病預(yù)測(cè)模型和技術(shù)的研究，對(duì)霜霉菌卵孢子萌發(fā)治主要采用噴施化學(xué)殺菌劑的方法，而有機(jī)葡萄園主要依賴于噴施波爾多液。rotundifolia夏葡萄（V.aestivalis）、沙地葡萄（V.rupestris）、森林葡萄（V.silvestris）；抗性強(qiáng)的有美洲（1986通過(guò)野生葡萄種和變種進(jìn)行霜霉病抗性的研究，發(fā)現(xiàn)不同葡萄種和變種之間對(duì)霜霉病的抗性異很大，并且中國(guó)生葡萄是良好的抗性資源王國(guó)英（1987及和晁無(wú)疾（1984）研究認(rèn)為：原產(chǎn)我國(guó)的野生葡萄中，華東葡萄（.pseudorecuata）、瘤枝葡萄（davdiivar.cyanocarpa）對(duì)霜霉病抗性較強(qiáng)；華北葡萄（.dryonifolia）、復(fù)葉葡萄（piasezkii）、秋葡萄（.romanet）、菱狀葉葡萄（V.hancock）、葛藟葡萄（.flexuosa）和燕山葡萄（.yeshanenss）抗性中等；而刺葡萄（.davdii）、樺葉葡萄（.beuoa）、毛葡萄（V.quinquangularis）、網(wǎng)脈葡萄（V.wilsonae）等易感霜霉病。而Wan等（2007）研究發(fā)現(xiàn)，瘤枝葡萄、華東葡萄和燕山葡萄對(duì)霜霉病有一定抗性，而蘡薁葡萄（V.adstricta）和菱狀葉葡萄則易感霜霉病。關(guān)于山葡萄（V.amurensis）對(duì)霜霉病的抗性存在一定爭(zhēng)議。王國(guó)英（1987）及（1984）（1998山葡萄種不抗霜霉病，但品系間感病程度差異較大。霜霉菌侵染葡萄葉片組織學(xué)一般認(rèn)為，葡萄霜霉病菌只能在葡萄上正常生長(zhǎng)。Keer等（2002）分別在葡萄葉片上和水中培養(yǎng)葡萄霜霉菌，通過(guò)比較發(fā)現(xiàn)霜霉侵染葡萄葉片40分鐘后開(kāi)始出現(xiàn)游動(dòng)孢子，90分鐘后游動(dòng)孢子量達(dá)到最大。而在水中培養(yǎng)時(shí)，霜霉菌游動(dòng)孢子出現(xiàn)時(shí)間要拖后12小時(shí)，且菌不會(huì)再有進(jìn)一步的生長(zhǎng)。DezNavaas等（2008）研究發(fā)現(xiàn)，葡萄霜霉菌在甜菜（.vugars）、萵苣（.sava.cv.Baava）和辣椒（Capscumsp.）葉片表面也能形成帶有芽管的游動(dòng)孢子并到達(dá)氣孔3天到5（.vneracv.MuscatOone處葡萄霜霉菌孢子囊為橢圓或梨形，包含4-8個(gè)細(xì)胞核(Riemann等，2002)。在適當(dāng)?shù)臏囟群蜐馎BA誘導(dǎo)氣孔關(guān)閉后，能夠抑制游動(dòng)孢子在氣孔處的，表明游動(dòng)孢子的行為受某種由氣處（substomatalvesica），隨后形成有吸器的初生菌絲。這一過(guò)程在霜霉菌侵染宿主后的幾個(gè)小時(shí)內(nèi)就能完成，而在接下來(lái)的10-18個(gè)小時(shí)內(nèi)，沒(méi)有觀察到菌絲的進(jìn)一步生長(zhǎng)。在侵染1-1.5天后，霜霉菌絲會(huì)繼續(xù)在宿主細(xì)胞間生長(zhǎng)、分枝，而侵染35天后，宿主細(xì)胞間隙會(huì)被菌絲和游動(dòng)孢子填滿（Unger等，2007）。然而在抗病葡萄品種中，霜霉菌絲則不能如此輕易地占據(jù)寄主細(xì)胞間隙。Unger等（2007）發(fā)現(xiàn)，在抗霜霉病葡萄和感病葡萄中，葡萄霜霉菌絲形成吸器的過(guò)程有所（i2010Jrges等（2009）對(duì)來(lái)源于歐洲（MüllerThurgau、Merzling和sylvestris）、美洲（河岸葡萄、加州萄和沙地葡萄）（的不同抗性的葡萄品種進(jìn)行研究發(fā)現(xiàn)，在和西伯利亞葡萄品種的葉片上霜霉菌絲的生長(zhǎng)受到抑制（圖1-2A但葡萄霜霉菌絲能夠成功歐亞種葡萄的葉肉細(xì)胞間隙（圖12B。最為特殊的是在某些亞洲葡萄葉片上，霜霉菌游動(dòng)孢子不在氣孔周圍，而是在葉片表面形成大量不正常的菌絲（圖1-2C）。結(jié)合葡萄品種的來(lái)源和霜霉菌生長(zhǎng)的狀況，Jürges等（2009）還發(fā)現(xiàn)歐亞種葡萄易感AABC1-2霜霉菌侵72h后葡萄葉片苯胺藍(lán)染色觀察A：霜霉菌生長(zhǎng)被抑制；B：霜霉菌成功侵染；C：菌絲異常生長(zhǎng)（G.Jürges等,Fig.1-2ObservationofgrapevineleavesinfectedbyP.viticolaat72hpi.A.thedevelopmentofP.viticolawasB.successfulinfectionofP.viticola;C.abnormalgrowthofP.viticolahyphae(G.Jürgesetal.,（1984（ee，1983；Assann，1993）（1988）（Meoo等，2008。Allge等（2009）葡ABAndo（2003葡萄抗霜霉病機(jī)理研目前，對(duì)于葡萄抗病的機(jī)理也已經(jīng)有了一定的研究（Fung等，2008；Gordard等，2009；Hamiduzzaman等，2009）。病菌的能夠植物體的一系列防御反應(yīng)，包括植物抗毒素的 等，2006）。在營(yíng)養(yǎng)寄生菌與植物互作的過(guò)程中，超敏性細(xì)胞（hypersensitivecelldeath）發(fā)進(jìn)一步的防御反應(yīng)及一些植物的系統(tǒng)獲得性抗（Greenberg和Yao，2004）Feechan等（2011） ）和抗病響應(yīng)相關(guān)的程序性細(xì)胞programmedcell當(dāng)病原菌突破植物的物理防御，進(jìn)入植物體內(nèi)后，植物體內(nèi)復(fù)雜的抗病信號(hào)傳導(dǎo)通路。這個(gè)復(fù)雜的通路是如何開(kāi)始的，又是如何進(jìn)行防御的，這一直是科學(xué)家們研究的重點(diǎn)?？共∠嚓P(guān)的信號(hào)傳導(dǎo)是植物抗病防御的重要通路。這一過(guò)程包括了第二信使的細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)（如Ca2+NO濃度變化、蛋白激酶活性調(diào)節(jié)等、激素號(hào)傳導(dǎo)及號(hào)下游用控等。三植物激素——水楊酸（SA、茉莉酸（JA）和乙烯（ET，在植物抗病信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過(guò)程中起到非常重要的作用。Thoa等（1998）研究表明，A在防御寄生病原菌過(guò)程中起重要作用，是植系獲（ARJA和T（IR）（Peese等,1996an2002存在的，而是彼此之間或共同作用，或拮抗作用，交叉成為一個(gè)復(fù)雜的網(wǎng)絡(luò)。一般認(rèn)為，A和JA/T防御通路間是相互拮抗的(azebook，2005；oenzo和Soano，2005；Roo等，2003；vanLoon等，2006。應(yīng)環(huán)境脅迫過(guò)程中都起到非常重要的作用之外，ABA還參與了植物防御病原菌的過(guò)程：ABA不等，2002），還能夠與SA、JAET等多條信號(hào)通路相聯(lián)系（Adie2007；Yang等，2005）。胼胝質(zhì)（callose）和胼胝質(zhì)合成酶（callose胼胝質(zhì)積累與植等（2003）兩個(gè)歐亞種葡萄研究發(fā)現(xiàn)，抗病葡萄品種Soas能夠在氣孔處積累胼胝質(zhì)，通過(guò)包裹霜霉菌菌絲或阻塞霜霉菌的道路達(dá)到抵御霜霉菌侵染的目的，而在感病葡萄品種Chasselas上則未觀察到胼胝質(zhì)的積累。Donofo和Deane（2001）表1-1近期在擬南芥中以PAMP的胼胝質(zhì)積累作為研究PTI活性標(biāo)記的文章（Luna等,2011）Table1-1RecentpublicationsthathaveusedPAMP-inducedcallosedepositioninArabidopsisasamarkerforPTIactivity(Lunaetal.,2011).注：PAMP=pathogen-associatedmolecularpattern;PTI=PAMP-triggeredimmunity;PRR=pathogenrecognitionreceptors;ER=endosmicPAMPsaonoadocaraeBwn等，1998；Goez-Goez等，1999）。近來(lái)，在擬南芥子葉和葉片中由PAMP或DAMP引起的胼胝質(zhì)積累成為了研究調(diào)控TI（AMPrggeedmuniy，PAMs的免疫反應(yīng)）信號(hào)通路以及病原菌因子對(duì)信號(hào)通路抑制作用的重要標(biāo)記（表1-1菌質(zhì)廣積累來(lái)御病菌的第二次（Kohe2002。外，誘的學(xué)質(zhì)次代謝物的變化也能引胼胝質(zhì)的積累，楊酸類似benzo(1,2,3)thadazoe7cabothoicacS-methylester（Kohler等，2002）、非蛋白氨基酸β-aminobutyricacid（BABA)（Ton和Mauch-Mani（Clay2009Mauch，2005）及乙烯信號(hào)通路（Clay等，2009）的調(diào)控胼胝質(zhì)是由胼胝質(zhì)合成酶（callosesynthase，CalS/Glucansynthase-like，GSL）合成的。胼胝質(zhì)的純化研究表明，CalS催化亞基大約為ca.200kDa，且以多亞基復(fù)合酶體的形式存在（Verma和Hong，1-3胼胝質(zhì)合成酶復(fù)合物模式展示了alS的多個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)和1個(gè)親水環(huán)結(jié)構(gòu)以及親水環(huán)上的一些作用位點(diǎn)。AN，膜聯(lián)蛋白；SuSy，蔗糖合成酶；G，UP蔗糖轉(zhuǎn)移酶；，可能的N連接糖基化位點(diǎn)；C，依賴cMP和cMP的磷酸化位點(diǎn)；T，可能的酪氨酸磷酸化位點(diǎn)；R，富含脯氨酸的結(jié)構(gòu)域（era等，2001）Fig.1-3HypotheticalmodelofthecallosesynthasecomplexshowingtransmembranesandhydrophilicloopinctingwithRop1,annexin,UGT1andSuSy.G,potentialN-linkedglycosylationsites;CP,cAMPandetal.,表1-2擬南芥CalS功能研究進(jìn)Table1-2FunctionalstudiesofCalSgenesin功 實(shí)驗(yàn)方 文

T-DNAinsertion Dongetal.,

T-DNAinsertion Xieetal., 參與雄配子發(fā)育過(guò) T-DNAinsertion Huangetal.,CalS10/GSL8

參與雄配子體發(fā)育和植物生

T?lleretal., 參與細(xì)胞過(guò)程中細(xì)胞板的形 T-DNAinsertion ChenetCalS11/GSL1

參與孢子體和花粉發(fā)育過(guò) T-DNAinsertion Ennsetal., 植物受到時(shí)胼胝質(zhì)形 Jacobsetal.,2芥的12個(gè)CaS/SL蛋白大體分為4類。在擬南芥中，既存在多個(gè)CaS/GSL共同發(fā)揮作用的形式，也可以以單個(gè)CaSGSL行使功能。Dong（2008對(duì)12個(gè)擬南芥CaSGSL的表達(dá)研究發(fā)現(xiàn)，個(gè)CaSGSL均能在多個(gè)織部位表達(dá)，它可能是通過(guò)形復(fù)合酶體的方式行合的插入突變體的研究發(fā)現(xiàn)，突變體較野生型表現(xiàn)出更強(qiáng)的抗性。由此可看出，CalS/GSL植物啟動(dòng)子結(jié)構(gòu)與控啟動(dòng)子是指位于上游具有RNA聚合酶識(shí)別和結(jié)合位點(diǎn)的DNA守調(diào)（constuveprooer、（ssuespeciicprooer（nducblepooer（2007。受組成型啟動(dòng)子調(diào)的其表達(dá)大維持在一恒定水，不表現(xiàn)時(shí)空特異，也不受外界因誘導(dǎo)，常見(jiàn)的為被用在超表達(dá)載體上的花椰菜的CaMV35S啟動(dòng)子。組織特異型啟動(dòng)子是指在特定組織部位或特定時(shí)間表達(dá)的啟動(dòng)子，它調(diào)控的通常為植物生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中的誘動(dòng)特號(hào)件啟以提高平。目前已經(jīng)分離到的誘導(dǎo)型啟動(dòng)子包括光誘導(dǎo)型（Boeti等，1999）、激素誘導(dǎo)型（Nausaka等，1999）、病原物誘導(dǎo)型（Yn等，1997）、非生物脅迫誘導(dǎo)型（eki等，2002）及損傷誘導(dǎo)型（hen等，2001）等。控1-3植物中已鑒定的部分順勢(shì)作用元件（Table1-3Somecis-elementsidentifiedin一個(gè)典型的真核啟動(dòng)子包括啟動(dòng)子元件、啟動(dòng)子內(nèi)元件和上游啟動(dòng)子元件三部分。啟動(dòng)子元件是指能使RNA聚合酶起始轉(zhuǎn)錄的最小DNA序列，它包括轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)和TATAbox等。啟動(dòng)子內(nèi)元件能夠影響到啟動(dòng)子的強(qiáng)度，它包括CAATbox及其它一些作用元件（Boetti信號(hào)分子與直接和后能夠激活或抑制相應(yīng)的表達(dá)（表1-3）。目前，已經(jīng)分離得到了許多植物啟動(dòng)子序列，通過(guò)ntCARE（）能夠?qū)σ阎膯?dòng)子序列進(jìn)行順式作用元件分析。而通過(guò)轉(zhuǎn)等對(duì)一系列植物啟動(dòng)子的深入研究，又為植物工程的進(jìn)一步發(fā)展提供了許多外源啟動(dòng)子及啟動(dòng)子元件。葡萄瞬時(shí)轉(zhuǎn)化研究植物瞬時(shí)表達(dá)系統(tǒng)不同于穩(wěn)定遺傳轉(zhuǎn)化，是啟動(dòng)子分析、功能分析及生產(chǎn)蛋白重組的重要瞬時(shí)轉(zhuǎn)化中，許多未整合到植物組中的游離外源同樣可以表達(dá)，因此表達(dá)水平更高；的后代，且不存在漂移的生態(tài)風(fēng)險(xiǎn)等。的瞬時(shí)轉(zhuǎn)化也是研究植物抗病功能的一種重要工具（Bendahmane等，2000；Mindrinos等，1994；Scofield等，1996；Tang等，1996）。2008年，目前農(nóng)桿菌介導(dǎo)的葡萄離體葉片瞬時(shí)侵染已經(jīng)被廣泛用來(lái)研究葡萄功能以及啟動(dòng)子活性。Henanff等（2009）將VvNPR1.1在葡萄葉片中瞬時(shí)超表達(dá)，結(jié)果顯著提高了葉片對(duì)葡萄霜霉菌的抗病菌、水楊酸和低溫誘導(dǎo)。Guan等（2011）將華東葡萄乙二醛氧化酶（glyoxaloxidase）超表達(dá)瞬時(shí)圖1- 農(nóng)桿菌侵染法瞬時(shí)侵染葡萄葉片（Santos-Rosa等A．不同位置葡萄葉片和不同農(nóng)桿菌濃度下侵染效果比較；B．不同葡萄品種侵染效果比Fig.1-4transientexpressionofgrapevineleavesbyAgrobacterium-mediatedsysterm.A.EffectofleafpositionandconcentrationofbacterialsuspensiononGUSexpression.B.GUSexpressioninvariousgrapevinegenotypes.(Santos-Rosaetal.,2008)本研究的立論依據(jù)和研究霜霉病是葡萄的主要病害之一，但對(duì)不同葡萄種，特別野生葡萄，對(duì)葡萄霜霉病的抗性面展開(kāi)，其中，組織學(xué)觀察是其中一種重要的。通過(guò)組織學(xué)來(lái)觀察葡萄霜霉菌侵染不同解葡萄抗霜霉病的機(jī)理。胼胝質(zhì)合成酶（callosesynthase，CalS）是胼胝質(zhì)合成的關(guān)鍵酶，對(duì)CalS的研究對(duì)于我1、分析不同種葡萄對(duì)霜霉病的抗病/感病等級(jí)2 在明確劃分不同葡萄品種/株系抗性等級(jí)的基礎(chǔ)上，觀察霜霉菌與不同抗性葡萄的互作過(guò)程3、分析不同CalS受霜霉菌誘導(dǎo)表達(dá)模式，選取在抗病葡萄中受霜霉菌誘導(dǎo)上調(diào)表達(dá)CalS，研究其可能參與的與抗病相關(guān)的信號(hào)通路的抗性不同（Boso等，2004，2006，2008；Wan等，2007）。一般來(lái)說(shuō)，歐亞種葡萄（Vvinifera）hancockii）和蘡薁葡萄（Vadstricta）等易感霜霉，而華東葡萄（Vpseudoreticulata）、瘤葡萄（V.davidiivar.cyanocarpa）和燕山葡萄（V.yeshanensis）等對(duì)霜霉病表現(xiàn)出一定的抗性。方法比較了10個(gè)中國(guó)野生葡萄種對(duì)霜霉菌的抗性差異，并在此基礎(chǔ)上總結(jié)出中國(guó)野生葡萄的抗材料與方六個(gè)山葡萄（Vamurensis）的栽培種（‘長(zhǎng)白九’、‘雙豐’、‘雙紅’、‘雙優(yōu)’、‘通化三’和‘左山‘霞多麗’‘無(wú)核白’和‘亞都密’）和三個(gè)圓葉葡萄（Vrotundifolia）（‘Carlos’‘Fry’和‘Noble’）用直徑30cm的花盆種植在的中國(guó)教學(xué)實(shí)驗(yàn)地。其它的九個(gè)中國(guó)野生種葡萄種（變霜霉菌采自市林果。用小刷子將孢子囊刷在蒸餾水中，用血細(xì)胞計(jì)數(shù)器在顯微鏡下計(jì)數(shù)，然后配成105個(gè)孢子囊/mL的孢子囊懸浮液備用。數(shù)碼相 生物顯微 智能光照培養(yǎng) 寧波海曙實(shí)驗(yàn)儀器成直徑11mm的葉盤（避開(kāi)主葉脈和較大側(cè)葉脈），葉背面朝上放置在0.8%（w/v）水瓊脂平板上。每個(gè)葉盤上滴加35L霜霉菌孢子囊懸浮液，同時(shí)用滴加蒸餾水的葉盤做對(duì)照。葉盤多余的菌液。葉盤培養(yǎng)9天后統(tǒng)計(jì)發(fā)病情況。每個(gè)葡萄品種株系選取60個(gè)葉盤（每皿20個(gè)葉盤，共三皿，觀察有無(wú)壞死斑，統(tǒng)計(jì)其發(fā)病率、病情指數(shù)和菌密度三個(gè)指標(biāo)。是指發(fā)病的葉盤占所統(tǒng)計(jì)總?cè)~盤數(shù)的百分比（Boso和Kasseeye，2008。為了鑒定發(fā)病的嚴(yán)重程度，用LANE1D分析軟件計(jì)算了病斑面積占葉盤面積的百分比，并利用表2-1所示分類標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行感病等級(jí)分類。表2-1.Desaymard分類標(biāo)準(zhǔn)（Desaymard,Table2-1Desaymardclassification(Desaymard,病情指數(shù)=Σ(病級(jí)數(shù)值×該病級(jí)葉數(shù))／(數(shù)值×總?cè)~數(shù)菌密度指標(biāo)是根據(jù)Blasi等（2011）的OVI452方法做了一些修改，為一個(gè)半定量的抗性評(píng)定指標(biāo)。利用圖2-1所示的等級(jí)標(biāo)準(zhǔn)統(tǒng)計(jì)葉盤上肉眼可見(jiàn)的霜霉菌的密度。其中，0=沒(méi)有觀察到霜霉菌,1=低密度,2=中等密度,3=高密度,4=極高密度.2-19Fig.2-1.Downymildew(DM)symptomsonleafdiscswithdifferentsporulationdensityobserved9實(shí)驗(yàn)結(jié)果采用Student 測(cè)水平為P=0.05。用主成分分析法（principalcomponentsysis，PCA）綜合三個(gè)抗性統(tǒng)計(jì)指標(biāo)，檢驗(yàn)不同葡萄品種/株系的抗病性差異。所有的數(shù)據(jù)分析都用SPSS13.0軟件完實(shí)驗(yàn)結(jié)根據(jù)離體葉盤接菌實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以看到，不同的葡萄品種/株系對(duì)霜霉病菌表現(xiàn)出不同的抗病感病性（表2-2（93.33100、病情指數(shù)（39.6748.50）和菌密度值（3.73-4.00，表明其易感霜霉病。除圓葉葡萄外，在華東葡萄、菱狀葉葡萄和山葡萄（）3個(gè)中國(guó)野生葡萄種中也觀察到了壞死斑點(diǎn)（圖22108（對(duì)霜霉病表現(xiàn)出不同程度的抗性，其中華東葡萄葉盤的僅為2.5%（變?nèi)~葡萄和刺葡萄）的病情指數(shù)（47.33%和37.75%）和菌密度（3.03和3.28）值均很高，表現(xiàn)為易霜霉病萄‘雙紅’的（53.33%）和病情指數(shù)（17.17%）均要顯著低于其它的山葡萄品種（表2-2。密度（3.70和3.77）值都很高，表現(xiàn)為易感霜霉病。2-2霜霉菌侵染5天后（5dpi）葡萄葉片壞死斑觀察Fig.2-2Necroticspotsongrapevineleavesat5dpi.中中博第二章2-2霜霉菌侵9天后不同葡萄品種葉盤發(fā)病情況統(tǒng)Table2-2ScoreofDMsymptomsandsporulationninedaysafterP.viticola葡葡萄品種/病情指數(shù)菌密抗性壞死葉被面絨毛圓葉葡萄(VDEF免+-DEF免+-DEF免+-華東葡萄(VDEF高+-菱狀(VC中+-毛葡萄(V廣西毛葡中-+美麗葡萄(V中-+中-+CF中-+蘡薁葡萄(VC中-+山葡萄(V雙中+-長(zhǎng)白AA低+-雙AA低+-雙AA低+-通化A低--左山AA低+-山歐雜種(VA-VV一AAA感--左優(yōu)AAA感--AAA感--刺葡萄(VAA感--歐亞(V赤霞AAA感--無(wú)核AAA感--霞多AAA感--亞都AAA感--a分析結(jié)果進(jìn)行方差分析，采用 Keuls檢驗(yàn)法進(jìn)行檢測(cè)，檢測(cè)水平為P=005，每列不同字母表示差異顯著b+：霜霉菌侵染后在葉盤上觀察到壞死斑；-：霜霉菌侵染后在葉盤上未觀察到壞死斑C+：葉片背面肉眼能觀察到絨毛；-：葉片背面肉眼觀察不到絨毛葡萄品種分為五個(gè)類別（2-2；圖2-3：（i）三個(gè)圓葉葡萄品種的葉盤上均未觀察到霜霉菌生長(zhǎng)，的其它葡萄品種，對(duì)霜霉病表現(xiàn)為“高抗”；（iii）山葡萄‘雙紅’和六個(gè)中國(guó)野生種葡萄（菱狀葉葡萄、毛葡萄、美麗葡萄、桑葉葡萄、腺枝葡萄和蘡薁葡萄）對(duì)霜霉菌侵染表現(xiàn)為“中抗（v）其它的五個(gè)山葡萄品種（雖出高病數(shù)但們菌度低，對(duì)霉“抗（v兩個(gè)國(guó)野葡萄（變?nèi)~葡萄和刺葡萄山種和優(yōu)紅’）和四個(gè)歐亞種葡萄品種（‘赤霞珠’、‘無(wú)核白’、‘霞多麗’和‘亞都密’）均表現(xiàn)出很高的、病情指數(shù)和菌密度，因此均屬于“感病”品種。圖2- 各葡萄品種對(duì)霜霉病抗性指標(biāo)的主成分分Fig.2-3.PrincipalComponentsysis(PCA)ofalltherecordedvariablesofDMresistanttoseparatethegrapevinespecies/cultivars.討離體葉盤法實(shí)驗(yàn)是目前普遍應(yīng)用的一種用于評(píng)價(jià)葡萄抗霜霉病性的實(shí)驗(yàn)方法（Boso等，2006；semee，20；tol200目前已有許多研究表明，不同種（品種）的葡萄對(duì)霜霉病表現(xiàn)出不同的抗病感病性（audt和Kasseeye，1995；Boso等，2006；ool，2007；Davdson，2008。一般認(rèn)為，歐亞種葡萄易多種病害（Bown等，1999；Boso等，2006；Boso和Kasseeyer，2008）而圓葉葡萄對(duì)許多病害都表現(xiàn)出極高的抗性（ueta，2000；Conne，2006。中國(guó)野生葡萄種類繁多，它們對(duì)葡萄炭疽病、白腐病（Wang等，1998；i等，2008、白粉病和霜霉病（Wang等，1995；Wan2007等多種葡萄病害表現(xiàn)出不同等級(jí)的抗性。華東葡萄是一種生長(zhǎng)東南地區(qū)的野生葡萄品種，它對(duì)于葡萄白粉病具有很高的抗性（an等，2007。而本研究發(fā)現(xiàn)華東葡萄‘10571058及葡萄抗病育種提供了良好的種質(zhì)資源。山葡萄是葡萄屬種最抗寒的一個(gè)種，但關(guān)于其對(duì)霜霉病的抗性一直存在爭(zhēng)議。有些研究認(rèn)為，山葡萄高，易感霜霉?。ǖ?，1998；an等，2008）而有些研究認(rèn)為一些山葡萄品種屬于抗霜霉病葡萄品種（等，1999；u等，2010。本研究將三項(xiàng)抗霜霉病指標(biāo)（、病情指數(shù)和菌密度）綜合分析后，得到了更精確的抗性等管和病情指數(shù)都較高，但它們的菌密度值都要低于歐亞種葡萄，這表明山葡萄中至少存在部分抗病性，因此被歸類于較抗類別。兩個(gè)山歐雜種，‘一’[（山葡萄‘左山二’×歐亞種葡萄‘小紅玫瑰’）×（山葡萄‘73121’×山葡萄‘雙慶’）]和‘左優(yōu)紅’[（山葡萄‘左山二’×歐亞種葡萄‘小紅玫瑰’）×（山葡萄‘73134’×山葡萄‘雙慶’）（宋潤(rùn)剛等，2005Lu2000每種中國(guó)野生葡萄都存在許多品種/株系，且在各個(gè)品種/株系間存在很大的抗病性差異。如本中山萄雙’它葡品在項(xiàng)病指（、病情指數(shù)和密度上（1986（64.7176.42）和菌嚴(yán)重度（17.50%-63.37%）-3-6為65.83，病指數(shù)為17.33，這與和王國(guó)英（1986）的對(duì)霜霉病抗性最好的毛葡萄‘旬-3’抗性相似。將‘廣西毛葡萄’的各項(xiàng)指標(biāo)與本實(shí)驗(yàn)的其它葡萄比較后，將其歸為中抗葡萄。毛徐紅霞等（2004和等（1995）認(rèn)為，葡萄葉背茸毛與葡萄品種抗病性有關(guān)，葉背茸了抗病的作用。而這也可能是這幾種中國(guó)野生葡萄抗霜霉病的機(jī)理之一。葡萄霜霉菌是一種專性寄生的卵菌，其游動(dòng)孢子的早期發(fā)育依賴于某些宿主因子的存在（Kiefer等，的階段。同樣的現(xiàn)象也在擬南芥霜霉菌侵染擬南芥葉片的過(guò)程中觀察到（Li等，2010）。材料與方用直徑30cm的花盆種植教學(xué)實(shí)驗(yàn)地。華東葡萄來(lái)自中國(guó)農(nóng)業(yè)鄭州果樹(shù)所。計(jì)數(shù)，然后配成105個(gè)孢子囊/mL孢子囊懸浮液備用。BX51型熒光顯微 HCP-2型臨界點(diǎn)干燥 IB5型真空噴鍍 S-3000N型掃描電 智能光照培養(yǎng) 寧波海曙實(shí)驗(yàn)儀器胺藍(lán)溶液（0.067MK2HPO4）霜霉菌侵染葡萄葉盤方法同第二章。霜霉菌侵染后1天、3天、5天、8天取樣。每個(gè)品種取三個(gè)葉盤，分別放在凍存管中，-20℃保存以用于電鏡觀察。同時(shí)取水侵染葉盤作為對(duì)照。整個(gè)實(shí)1）預(yù)固定：將葡萄2.5%的戊二醛溶液（0.2M磷酸氫二鈉-磷酸二氫鈉緩沖液，pH=7.0，4℃過(guò)2）：用0.2M磷酸緩沖液室溫洗三次，每次15分鐘脫水：乙醇梯度脫水法逐步取代樣品中水分。使用乙醇濃度：50%~70%~80%~90%~95%，再用乙醇脫水兩次20分鐘干燥及噴金：樣CO2臨界點(diǎn)干燥法進(jìn)行干燥（HCP-2CriticalPointDryer）后噴金處理觀察HITACHIS-3000N型掃描電鏡觀樣品處理方KOH-苯胺藍(lán)方法（Hood和Shew,1996；Díez-Navajas等，2007），具體1）色1MKOH溶液中，10030分2）：樣品用蒸餾水3次，每次15分染色：樣品浸泡于0.05%的苯胺藍(lán)溶液（0.067MK2HPO4）中不少于15觀察：樣品OlympusBX51型熒光顯微鏡，在紫外光激發(fā)下觀察。用OlympusDP70型數(shù)碼照相機(jī)拍攝相片，用photoshop圖像處理軟件進(jìn)行相片處理。實(shí)驗(yàn)結(jié)果采用Student Keuls檢驗(yàn)法進(jìn)行方差分析，來(lái)檢測(cè)不同變量間的顯著性差異，檢測(cè)水平為P=0.05。所有的數(shù)據(jù)分析都用SPSS13.0軟件完成。實(shí)驗(yàn)結(jié)為了研究不同抗性的葡萄品種對(duì)霜霉菌侵染的反應(yīng)，我們選取兩個(gè)對(duì)霜霉菌免疫的圓葉葡（‘Caos’和‘Noble’）、一個(gè)高抗的華東葡萄（株系號(hào)‘10571058’）、兩個(gè)的山葡萄品種（中‘紅和抗‘山一、兩個(gè)感病的山歐雜種‘一’和‘左優(yōu)紅以及三個(gè)感病的歐亞種葡萄品種為實(shí)驗(yàn)材料，通過(guò)組織學(xué)觀察的方法來(lái)比較在不同抗性的葡萄葉片上，霜霉菌生長(zhǎng)狀態(tài)的差異。3-1：1和18鏡觀察結(jié)果；2-F2、-3、4F4和-6：霜霉菌侵染后1、、5和8天葡萄葉片的熒光顯微鏡觀察結(jié)果；7-F：霜霉菌侵染9天后不同葡萄葉片的霜霉菌病斑。紅色箭頭：獨(dú)特的熒光；白色箭頭：胼胝質(zhì)積累；黑色箭頭：壞死斑點(diǎn)；H：吸器；y：菌絲；：初生菌絲；p：孢子囊梗；tS：氣孔下囊泡；p：游動(dòng)孢子；s：孢子囊Fig.3-1.SEMandfluorescencemicroscopyobservationsofP.viticolainfectedleavesofVitisspecieswithdifferentresistantlevelsat1,3,5and8dpi.A,immuneV.rotundifolia‘Carlos’;B,extremelyresistantV.pseudoreticulata‘1057/1058’;C,resistantV.amurensis‘Shuanghong’;D,partiallyresistantV.amurensis‘Zuoshanyi’;E,susceptibleVA-VVhybrid‘Zuoyouhong’;F,susceptibleV.vinifera‘Chardonnay’;A1-F1andA5-F5,SEMobservationsonthebottomofleavesonedayat1and8dpi;A2-F2,A3-F3,A4-F4andA6-F6,Fluorescencemicroscopyobservationsonthebottomofleavesat1,3,5and8dpi;A7-F7,Macroscopicobservationsonleafdiscsat9dpi.redarrow:distinctivefluorescence;whitearrow:callosedepositions;blackarrow:necroticspot;H:haustoria;Hy:hypha;PH:primaryhypha;Sp:sporangiophore;St:stomata;SV:substomatalvesicle;Zp:zoospore;Zs:zoosporangium.3-1霜霉菌在不同抗性等級(jí)的葡萄品種中的生長(zhǎng)狀Table3-1DevelopmentofP.viticolaonVitisspecieswithdifferentresistantlevelsbyfluorescencemicroscopy葡萄 品種/株

1 3觀察到霜霉菌的氣孔 形成分支的霜霉菌絲圓葉葡 DC華東葡CC山葡雙CC左山B山歐雜一B左優(yōu)B霞多B無(wú)核B亞都AAa=觀察到霜霉菌囊泡生長(zhǎng)的氣孔數(shù)/觀察到總的氣孔數(shù)b=形成分枝的霜霉菌絲數(shù)/總菌絲數(shù)c分析結(jié)果進(jìn)行方差分析，采用StudentKeuls檢驗(yàn)法進(jìn)行檢測(cè)，檢測(cè)水平為P=005，每列不同字母表示差異顯著在霜霉菌侵染后1天（1dpi）時(shí)，通過(guò)掃描電鏡可以在所有品種的葡萄葉片上觀察到霜霉的游動(dòng)孢子。子的數(shù)量和大小都沒(méi)有明顯的差異。此外，在圓葉葡萄（圖3-1A1）和華東葡萄（圖3-1B1）的氣孔周圍根據(jù)可知，這些分泌物可能是一種被稱為胼胝質(zhì)（callose）的多聚糖（Gindro等，通過(guò)KOH-苯胺藍(lán)染色和熒光顯微觀察法可以觀察到霜霉菌的早期侵染過(guò)程以及霜霉菌絲在葡萄葉胼胝質(zhì)積累物的觀察（DezNavaas等，20072008；rouveot等，2008）。1dpi時(shí)在圓葉葡萄（圖3-1A2）和華東葡萄（圖3-1B2）氣孔附近由植物氣孔的霜霉菌芽管進(jìn)一步發(fā)育形成的球狀亞氣孔囊泡（substoatalvesces）和初生菌絲（priaryhyphae）。在高抗華東葡萄（5.45）和中抗山葡萄‘雙紅’（7.91）的葉片上，有霜霉菌亞細(xì)胞囊泡和初生菌絲生長(zhǎng)的氣孔數(shù)要遠(yuǎn)少于低抗山葡萄‘左山一’（14.74）、易感的山歐雜種葡萄‘左優(yōu)紅’、歐亞種‘霞多麗’（17.86%）和‘無(wú)核白’（15.14%），更顯著的少于易感山歐雜種‘’（25.53%和歐亞種‘亞都’（28.40，表31）。此外，在高的東葡萄（圖31B2）和中抗的山葡萄品種‘雙紅’（圖31C2）的葉片上形成的亞氣孔囊泡明顯小于在低抗的山葡萄品種（圖31D2）和感病的山歐雜種（圖3-12）及歐亞種葡萄品種（圖312）上形成的囊泡。霜霉菌侵染3（3dp胝質(zhì)在氣孔周圍積累。此外，還觀察到氣孔周圍的一些細(xì)胞在紫外激發(fā)下呈現(xiàn)出特殊的熒光（圖3-1A3）。高抗的華東葡萄氣孔周圍也形成了一定量的胼胝質(zhì)，但它沒(méi)有完全霜霉菌的生長(zhǎng)，在其葉片上觀察到霜霉菌形成了極小的沒(méi)有分枝的菌絲體（圖3-1B3’（6.25）葉片上觀察到的分枝的霜霉菌絲體要顯著的少于低抗山葡萄‘左山一’（54.05%）、感病山歐雜種‘一’（55.17%）和‘左優(yōu)紅’（58.33%）以及歐亞種葡萄‘霞多麗（66.67%）、‘無(wú)核白’（58.33%）和‘亞都密’（90.00%）（表3-1，圖3-1）侵染5天后（5dpi），霜霉菌在不同抗性等級(jí)葡萄品種/株系葉片上的生長(zhǎng)情況存在很大差異。在（圖3-1A4和B4）。在抗?。ㄖ锌购偷涂梗┥狡咸哑贩N葉片上，霜霉菌菌絲分枝，伴有極小的吸器在菌絲上形成。在這些吸器周圍觀察到呈亮黃色熒光的胼胝質(zhì)的積累（圖3-1C4和D4）。但在山葡萄品體，且菌絲體上分布大量的吸器（圖3-1E4F4）。霜霉菌侵染8天后（8dpi），在圓葉葡萄（圖3-1A5A6）和華東葡萄（3-1B5B6）的葉片上3-1B6）。在山葡萄品種的氣孔附近也觀察到了胼胝質(zhì)的積累（圖3-1C5-C6和D5-D6），但是它們沒(méi)能霉菌孢子囊梗要遠(yuǎn)遠(yuǎn)多于山葡萄品種（圖3-1D6）葉片上的孢子囊梗。例如在中抗的山葡萄品種‘雙紅’根據(jù)顯微觀察的結(jié)果，我們總結(jié)出霜霉菌對(duì)不同抗性葡萄葉片的侵染有以下五種模式（圖32。在（圖32A（圖32B。中抗葡萄品種主要在兩個(gè)部位觀察到胼胝質(zhì)的形成，一是在霜霉菌游動(dòng)孢子侵染階段的氣孔附近，二是在（圖3-2C。低抗葡萄品種的宿主反應(yīng)與中抗葡萄相似，但在低抗葡萄葉片上生長(zhǎng)的霜霉菌絲體要遠(yuǎn)多于中抗葡萄（圖32D（圖32。3-2Fig.3-2.Illustrationofin ctionbetweenthesmoparaviticolaandgrapevineswithdifferentDMresistantlevels:DMimmunegrapevine(A),extremelyresistantgrapevine(B),resistantgrapevine(C),partiallyresistantgrapevine(D)andsusceptiblegrapevine(E).blackspots:callosedeposits;whitecell:cellswithdistinctivefluorescence.討萄霜菌侵葡萄片的程是游動(dòng)子識(shí)氣孔位并萌芽管氣開(kāi)始。霜菌芽孔孔成囊出絲。進(jìn)長(zhǎng)肉組（Burruano2000。Unger等（2007）認(rèn)為，霜霉病侵染過(guò)程中，抗病和感病葡萄間最重要的差異出現(xiàn)在胼胝質(zhì)的積累是植物抵抗病菌的一項(xiàng)防御反應(yīng)（Nishiua等，2003；Dong等，2008；i等，2010。有研究認(rèn)為胼胝質(zhì)的積累是由病原菌相關(guān)分子模式（pathogenassocatedolecuarpaens,AMs（Bown1998omez-Goez1999；oyu等，2004。本研究發(fā)現(xiàn)，對(duì)霜霉病免疫的圓葉葡萄和高抗的華東葡萄的葉片在霜霉菌侵染的整個(gè)（氣孔附近和吸器周圍，但積累量要明顯少于圓葉葡萄和華東葡萄。而感病的葡萄品種葉片在霜霉菌侵染的整個(gè)過(guò)程中都沒(méi)有觀察到胼胝質(zhì)的積累。indro等（2003）在研究對(duì)霜霉病有不同抗性的歐亞種葡萄時(shí)也得到相同的觀察結(jié)果。此外，Dez–Navaas等（2008）（Heinz1990熒光可能與酚類物質(zhì)（Bennett等，1996）和過(guò)氧化酶介導(dǎo)的相關(guān)通路產(chǎn)生的木質(zhì)素類物質(zhì)（Fry，1986；GrahamGraham，1991Bolwell，1993）的累積相關(guān)。然而要確定這一現(xiàn)象還需要進(jìn)一步的組織化被萵苣霜霉菌侵染的萵苣葉片中（Lebeda等，2008），以及被擬南芥霜霉菌侵染的十字花科植物（Li長(zhǎng)，并伴隨有一些植物抗毒素的積累（Glazebrook等，1997；Koch等，1990；Li等，2007；2010）。胼胝質(zhì)的積累是植物抵抗病菌的一項(xiàng)防御反應(yīng)（Nishimura等，2003；Dong等，2008；Li等，2010）。而胼胝質(zhì)合成酶（callosesynthase，CalS）是胼胝質(zhì)合成的關(guān)鍵酶。目前，在擬南芥、小麥、大麥、棉花等多種植物中都發(fā)現(xiàn)了CalS。Voigt等（2006）對(duì)小麥8個(gè)CalS/GSL的研究表明，6個(gè)CalS/GSL，又進(jìn)一步對(duì)HvGSL1進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)該在花、發(fā)育早期的谷粒、胚芽鞘的表達(dá)研究發(fā)現(xiàn)，其中5個(gè)擬南芥CalS/GSL的表達(dá)受到霜霉菌侵染和SA的調(diào)控，其中AtCalS1AtCalS12響應(yīng)強(qiáng)烈，并且參與了依賴于NPR1SA調(diào)控通路。本研究通過(guò)對(duì)不同抗性的葡萄品種中CalS受霜霉菌誘導(dǎo)后表達(dá)情況的變化，希望能夠找出與葡萄抗病性相關(guān)的CalS。材料與方選取免疫圓葉葡萄品種‘Noble’和‘Carlos’，中抗山葡萄品種‘雙紅’，低抗山葡萄品種‘左山懸浮液（105個(gè)孢子囊/mL）噴灑在葡萄葉片上，套袋后在人工氣候箱中培養(yǎng)（溫度28℃白天/24CFX96TMReal-Time BIO-RAD伯DK-8D型電熱恒溫水 RXZ智能型人工氣候 寧波江南儀器SL-N系列電子天平 UV-2800A紫外分光光度計(jì) 尤尼柯（）儀器 微量可調(diào)移液 CTAB2%十六烷基三乙基溴化銨（CTAB，2%聚乙烯吡咯烷酮（PVP-40，100mMTris-HCl，25mM乙二胺四乙酸（EDTA），2.0M氯化鈉（NaCl），0.5g/L亞精胺，2%β-巰基乙醇（β-ME）SSTE（SDS1DNaseⅠ（Rnase）,ClonedRibonucleaseInhibitor購(gòu)自TAKARA公司；M-MLVReverseTranscriptase，GoTaq?qPCRmastermix購(gòu)自promega公司。加液氮研磨保存在-80℃的材料，稱取0.2g放入1.5mL65℃預(yù)熱的CTABbufferL，6515700L氯仿/異戊醇（24:1，劇烈412000rpm離心10分鐘取出上清放入一新1.5mL離心管，加入相同體積的氯仿，劇412000rpm離心10分鐘取出上清，放入1.5mL1/3體積的8MLiCl4℃過(guò)夜412000rpm離心30分鐘，倒掉上清500LSSTE溶液溶解沉淀（24:1，412000rpm離心10分鐘取上清放入1.5mL離心管，加入2倍體積預(yù)冷乙醇，混勻后-80℃放置30412000rpm30分鐘，倒掉上清，沉淀即為粗提將沉75％乙10秒，412000rpm離心5分鐘，倒掉乙醇，晾干，加入40LDEPC處理過(guò)的雙蒸水溶解總RNA；向上述40LRNA的離心管中5LDNAase，5LDNAasebuffer（10×），1L抑制劑，混勻，37℃1小時(shí)，取出500LDEPC處理過(guò)的超純水加入300L苯酚，300L氯仿/異戊醇（24:110分鐘412000rpm10分鐘取上1.5mL離心管中，再加入相同體積的氯仿/異戊醇（24:110412000rpm離心10分鐘冷異丙醇，-80℃，過(guò)夜；412000rpm10倒掉上清，沉淀用80％乙醇兩遍，晾干，加入20LDEPC處理過(guò)的超純水溶解，即得到DNA用分光光度計(jì)測(cè)量RNA的純度和濃度，以檢測(cè)提取RNAcDNA取0.5mL滅菌微量離心管，分別加入以下成分：總RNA（1.0 2OligodT15合成引物（10M） 8離心管置于水浴鍋內(nèi)，68℃熱變性15迅速取出置于冰上冷卻5分鐘，將5×第一鏈緩沖液（first-strandbuffer） 4LdNTP混合物（每種濃度10 1 1M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶（200 1置于37℃水浴鍋中60分鐘95℃水浴鍋中5分鐘滅活酶的活性，取出后迅速置于冰上，置于-20℃冰箱中保存葡萄及其它植物CalS查在葡萄黑比諾組序列（http:/ 上查找葡萄CalS 。擬南芥、棉花和大麥的CalS基因序列來(lái)自NCBI（ncbi.nlm /）。用DNAMAN5.2.2軟件進(jìn)行氨基酸序列比對(duì)分析。用ClustalX1.8MEGA4軟件對(duì)所有CalS蛋白的氨基酸序列進(jìn)行聚類和進(jìn)化分析。在（nlm.nih. /Structure/cdd/wrpsb.cgi）和SMART（）中進(jìn)行CalS蛋白保守域結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)。PCR（Real-TimePCR）葡萄CalS特異性表達(dá)引Real-TimePCR反應(yīng)體系及擴(kuò)增反應(yīng)總體系20μL，包10μLGoTaq?qPCRmastermi（promega1.0μL10μMprimer，2.0μLcDNA模板和7.0μLdH2O。PCR反應(yīng)條件為：945分鐘9430秒，5830秒，共40次循環(huán)，58℃-95每隔0.2℃讀板做熔解曲線。每個(gè)樣本均做3個(gè)平行管，內(nèi)標(biāo)EF1-α也相應(yīng)的做3個(gè)平行管。在同一反應(yīng)體系中，用RNA和水做為陽(yáng)性和對(duì)照。整個(gè)PCR反應(yīng)在CFX96TMReal-Timesystem熒光PCR的結(jié)果分手工設(shè)置熒光域值，確定在該熒光域值下特定的循環(huán)數(shù)CT值，根據(jù)CT平均值，計(jì)算不同模板CT值，C＝2-△CT，ΔCt＝CT目 -CT內(nèi) 表4-1葡萄CalSReal-TimePCR引Table4-1TheReal-TimePCRprimersofgrapeCalS名名Primer序列EF1-

GSVIVT01001361001 GSVIVT01001361001R AAAGATTTGGAGAATTCGCGAGGSVIVT01025362001L CAGGGAATCTTGGCGAGTCGSVIVT01025362001R CACACGGAGGATCGGAGCGSVIVT01026489001L CGCGTCGCCTATCTCTGT GSVIVT01020854001L GGTCTCCAAAGTAGGGATCGGSVIVT01020854001R GTAAGCAACACGTAAACTTGGGTGSVIVT01000622001L TCGTATTGCTTATCTCTGCCGGSVIVT01000622001R CCCGTCCAGTTGAATAGGTATCGSVIVT01025370001L GCTCCTACCATCACAAACGGSVIVT01025370001R TACTGCTGCTTGTACCTCAGGSVIVT01007560001L CTCAGTCATGCTTTCCAAACATCGSVIVT01007560001R TCCTAATGTGCAACTTCTCTTCTGSVIVT01005204001L AGGGTTGCTCTTTGAGAATGCTGSVIVT01005204001R GCTGCCGTCTTGCCTEF1α EF1α 實(shí)驗(yàn)結(jié)果采用Student Keuls檢驗(yàn)法進(jìn)行方差分析，來(lái)檢測(cè)不同變量間的顯著性差異，檢測(cè)水平為P=0.05。所有的數(shù)據(jù)分析都用SPSS13.0軟件完成。實(shí)驗(yàn)結(jié)葡萄CalS序列的查找與分在葡萄‘黑比諾’組序列（GrapeGenomeBrowser）及NCBI（Gene）上搜索葡萄胼胝質(zhì)合成酶（callosesynthase，CalS），共得到8個(gè)相關(guān)序列（表4-2）。通過(guò)進(jìn)一步序列分析發(fā)現(xiàn)，葡萄的8個(gè)CalS分別位于第4、第6、第12、第13、第17和第19條上（VvCalS11未知）ORF4908bp6159bp之間，外顯子20個(gè)到45個(gè)不等，而內(nèi)含30個(gè)到48個(gè)不等表4-2歐亞種葡萄‘’組中CalS序Table4-2CalSgenesinV.vinifera‘Pinot編內(nèi)含外顯ORF序列長(zhǎng)度位 .1bVvCalS11ORF葡萄CalS編碼的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)分將尋到的8個(gè)葡萄VvCalS蛋白氨酸列它物已胝合酶氨酸序表4-CaS63.2%-79.2%CalS8個(gè)CalS8個(gè)CalS蛋白30%-80CaSVvCaS1和VvCalS379.5VvCal5和VvCalS1133.3CuseX41。CalSCalSCalS蛋白共同VvCalS1、VvCalS3、VvCalS5和VvCalS8Cal15和AtCal8VvCaS7AtCa67VvCaS9和VvCal10以及擬南芥的AtCalS910HvCalS和棉花的GhCalSVvCalS11AtCalS11-12。在SMART上分析葡萄VvCalS蛋白的氨基酸序列，發(fā)現(xiàn)其長(zhǎng)度在1632-2053個(gè)氨基酸之間，普遍要長(zhǎng)于一般的植物蛋白氨基酸序列。結(jié)構(gòu)域分析表明，8個(gè)葡萄的VvCalS蛋白都具有一個(gè)葡聚糖合成酶結(jié)構(gòu)域（β-1,3-glucansynthase），該合成酶屬于糖基轉(zhuǎn)移酶48（glycosyltransferase48family）UDP-葡萄糖為作用底物，合成β-1,3-葡聚糖。在各個(gè)VvCalS蛋白間此結(jié)構(gòu)域的序列相似性為64.30%。除葡聚糖合成酶結(jié)構(gòu)域之外，在葡萄的8個(gè)VvCalS蛋白上還具有多個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)域（transmembrane），且這些跨膜結(jié)構(gòu)域分成兩簇，分位于CalS蛋白的兩端（圖4-2）。這些保守的結(jié)構(gòu)同樣也存在于擬南芥AtCalS蛋白中（ChenKim，2009）。中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)博士學(xué)位論 第四 葡萄CalS基因及其表達(dá)譜研4-3葡萄VvCalSCalS蛋白氨基酸序列相似性比較Table4-3SimilaritypercentageofVitisandotherntsCalS100791005260100425451100464946431003434393933100394143403661100384033323537341007878574947354039100777754484632393792100697957473933403465721005057373836313031625848100595779494642403858565240100535350654434373052484636511004453527041353832454950355173100424749416531353243434532444339100383940363470573738363330383634341003232374036607436383532333636383559100373838323738406336343328383635373936100404037343839416041403529383636383937631003535404033786136323232343734353671613336100343537403569603736323136373438346158363568100注：VvCalS表示葡萄CalS蛋白，AtCalS表示擬南芥CalS蛋白，HvCalS為大麥CalS蛋白，GhCalS為棉花CalS蛋ⅠⅡⅢⅣ4-1VvCalS與其它植物CalS蛋白的進(jìn)化分析。VvCalS表示CalS蛋白，AtCalS表示擬CalS蛋白，HvCalS表示大麥CalS蛋白，GhCalS表示棉花CalS蛋白Fig.4-1PhylogeneticysisofVitisandotherntsCalSproteins.VvCalS:VitisCalSprotein;AtCalS:ArabidopsisCalSprotein;Hv:HordeumCalSprotein;Gh:GossypiumCalSprotein圖4-2VvCalSFig.4-2StructureofVvCalS葡萄CalS的表達(dá)分析和比較不同抗性等級(jí)的葡萄品種中CalS在霜霉菌誘導(dǎo)下的表達(dá)情況，我們根據(jù)歐亞種葡萄‘’的8個(gè)CalSORF序列差異設(shè)計(jì)了8對(duì)引物（表4-1），以霜霉菌侵染后的免疫圓葉葡萄麗’葉片為材料，提取RNA，反轉(zhuǎn)錄為cDNA，然后進(jìn)行了實(shí)時(shí)熒光定量PCR