ICH-Q5D(R4)用于生物技術產(chǎn)品及生物制品課件

QQ5D(R4)

用于生物技術產(chǎn)品及生物制品生產(chǎn)的細胞基質的來源和鑒定Q目錄2.XXXXXX前言本指導原則的目的是對用于生產(chǎn)生物技術產(chǎn)品及生物制品的人和動物細胞系、微生物細胞系及其細胞庫的制備和鑒定建立合適的標準提供指導意見。本文件還為申請產(chǎn)品上市時在這些方面應申報哪些資料提出了建議。本指導原則涵蓋了所有具備細胞庫系統(tǒng)的細胞基質。這里的“細胞基質”是指微生物細胞或來自于人或動物的細胞系，它們具有生產(chǎn)供人類體內(nèi)或體外使用的生物技術產(chǎn)品及生物制品的全部潛能。體外診斷試劑不在本文件范圍之內(nèi)。目的范圍2.XXXXXX前言基本原理由于細胞源性的生物制品存在外來污染的可能性，用于制備產(chǎn)品的細胞特性存在改變的可能性，重組DNA

(rDNA)制品的質量也與細胞基質中構建的表達載體有關。因此，細胞基質的特性以及與之相關的事件將影響產(chǎn)品的質量和安全性。為有效地控制產(chǎn)品質量，需對細胞基質操作的各方面進行適宜的控制。為確保制品的質量和安全性，需提供一份支持性文件，記載生產(chǎn)生物技術產(chǎn)品及生物制品的細胞基質的歷史，還應記載它們?nèi)炕虿糠謥碓从谀讣毎档臍v史，以便將細胞基質在研究和開發(fā)階段所發(fā)生的事件與生產(chǎn)制品所用的特定細胞基質相聯(lián)系來全面評估其風險。1.

細胞基質的來源、歷史和產(chǎn)生——1.1

細胞的來源應說明所用細胞基質的細胞來源，引證科學文獻上的相關參考資料。直接從實驗室獲得的資料是首選的，如果沒有這些資料，也可以利用文獻。1.

細胞基質的來源、歷史和產(chǎn)生——1.1

細胞的來源?

對于人源細胞系，應提供原供體組織或器官的起源、人種和地理位置、年齡、性別和一般的生理狀況。如有材料，應將供體致病因子的檢查結果與健康狀況或病史一并報告。特別是人二倍體成纖維細胞，由于供體的年齡可能影響細胞系的體外壽命，應盡可能提供。?

對于動物細胞系，應提供物種、品系、飼養(yǎng)條件、組織或器官的起源、地理位置、年齡和性別、致病因子的檢查結果以及原供體的一般生理狀況。? 對于微生物細胞，應提供產(chǎn)生細胞系的物種、株和已知的遺傳和表型特征。如可能，還應提供其致病性、毒素產(chǎn)物和其他生物危害方面的資料。1.

細胞基質的來源、歷史和產(chǎn)生——1.2

細胞的歷史?

應記錄細胞的培養(yǎng)歷史，包括最初分離細胞的方法、細胞體外培養(yǎng)的方法以及建立細胞系的方法。還應提供所有對基因操作和篩選的描述、細胞內(nèi)源性和外源性因子的鑒別、特性和檢測結果等資料。?

應保存用于開發(fā)細胞系的方法學資料。在細胞系的構建期間，會采用包括細胞融合、轉染、篩選、克隆分離、克隆、基因擴增和對特定培養(yǎng)條件或培養(yǎng)基的適應等方法中的一種或多種使細胞系具有所需的特性。這些方法學資料有助于了解細胞系的詳細歷史。1.

細胞基質的來源、歷史和產(chǎn)生——1.3

細胞基質的產(chǎn)生? 對于重組產(chǎn)品，細胞系是指克隆自一個祖細胞且含有所需序列的轉染細胞。? 對于非重組產(chǎn)品或非重組疫苗，細胞系是指來源于那些選擇用作制備主細胞庫且未經(jīng)進一步修飾的母細胞系的細胞。? 對源于雜交瘤的產(chǎn)品，細胞基質是指骨髓瘤母細胞系和其他母細胞系融合后產(chǎn)生的雜交瘤細胞系，如免疫脾細胞。1.

細胞基質的來源、歷史和產(chǎn)生——1.3

細胞基質的產(chǎn)生對于重組產(chǎn)品，選擇合適的母細胞系是關鍵的一步。母細胞系通常是未轉染的受體細胞系。建議采用經(jīng)鑒定的母細胞庫，但這不是必需的。特別是當多個細胞系產(chǎn)生于同一種母細胞系時，采用鑒定的母細胞庫能提供一套對主細胞庫(MCB)進行質量評估的信息。比如，骨髓瘤細胞系可以作為母細胞系建立雜交瘤細胞系。1.

細胞基質的來源、歷史和產(chǎn)生——1.3

細胞基質的產(chǎn)生關于細胞基質的產(chǎn)生，應提供詳細的制備過程中接觸的轉染因子。應提供培養(yǎng)基的組分，特別是提供關于人或動物來源的物質，如血清、酶、水解產(chǎn)物或其他活細胞方面的資料。提供的資料還應包括來源、制備和質控方法、檢測結果和質量保證。還應提供上述有關方面的文獻。這些資料將用于詳細分析外源因子來源的可能途徑，并作為制品風險-收益評估的一部分。1.

細胞基質的來源、歷史和產(chǎn)生用連續(xù)傳代培養(yǎng)的細胞生產(chǎn)生物技術產(chǎn)品及生物制品的最大優(yōu)點是每批產(chǎn)品都有一個經(jīng)檢定過的共同起源，即保存的細胞庫。生產(chǎn)商可制備自己的細胞庫，也可從外部獲得。生產(chǎn)商應對每個細胞庫進行檢驗，以確保其質量。2.細胞庫2.細胞庫二級細胞庫即主細胞庫（MCB）傳代產(chǎn)生工作細胞庫(WCB)，通常被認為是在連續(xù)生產(chǎn)產(chǎn)品時細胞基質供應的最實際方法。單級細胞庫即僅建有MCB而沒有WCB，如果每年生產(chǎn)的產(chǎn)品僅需有限的幾支細胞時，這種情況原則上也是允許的?！?.1

細胞庫系統(tǒng)——2.1

細胞庫系統(tǒng)MCB與WCB的區(qū)別? MCB直接從最初的克隆或源于最初克隆的初級主細胞庫中制得。對某些類型的細胞，不必從克隆制備細胞庫(如二倍體細胞）。? WCB來源于一支或多支MCB，WCB是直接用于生產(chǎn)的細胞。新制備的WCB應通過鑒定和檢測，以證明合格。? MCB和WCB在諸如培養(yǎng)基組分和培養(yǎng)條件方面也許有差別，制備MCB和WCB的培養(yǎng)條件也許與產(chǎn)品生產(chǎn)時不同。2.細胞庫——2.1

細胞庫系統(tǒng)在一些微生物表達系統(tǒng)中，對每批新細胞基質進行新的轉化，這種新的轉化要使用經(jīng)過徹底檢驗的宿主細胞庫和質粒庫，每次轉化的細胞基質庫都要經(jīng)過檢驗。這個轉化的細胞基質庫可被看作MCB，它是生產(chǎn)用細胞基質的來源。宿主細胞庫、質粒庫和MCB都需用適宜方法進行保存。因為細菌和酵母的轉化通常是重復性好、操作容易，不像轉染后生動物細胞那樣復雜，因此，這種經(jīng)過改變的表達系統(tǒng)是符合要求的。生產(chǎn)商應提供有關宿主細胞、重組DNA分子(如質粒)、轉化及細胞建庫的方法以及鑒定結果等方面的資料。2.細胞庫——2.2

細胞建庫的步驟?

細胞建庫通常是逐步增加容器數(shù)量或擴大容器培養(yǎng)以獲得足夠量的細胞，并將其分裝到足夠量的容器中。為確保每個容器中的內(nèi)容物完全一致，如培養(yǎng)細胞采用多個器皿的，應把所有培養(yǎng)器皿中的細胞混合再分裝。? 將懸浮在培養(yǎng)基中的一批細胞，定量分裝到無菌容器中并在適宜條件下密封和貯藏。例如，含有細胞凍存劑的培養(yǎng)基中的動物細胞，在規(guī)定和控制的條件下，分裝到密封容器中冷凍，然后轉移到液氮中或在相當?shù)某蜏貤l件下保存。其他的保存和貯藏方法也是可用的，但要根據(jù)細胞的性質而定?？傊瑧辜毎３忠欢ǖ纳婺芰Γ瑏頋M足生產(chǎn)及產(chǎn)品一致性的要求。2.細胞庫——2.2

細胞建庫的步驟?

生產(chǎn)商應說明所用建庫系統(tǒng)的類型、細胞庫的大小、所用的容器和密閉系統(tǒng)，制備細胞庫的方法，包括所用的凍存劑、培養(yǎng)基以及細胞保存和貯藏的條件。? 生產(chǎn)商應闡明避免微生物污染和實驗室中其他類型細胞交叉污染的方法。還應介紹可追蹤細胞庫容器的方法，包括記錄系統(tǒng)，以及能經(jīng)受保存、貯藏和復蘇而不會丟失的容器標簽。2.細胞庫——2.2

細胞建庫的步驟注意事項避免被污染的細胞基質（或細胞庫）用于生產(chǎn)是十分重要的，否則，由于受污染的細胞庫不能使用，必須重新生產(chǎn)細胞庫，這將延誤產(chǎn)品上市或開發(fā)的時機。應該認識到?jīng)]有哪一種細胞庫檢測方案能檢測出所有可能潛在的污染。因此，只有在細胞建庫期間采取預防措施，才能確保細胞不被污染，為生產(chǎn)提供可靠的細胞基質。3.細胞庫——2.2

細胞建庫的步驟注意事項為確保持續(xù)正常生產(chǎn)，生產(chǎn)商應采取預防措施，防止如火災、斷電和人為錯誤等事故的發(fā)生而造成的細胞庫不能用于生產(chǎn)。生產(chǎn)商應提供預防計劃，例如，在多個冷藏罐中分別保存細胞庫，使用備用電源，使用自動液氮填充系統(tǒng)，將部分MCB和WCB保存在較遠的場所，及MCB的再生等。2.細胞庫——2.2

細胞建庫的步驟注意事項在生產(chǎn)中體外細胞的壽命應從解凍一個或多個容器MCB開始算起。對于二倍體細胞系，其體外壽命應以細胞的倍增水平估算，還應檢測二倍體細胞發(fā)生衰老時的細胞倍增水平。2.細胞庫3.細胞庫鑒定和檢測的一般原則對建庫細胞基質的鑒定和檢測是生物技術產(chǎn)品及生物制品質量控制的重要組成部分。通過對MCB的鑒定，生產(chǎn)商可評估是否存在來自其他細胞系的細胞、外源和內(nèi)源因子以及其他污染物。檢測的目的是為了證實用于生產(chǎn)的細胞基質的特性、純度和適用性。在有些情況下，其他方面如致癌性或細胞核學的檢測也是有用的。對某一細胞基質選擇何種檢測方案要根據(jù)細胞的生物學特性（如生長的需求）、培養(yǎng)歷史（包括人源和動物源性生物試劑的使用）以及可應用的試驗方法而定。細胞基質的鑒定程度將影響以后的生產(chǎn)階段所需的常規(guī)檢測的類型或水平。3.細胞庫鑒定和檢測的一般原則? 生產(chǎn)商應對每個MCB作一次純度試驗和鑒別實驗，對將要注冊的每一產(chǎn)品在細胞培養(yǎng)期間作一次穩(wěn)定性試驗。? 生產(chǎn)商應對每一個WCB作純度檢測和必要的鑒別試驗。? 申請人應參考ICH指導原則中有關病毒安全性方面的內(nèi)容，進行有關試驗并在申請制品上市時將試驗內(nèi)容和試驗結果一并上報。3.細胞庫鑒定和檢測的一般原則對于含有外源構建表達載體的細胞系，應參照ICH指導原則中有關rDNA表達載體方面的內(nèi)容，進行核苷酸和氨基酸序列方面的鑒定。也可用類似的方法對基因序列明確并已鑒定的某些非重組DNA來源的細胞系的編碼序列進行檢測。但是，沒有必要對那些編碼復雜的天然產(chǎn)品序列進行分析，如相關的基因產(chǎn)品系列、微生物疫苗抗原或來自于雜交瘤的單克隆抗體。3.細胞庫鑒定和檢測的一般原則?

如果條件具備，應鼓勵生產(chǎn)商在細胞基質鑒定和檢測中使用先進方法和技術改進，但新方法的特異性、靈敏度和精密度至少應與現(xiàn)有方法相當。? 如果理由充分，生產(chǎn)商也可選擇對WCB進行鑒定，而不是MCB。3.細胞庫鑒定和檢測的一般原則應采用合適的試驗證明建庫的細胞就是它本身。鑒別試驗可利用細胞的表型或遺傳型特征，但不必作所有的試驗。通常對MCB作鑒別試驗，而對每個WCB僅作有限的鑒別試驗?！?.1

鑒別試驗3.細胞庫鑒定和檢測的一般原則——3.1.1

鑒別試驗?后生動物細胞對于貼壁生長的人或動物細胞，可采用形態(tài)學分析與其他試驗相結合的方法。在大多數(shù)情況下，同工酶分析足以確證人或動物細胞庫的種屬來源；依據(jù)細胞系的歷史情況，可采用其他合適的試驗。對于種族來源亦可用其他替代技術予以確認，如用染色體條帶分析或種屬特異性抗血清的方法。替代方法可顯示其獨特的標志物。例如，通過使用染色體細胞遺傳學來檢測獨特的標記染色體，或用DNA分析來檢測基因組多態(tài)性。只要能確證其起源物種或某種已知細胞系獨特性標記物的存在，就可認為是適宜的鑒別試驗方法。目標產(chǎn)品的表達可作為鑒別試驗的一種補充手段。3.細胞庫鑒定和檢測的一般原則對于大多數(shù)微生物細胞，分析細胞在選擇性培養(yǎng)基上生長情況就可用以確證宿主細胞庫的宿主細胞種屬特性。對于大腸桿菌，由于有許多不同的株，可考慮采用生物學鑒別方法，如噬菌體分類，作為鑒別試驗的補充。對于質粒庫，可按ICH文件中有關表達載體分析的內(nèi)容進行特性評估。目標產(chǎn)品的表達也可用以確證微生物表達系統(tǒng)的特性?！?.1.2

鑒別試驗?微生物細胞3.細胞庫鑒定和檢測的一般原則評估MCB和WCB的生物學純度，即游離的外源微生物和外源細胞污染，是細胞開發(fā)和建庫的關鍵部分。在設計和進行這些試驗時，應考慮選擇性試劑和抗生素對檢測外源微生物污染的影響?！?.2

純度檢測3.細胞庫鑒定和檢測的一般原則——3.2.1

純度檢測?后生動物細胞①

生物負荷檢測：應采用MCB和WCB的單一容器（容器總數(shù)的1%，但不少于2個）檢測生物負荷（細菌和真菌）的存在。目前在歐洲藥典、日本藥局方或美國藥典所記載的用于測試微生物限度或無菌試驗的方法也是適用的。3.細胞庫鑒定和檢測的一般原則——3.2.1

純度檢測?后生動物細胞②

支原體檢測：應檢測MCB和WCB是否存在支原體。目前所用的瓊脂和肉湯培養(yǎng)基的方法以及指示劑細胞培養(yǎng)法是適用的。用于支原體測試的方法在歐洲藥典、日本藥局方和FDA

“用于生產(chǎn)生物制品的細胞系鑒定的考慮要點”一文中都有記載。僅用1支MCB或WCB來源的細胞進行測試就可以了。對于非哺乳動物細胞系，供選擇的測試方法或條件應適當，采用哪種方法，生產(chǎn)商應咨詢當?shù)貒一虻貐^(qū)的管理機構。3.細胞庫鑒定和檢測的一般原則——3.2.1

純度檢測?后生動物細胞③

病毒檢測：對于細胞基質中可能污染病毒的檢測，應根據(jù)細胞系的培養(yǎng)史，通過篩選和相關的特異性試驗，選用可檢測廣譜病毒的方法。申請人應就病毒安全性問題參考ICH指南，對于那些尚未在該指南中涉及的產(chǎn)品類別，可參考WHO關于使用動物細胞的有關資料。3.細胞庫鑒定和檢測的一般原則——3.2.1

純度檢測?后生動物細胞④

細胞交叉污染檢測：細胞基質的純度會由于污染相同或不同種系的細胞而降低。選擇什么樣的純度試驗方法取決于該細胞存在被何種細胞系交叉污染的可能。有時，在同一實驗室會同時培養(yǎng)幾種不同的細胞系，在細胞建庫過程中，當進行開放性操作時，應注意避免與其他細胞系同時開放操作而導致交叉污染。在建庫的開放性操作過程中，只要在此操作間有另一種細胞系存在，就應檢測該細胞庫細胞中是否污染了另一種細胞系的細胞。在鑒別試驗中介紹的細胞特性的檢測方法一般也可用于檢測是否與其他細胞系存在交叉污染。另外，從細胞基質中成功地制得預期產(chǎn)品是說明無交叉污染的另一種旁證。3.細胞庫鑒定和檢測的一般原則——3.2.2

純度檢測?微生物細胞在設計檢測微生物細胞庫中外源微生物因子和外源細胞污染的特異性試驗方法時，應考慮以下問題：建庫細胞的性質、科技文獻中報道的可能存在的污染、用于細胞培養(yǎng)的細胞來源、方法和材料以及存在于建庫實驗室中的其他生物等等。例如，可考慮采用幾種微生物培養(yǎng)基對該微生物細胞進行培養(yǎng)，其中有些培養(yǎng)基可使細胞生長，有些則不能，培養(yǎng)后采用目視法對分離的菌落進行鑒定，就可以判斷是否有其他微生物污染。3.細胞庫鑒定和檢測的一般原則——3.3

細胞基質的穩(wěn)定性細胞鑒定的另一個目的是考察細胞在生產(chǎn)中的適用性。細胞基質穩(wěn)定性主要應考慮兩個方面，即生產(chǎn)產(chǎn)品的一致性和貯存在規(guī)定條件下的細胞能否維持其生產(chǎn)能力。3.細胞庫鑒定和檢測的一般原則——3.3

細胞基質的穩(wěn)定性①

生產(chǎn)產(chǎn)品的一致性生產(chǎn)產(chǎn)品的一致性是對細胞基質進行評估的主要內(nèi)容。用于此類評估的試驗類型和試驗項目將根據(jù)細胞基質的性質、培養(yǎng)方法和所生產(chǎn)的產(chǎn)品而定。對于含有重組DNA表達載體的細胞系，在其培養(yǎng)達到或超過體外代次限度時，應通過核酸檢測或產(chǎn)品分析，對表達載體上編碼序列的一致性進行驗證。對于非重組細胞系，在生產(chǎn)中細胞培養(yǎng)達到或超過體外代次限度時，應通過核酸檢測或純化蛋白質制品的分析驗證其蛋白質編碼序列沒有改變。3.細胞庫鑒定和檢測的一般原則——3.3

細胞基質的穩(wěn)定性如果產(chǎn)品不能按上述方法進行分析，則其他特征諸如形態(tài)學特性、生長特性、生化標志、免疫標志、對預期產(chǎn)品的生產(chǎn)能力或其他相關的表型或遺傳標志等都可用于評估細胞基質的穩(wěn)定性。在某些情況下，當無法將MCB細胞的特性直接與達到或超過細胞體外代次限度的生產(chǎn)用細胞比較時，可將生產(chǎn)最初階段的細胞與達到或超過細胞體外代次限度的生產(chǎn)用細胞進行特性比較。某些指標，如氧或葡萄糖的消耗量、氨或乳酸的產(chǎn)率可用于這類檢測。3.細胞庫鑒定和檢測的一般原則——3.3

細胞基質的穩(wěn)定性②貯存細胞的生產(chǎn)能力在規(guī)定的貯藏條件下，建庫細胞的穩(wěn)定性一般需通過生產(chǎn)臨床試驗用樣品來驗證。當儲存的細胞復蘇生產(chǎn)臨床試驗用樣品時，對細胞活力的測定數(shù)據(jù)可證明這些復蘇細胞在儲存過程中仍然保持活力，可證實復蘇細胞能用于生產(chǎn)所需的產(chǎn)品。以上這些資料需納入到申報資料中去，并附上對建庫細胞穩(wěn)定性監(jiān)測的方案。3.細胞庫鑒定和檢測的一般原則——3.3

細胞基質的穩(wěn)定性?

評估培養(yǎng)期間的穩(wěn)定性，至少應考察兩個時間點。一個時間點是采用最少傳代數(shù)的細胞，另一個時間點是申請上市的生產(chǎn)中達到或超過細胞體外傳代限度的細胞。?

用于生產(chǎn)的細胞體外傳代限度應根據(jù)從中試生產(chǎn)規(guī)?；蛏a(chǎn)規(guī)模的細胞擴增代數(shù)到建議或超過建議的生產(chǎn)代次限度所得的資料來確定。如果要延長用于生產(chǎn)的細胞的體外代次限度，應有體外代次已達到所建議的新限度的研究資料支持。對于二倍體細胞，應提供擬用于生產(chǎn)條件下的WCB細胞體外有限代次的資料。? 細胞基質穩(wěn)定性的驗證通常在每個產(chǎn)品上市申請時進行一次。3.細胞庫鑒定和檢測的一般原則——3.4

細胞核學和致瘤性試驗根據(jù)細胞類型、產(chǎn)品的性質以及生產(chǎn)工藝，決定是否有必要采用細胞核學和致瘤性試驗來評價二倍體細胞系的安全性或鑒定一個新的細胞系。3.細胞庫鑒定和檢測的一般原則——3.4

細胞核學和致瘤性試驗需要做細胞核學和致瘤性試驗的情況：?

對不能去除活細胞或幾乎無下游純化工藝（如一些傳統(tǒng)的活病毒疫苗）的制品需要做細胞基質的細胞核學和致瘤性試驗。用于非純化制品的新細胞基質，是否需進行致瘤性試驗和染色體分析，應具體情況具體分析。用已知是致癌的或具有異常細胞核的細胞系生產(chǎn)含有細胞或未高度純化的制品時，應在每個產(chǎn)品申報時進行風險-收益的評估。? 對于新建的或之前未經(jīng)鑒定的二倍體細胞，應采用MCB細胞證實其具有二倍體細胞的細胞核，并確認其潛在的致瘤性。3.細胞庫鑒定和檢測的一般原則——3.4

細胞核學和致瘤性試驗不需要做細胞核學和致瘤性試驗的情況：?

嚙齒類動物細胞系或已知為非二倍體的新細胞系不需要作細胞核學測定，因細胞遺傳學分析足以評估細胞基質的特性或純度。對文獻已記載具有致瘤性的細胞不需重復進行致瘤性試驗。?

對于高度純化和不含細胞的制品，只要通過生產(chǎn)工藝驗證或通過批簽發(fā)檢測，表明殘留的宿主細胞DNA符合限度要求，通常也不必進行細胞核學和致瘤性試驗。3.細胞庫鑒定和檢測的一般原則——3.4

細胞核學和致瘤性試驗不需要做細胞核學和致瘤性試驗的情況：?

用未進行遺傳修飾的MRC5或WL-38細胞生產(chǎn)時，不必對這些細胞進行細胞核學或致瘤性的鑒定，因為對這些細胞系已作了大量的鑒定工作，并有文獻發(fā)表。但是，對于每個MRC-5或WI-38的WCB，生產(chǎn)商應再確認生產(chǎn)用細胞的生長方式符合二倍體細胞的特點，并具有所預期的代次。3.細胞庫鑒定和檢測的一般原則以上指導原則適用于鑒定過的建庫細胞制備的生物技術產(chǎn)品及生物制品。然而，也有許多生物制品尤其是一些病毒疫苗是采用原代細胞制備的。由于原代細胞是原始組織分離后的第一代細胞，因此不必像鑒定建庫細胞那樣在生產(chǎn)之前對其進行全面鑒定。此外，用原代細胞生產(chǎn)的生物制品通常不進行深加工處理（如純化）。盡管存在著這些不同，但對原代細胞基質進行安全性和適用性的檢測方法在很多方面與前文以及其他指南中所介紹的