細(xì)胞生物學(xué)翟中和第三章演示文稿

細(xì)胞生物學(xué)翟中和第三章演示文稿當(dāng)前第1頁(yè)\共有80頁(yè)\編于星期四\21點(diǎn)（優(yōu)選）細(xì)胞生物學(xué)翟中和第三章當(dāng)前第2頁(yè)\共有80頁(yè)\編于星期四\21點(diǎn)細(xì)胞生物學(xué)第一節(jié)細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)的觀察方法光學(xué)顯微鏡：以可見(jiàn)光（或紫外線）為光源。電子顯微鏡：以電子束為光源。當(dāng)前第3頁(yè)\共有80頁(yè)\編于星期四\21點(diǎn)細(xì)胞生物學(xué)一、光學(xué)顯微鏡（一）普通光學(xué)顯微鏡1、構(gòu)成：①照明系統(tǒng)②光學(xué)放大系統(tǒng)③機(jī)械裝置2、原理：經(jīng)物鏡形成倒立實(shí)像，經(jīng)目鏡進(jìn)一步放大成像。當(dāng)前第4頁(yè)\共有80頁(yè)\編于星期四\21點(diǎn)細(xì)胞生物學(xué)當(dāng)前第5頁(yè)\共有80頁(yè)\編于星期四\21點(diǎn)細(xì)胞生物學(xué)當(dāng)前第6頁(yè)\共有80頁(yè)\編于星期四\21點(diǎn)細(xì)胞生物學(xué)3.分辨力：指分辨物體最小間隔的能力。R=0.61λ/N．A．其中λ為入射光線波長(zhǎng)；N．A：為鏡口率

＝ｎsinα/2，n=介質(zhì)折射率；α=鏡口角（樣品對(duì)物鏡鏡口的張角）。思考：如何提高顯微鏡的分辨能力？當(dāng)前第7頁(yè)\共有80頁(yè)\編于星期四\21點(diǎn)細(xì)胞生物學(xué)表一、幾種介質(zhì)的折射率當(dāng)前第8頁(yè)\共有80頁(yè)\編于星期四\21點(diǎn)細(xì)胞生物學(xué)顯微鏡的幾個(gè)光學(xué)特點(diǎn)：制作光學(xué)鏡頭所用的玻璃折射率為1.65~1.78，所用介質(zhì)的折射率越接近玻璃的越好。sinα/2的最大值必然小于1；介質(zhì)為空氣，鏡口率一般為0.05~0.95；油鏡頭用香柏油為介質(zhì)，鏡口率可接近1.5。普通光線的波長(zhǎng)為400~700nm，分辨力數(shù)值不會(huì)小于.2μm，人眼的分辨力為0.2mm,因此顯微鏡的最大設(shè)計(jì)倍數(shù)為1000X。當(dāng)前第9頁(yè)\共有80頁(yè)\編于星期四\21點(diǎn)細(xì)胞生物學(xué)（二）相差和微分干涉顯微技術(shù)干涉:兩列頻率相同的光波在空中相遇時(shí)發(fā)生疊加，在某些區(qū)域總加強(qiáng)，在另外一些區(qū)域總減弱，出現(xiàn)明暗相間的條紋或者是彩色條紋的現(xiàn)象叫做光的干涉。當(dāng)前第10頁(yè)\共有80頁(yè)\編于星期四\21點(diǎn)細(xì)胞生物學(xué)相差顯微鏡把透過(guò)標(biāo)本的可見(jiàn)光的光程差變成振幅差，從而提高了各種結(jié)構(gòu)間的對(duì)比度，使各種結(jié)構(gòu)變得清晰可見(jiàn)。在構(gòu)造上，相差顯微鏡有不同于普通光學(xué)顯微鏡兩個(gè)特殊之處。1、環(huán)形光闌（annulardiaphragm）：位于光源與聚光器之間。2、相位板（annularphaseplate）：物鏡中加了涂有氟化鎂的相位板，可將直射光或衍射光的相位推遲1/4λ。當(dāng)前第11頁(yè)\共有80頁(yè)\編于星期四\21點(diǎn)細(xì)胞生物學(xué)當(dāng)前第12頁(yè)\共有80頁(yè)\編于星期四\21點(diǎn)細(xì)胞生物學(xué)用途：觀察未經(jīng)染色的玻片標(biāo)本當(dāng)前第13頁(yè)\共有80頁(yè)\編于星期四\21點(diǎn)細(xì)胞生物學(xué)微分干涉顯微鏡1952年，Nomarski發(fā)明，微分干涉顯微鏡是以平面偏振光為光源，光線經(jīng)棱鏡折射后分成兩束，在不同時(shí)間經(jīng)過(guò)樣品的相鄰部位，然后經(jīng)過(guò)另一棱鏡將這兩束光匯合，從而樣品中厚度上的微小差別就會(huì)轉(zhuǎn)化成明暗區(qū)別，增加了樣品反差，造成了標(biāo)本的人為三維立體感，類似大理石上的浮雕。微分干涉顯微鏡適于研究活細(xì)胞中較大的細(xì)胞器，如果接上錄像裝置可以記錄活細(xì)胞中的顆粒以及細(xì)胞器的運(yùn)動(dòng)。

當(dāng)前第14頁(yè)\共有80頁(yè)\編于星期四\21點(diǎn)細(xì)胞生物學(xué)（三）熒光顯微鏡特點(diǎn)：光源為紫外線，波長(zhǎng)較短，分辨力高于普通顯微鏡；有兩個(gè)特殊的濾光片；照明方式通常為落射式。當(dāng)前第15頁(yè)\共有80頁(yè)\編于星期四\21點(diǎn)細(xì)胞生物學(xué)當(dāng)前第16頁(yè)\共有80頁(yè)\編于星期四\21點(diǎn)細(xì)胞生物學(xué)用于觀察能激發(fā)出熒光的結(jié)構(gòu)。用途：免疫熒光觀察、基因定位、疾病診斷。Fluorescenceimageofepithelialcell,DNAinblueandMicrotubulesingreen當(dāng)前第17頁(yè)\共有80頁(yè)\編于星期四\21點(diǎn)細(xì)胞生物學(xué)（四）激光共聚焦掃描顯微境

Laserconfocalscanningmicroscope,LCSM用激光作光源，逐點(diǎn)、逐行、逐面快速掃描。能顯示細(xì)胞樣品的立體結(jié)構(gòu)。分辨力是普通光學(xué)顯微鏡的3倍。用途類似熒光顯微鏡，但能掃描不同層次，形成立體圖像。當(dāng)前第18頁(yè)\共有80頁(yè)\編于星期四\21點(diǎn)細(xì)胞生物學(xué)laserconfocalscanningmicroscope,LCSM當(dāng)前第19頁(yè)\共有80頁(yè)\編于星期四\21點(diǎn)細(xì)胞生物學(xué)當(dāng)前第20頁(yè)\共有80頁(yè)\編于星期四\21點(diǎn)細(xì)胞生物學(xué)LCSMImageofaXenopusMelanophore

microtubulecytoskeleton(green)andthenucleus(blue)當(dāng)前第21頁(yè)\共有80頁(yè)\編于星期四\21點(diǎn)細(xì)胞生物學(xué)(五)熒光共振能量轉(zhuǎn)移技術(shù)

CFP的發(fā)射光譜與YFP的吸收光譜有相當(dāng)?shù)闹丿B，當(dāng)它們足夠接近時(shí)，用CFP的吸收波長(zhǎng)激發(fā)，CFP的發(fā)色基團(tuán)將會(huì)把能量高效率地共振轉(zhuǎn)移至YFP的發(fā)色基團(tuán)上，所以CFP的發(fā)射熒光將減弱或消失，主要發(fā)射將是YFP的熒光。

當(dāng)前第22頁(yè)\共有80頁(yè)\編于星期四\21點(diǎn)細(xì)胞生物學(xué)當(dāng)前第23頁(yè)\共有80頁(yè)\編于星期四\21點(diǎn)細(xì)胞生物學(xué)應(yīng)用:1、檢測(cè)酶活性變化2、關(guān)于膜蛋白的研究3、細(xì)胞膜受體之間相互作用4、細(xì)胞內(nèi)分子之間相互作用

當(dāng)前第24頁(yè)\共有80頁(yè)\編于星期四\21點(diǎn)細(xì)胞生物學(xué)(六)熒光漂白恢復(fù)技術(shù)FRAP(光漂白后熒光恢復(fù))就是在光漂白后對(duì)樣本確定區(qū)中的熒光恢復(fù)。FRAP是由沒(méi)有漂白的熒光團(tuán)由周圍進(jìn)入漂白區(qū)FRAP的運(yùn)動(dòng)引起的。FRAP用于測(cè)量2-維或3-維分子運(yùn)動(dòng)的力度。分子運(yùn)動(dòng)包括膜或活細(xì)胞內(nèi)用熒光標(biāo)明的分子的擴(kuò)散、轉(zhuǎn)移或其他類型的運(yùn)動(dòng)。

當(dāng)前第25頁(yè)\共有80頁(yè)\編于星期四\21點(diǎn)細(xì)胞生物學(xué)二、電子顯微鏡（一）電子顯微鏡的基本知識(shí)1、電子顯微鏡與光學(xué)顯微鏡的基本區(qū)別當(dāng)前第26頁(yè)\共有80頁(yè)\編于星期四\21點(diǎn)細(xì)胞生物學(xué)不同光線的波長(zhǎng)當(dāng)前第27頁(yè)\共有80頁(yè)\編于星期四\21點(diǎn)細(xì)胞生物學(xué)２、電子顯微鏡的分辨本領(lǐng)和有效放大倍數(shù)分辨本領(lǐng)：是指電鏡處于最佳狀態(tài)下的分辨率電鏡分辨率受制樣技術(shù)的影響。當(dāng)前第28頁(yè)\共有80頁(yè)\編于星期四\21點(diǎn)細(xì)胞生物學(xué)３、電子顯微鏡的基本構(gòu)造１）電子束照明系統(tǒng)２）成像系統(tǒng)３）真空系統(tǒng)４）記錄系統(tǒng)當(dāng)前第29頁(yè)\共有80頁(yè)\編于星期四\21點(diǎn)細(xì)胞生物學(xué)（二）、主要電鏡制樣技術(shù)介紹1、超薄切片技術(shù)電子束穿透力很弱，用于電鏡觀察的標(biāo)本須制成厚度僅40-50nm的超薄切片，(1)固定：通常以鋨酸和戊二醛固定樣品，丙酮逐級(jí)脫水(2)包埋：環(huán)氧樹(shù)脂包埋(3)切片：以熱膨脹或螺旋推進(jìn)的方式切片(4)染色：重金屬（鈾、鉛）鹽染色形成明暗的黑白圖象當(dāng)前第30頁(yè)\共有80頁(yè)\編于星期四\21點(diǎn)細(xì)胞生物學(xué)當(dāng)前第31頁(yè)\共有80頁(yè)\編于星期四\21點(diǎn)細(xì)胞生物學(xué)當(dāng)前第32頁(yè)\共有80頁(yè)\編于星期四\21點(diǎn)細(xì)胞生物學(xué)2、負(fù)染技術(shù)用重金屬鹽(如磷鎢酸)對(duì)鋪展在載網(wǎng)上的樣品染色；吸去染料，干燥后，樣品凹陷處鋪了一層重金屬鹽，而凸的出地方?jīng)]有染料沉積，從而出現(xiàn)負(fù)染效果，分辨力可達(dá)1.5nm左右。NegativeStainedActin當(dāng)前第33頁(yè)\共有80頁(yè)\編于星期四\21點(diǎn)細(xì)胞生物學(xué)3、冰凍蝕刻

freeze-etching亦稱冰凍斷裂。標(biāo)本置于干冰或液氮中冰凍。然后斷開(kāi)，升溫后，冰升華，暴露出了斷面結(jié)構(gòu)。向斷裂面上噴涂一層蒸汽碳和鉑。然后將組織溶掉，把碳和鉑的膜剝下來(lái)，此膜即為復(fù)膜（replica）。當(dāng)前第34頁(yè)\共有80頁(yè)\編于星期四\21點(diǎn)細(xì)胞生物學(xué)４、電鏡三維重構(gòu)技術(shù)對(duì)樣品在不同的傾角拍照，得到圖片經(jīng)處理后而展現(xiàn)的電子密度圖。電鏡三維重構(gòu)技術(shù)與X-射線晶體衍射技術(shù)及核磁共振分析技術(shù)相結(jié)合，是當(dāng)前結(jié)構(gòu)生物學(xué)（StructuralBiology）（主要研究生物大分子空間結(jié)構(gòu)及其相互關(guān)系）的主要實(shí)驗(yàn)手段。當(dāng)前第35頁(yè)\共有80頁(yè)\編于星期四\21點(diǎn)細(xì)胞生物學(xué)５、掃描電鏡技術(shù)20世紀(jì)60年代問(wèn)世，用來(lái)觀察標(biāo)本表面結(jié)構(gòu)。分辨力為6~10nm，由于人眼的分辨力（區(qū)別熒光屏上距離最近兩個(gè)光點(diǎn)的能力）為0.2mm，掃描電鏡的有效放大倍率為0.2mm/10nm=20000X。當(dāng)前第36頁(yè)\共有80頁(yè)\編于星期四\21點(diǎn)細(xì)胞生物學(xué)Scanningelectronmicroscope（SEM）當(dāng)前第37頁(yè)\共有80頁(yè)\編于星期四\21點(diǎn)細(xì)胞生物學(xué)工作原理：是用一束極細(xì)的電子束掃描樣品，在樣品表面激發(fā)出次級(jí)電子，次級(jí)電子的多少與樣品表面結(jié)構(gòu)有關(guān)，次級(jí)電子由探測(cè)器收集，信號(hào)經(jīng)放大用來(lái)調(diào)制熒光屏上電子束的強(qiáng)度，顯示出與電子束同步的掃描圖像。為了使標(biāo)本表面發(fā)射出次級(jí)電子，標(biāo)本在固定、脫水后，要噴涂上一層重金屬膜，重金屬在電子束的轟擊下發(fā)出次級(jí)電子信號(hào)。當(dāng)前第38頁(yè)\共有80頁(yè)\編于星期四\21點(diǎn)細(xì)胞生物學(xué)掃描電子顯微鏡原理當(dāng)前第39頁(yè)\共有80頁(yè)\編于星期四\21點(diǎn)細(xì)胞生物學(xué)當(dāng)前第40頁(yè)\共有80頁(yè)\編于星期四\21點(diǎn)細(xì)胞生物學(xué)人類精子當(dāng)前第41頁(yè)\共有80頁(yè)\編于星期四\21點(diǎn)細(xì)胞生物學(xué)三、掃描隧道顯微鏡

scanningtunnelingmicroscope，原理：根據(jù)隧道效應(yīng)而設(shè)計(jì)，當(dāng)原子尺度的針尖在不到一個(gè)納米的高度上掃描樣品時(shí)，此處電子云重疊，外加一電壓（2mV~2V），針尖與樣品之間形成隧道電流。電流強(qiáng)度與針尖和樣品間的距離有函數(shù)關(guān)系，將掃描過(guò)程中電流的變化轉(zhuǎn)換為圖像，即可顯示出原子水平的凹凸形態(tài)。分辨率：橫向?yàn)?.1~0.2nm，縱向可達(dá)0.001nm。用途：三態(tài)（固態(tài)、液態(tài)和氣態(tài)）物質(zhì)均可進(jìn)行觀察。當(dāng)前第42頁(yè)\共有80頁(yè)\編于星期四\21點(diǎn)細(xì)胞生物學(xué)掃描隧道顯微鏡原理當(dāng)前第43頁(yè)\共有80頁(yè)\編于星期四\21點(diǎn)細(xì)胞生物學(xué)第二節(jié)細(xì)胞組分的分析方法一、用超速離心技術(shù)分離細(xì)胞器與生物大分子及其復(fù)合物轉(zhuǎn)速為10~25kr/min的離心機(jī)稱為高速離心機(jī)。轉(zhuǎn)速>25kr/min，離心力>89Kｇ者稱為超速離心機(jī)。目前超速離心機(jī)的最高轉(zhuǎn)速可達(dá)100000r/min，離心力超過(guò)500Kg。

當(dāng)前第44頁(yè)\共有80頁(yè)\編于星期四\21點(diǎn)細(xì)胞生物學(xué)超速離心技術(shù)：用途：分離大小相差懸殊的細(xì)胞和細(xì)胞器。沉降順序：核——線粒體——溶酶體與過(guò)氧化物酶體——內(nèi)質(zhì)網(wǎng)與高基體——核蛋白體?？蓪⒓?xì)胞器初步分離，常需進(jìn)一步通過(guò)密度梯離心再行分離純化。

當(dāng)前第45頁(yè)\共有80頁(yè)\編于星期四\21點(diǎn)細(xì)胞生物學(xué)當(dāng)前第46頁(yè)\共有80頁(yè)\編于星期四\21點(diǎn)細(xì)胞生物學(xué)密度梯度離心用介質(zhì)在離心管內(nèi)形成一連續(xù)或不連續(xù)的密度梯度，將細(xì)胞混懸液或勻漿置于介質(zhì)的頂部，通過(guò)離心力場(chǎng)的作用使細(xì)胞分層、分離。類型：速度沉降、等密度沉降。常用介質(zhì)：氯化銫、蔗糖、多聚蔗糖。分離活細(xì)胞的介質(zhì)要求：1）能產(chǎn)生密度梯度，且密度高時(shí)，粘度不高；2）PH中性或易調(diào)為中性；3）濃度大時(shí)滲透壓不大；4）對(duì)細(xì)胞無(wú)毒。當(dāng)前第47頁(yè)\共有80頁(yè)\編于星期四\21點(diǎn)細(xì)胞生物學(xué)Velocity(A)andEquilibrium(B)sedimentation當(dāng)前第48頁(yè)\共有80頁(yè)\編于星期四\21點(diǎn)細(xì)胞生物學(xué)二、細(xì)胞內(nèi)核酸、蛋白質(zhì)、糖與脂質(zhì)等成分的顯示方法１、DNA經(jīng)1N鹽酸水解，其上的嘌呤堿和脫氧核糖之間的鍵打開(kāi)，使脫氧核糖的第一碳原子上形成游離的醛基，這些醛基與Schiff試劑反應(yīng)。Schiff試劑是由堿性品紅和偏重亞硫酸鈉相作用，形成無(wú)色的品紅液，當(dāng)無(wú)色品紅與醛基結(jié)合形成紫紅色的化合物。因此凡有DNA的地方，都能顯示紫紅色。２、四氧化鋨與不飽和的脂肪酸反應(yīng)呈黑色，證明脂肪滴的存在，蘇丹Ⅲ使脂滴呈深紅３、蛋白質(zhì)定性：米倫反應(yīng)，重氮反應(yīng)當(dāng)前第49頁(yè)\共有80頁(yè)\編于星期四\21點(diǎn)細(xì)胞生物學(xué)三、特異蛋白抗原的定位與定性(一)免疫熒光技術(shù)將試劑抗原或試劑抗體用熒光素進(jìn)行標(biāo)記，試劑與標(biāo)本中相應(yīng)的抗體或抗原反應(yīng)后，測(cè)定復(fù)合物中的熒光素，這種免疫技術(shù)，稱為免疫熒光素技術(shù)。常用的標(biāo)記物有熒光素和酶。免疫熒光法（immunofluorescenttechnique）：常用的螢光素有異硫氰酸熒光素、羅丹明等。酶標(biāo)免疫法（enzyme-labeledantibodymethod）：常用的酶有辣根過(guò)氧化物酶，酶與底物發(fā)生反應(yīng)后形成不透明的沉積物，從而顯示出抗原存在的部位。當(dāng)前第50頁(yè)\共有80頁(yè)\編于星期四\21點(diǎn)細(xì)胞生物學(xué)間接法原理示意圖當(dāng)前第51頁(yè)\共有80頁(yè)\編于星期四\21點(diǎn)細(xì)胞生物學(xué)補(bǔ)體結(jié)合法原理示意圖當(dāng)前第52頁(yè)\共有80頁(yè)\編于星期四\21點(diǎn)細(xì)胞生物學(xué)(二)免疫電鏡技術(shù)又稱為免疫細(xì)胞化學(xué)技術(shù)是在免疫組織化學(xué)技術(shù)的基礎(chǔ)上發(fā)展起來(lái)的，它是利用抗原與抗體特異性結(jié)合的原理，在超微結(jié)構(gòu)水平上定位、定性及半定量抗原的技術(shù)方法。該方法為精確定位各種抗原的存在部位、研究細(xì)胞結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系及其在病理情況下所發(fā)生的變化提供了有效的手段。免疫電鏡技術(shù)主要經(jīng)歷了鐵蛋白標(biāo)記技術(shù)、酶標(biāo)記技術(shù)以及膠體金標(biāo)記技術(shù)三個(gè)主要發(fā)展階段。

當(dāng)前第53頁(yè)\共有80頁(yè)\編于星期四\21點(diǎn)細(xì)胞生物學(xué)鐵蛋白標(biāo)記技術(shù)適用于細(xì)胞膜表面抗原的定位，由于其分子量較大，不易穿透細(xì)胞膜，定位細(xì)胞內(nèi)抗原較為困難。鐵蛋白對(duì)電鏡包埋劑的非特異性吸附很強(qiáng)，不適用于包埋后免疫標(biāo)記，使其應(yīng)用受到一定限制。當(dāng)前第54頁(yè)\共有80頁(yè)\編于星期四\21點(diǎn)細(xì)胞生物學(xué)酶標(biāo)記免疫電鏡技術(shù)是將酶（主要是過(guò)氧化物酶）與抗體相交聯(lián)，抗原抗體反應(yīng)后，加底物顯示酶的活性部位，酶反應(yīng)產(chǎn)物經(jīng)OsO4處理變?yōu)榫哂幸欢娮用芏鹊匿~黑，可在電鏡下觀察。過(guò)氧化物酶的相對(duì)分子量較小，與其交聯(lián)的抗體較易穿透經(jīng)處理的細(xì)胞膜，可用于細(xì)胞內(nèi)抗原的定位。但是酶反應(yīng)產(chǎn)物比較彌散，因此分辨率不如顆粒性標(biāo)記物高。

當(dāng)前第55頁(yè)\共有80頁(yè)\編于星期四\21點(diǎn)細(xì)胞生物學(xué)膠體金標(biāo)記免疫電鏡技術(shù)是目前應(yīng)用最廣的免疫電鏡標(biāo)記物，該技術(shù)是將膠體金作為抗體的標(biāo)記物，用于細(xì)胞表面和細(xì)胞內(nèi)多種抗原的精確定位。膠體金主要具有以下幾個(gè)優(yōu)點(diǎn)：（1）膠體金能穩(wěn)定并迅速地吸附蛋白，而且蛋白的生物活性不發(fā)生明顯改變，可制備抗體-膠體金、蛋白A-膠體金、卵白素-膠體金、植物凝集素-膠體金等用于免疫電鏡；（2）在電鏡下金顆粒電子密度高、圓形且界線清晰，易于辨認(rèn)，定位比酶反應(yīng)物更精確；（3）膠體金標(biāo)記物易于制備，并可以根據(jù)需要制備大小不同（1～150nm）的膠體金，因此可進(jìn)行免疫電鏡的雙重或多重標(biāo)記；（4）金顆粒能發(fā)射強(qiáng)烈的二次電子，是掃描電鏡的理想標(biāo)記物；（5）膠體金經(jīng)過(guò)銀顯影增強(qiáng)后，金顆粒外周吸附大量銀顆粒而呈現(xiàn)黑色或黑褐色，因此也能用于光學(xué)顯微鏡觀察。此外，膠體金還能用于冷凍蝕刻標(biāo)本的免疫標(biāo)記。

當(dāng)前第56頁(yè)\共有80頁(yè)\編于星期四\21點(diǎn)細(xì)胞生物學(xué)四、細(xì)胞內(nèi)特異核酸序列的定位與定性具有互補(bǔ)核苷酸序列的兩條單鏈核苷酸分子片段，在適當(dāng)條件下，通過(guò)氫鍵結(jié)合，形成DNA-DNA，DNA-RNA或RNA-RNA雜交的雙鏈分子。這種技術(shù)可用來(lái)測(cè)定單鏈分子核苷酸序列間是否具有互補(bǔ)關(guān)系。（一）原位雜交（insituhybridization）用于檢測(cè)染色體上的特殊DNA序列。最初是使用帶放射性的DNA探針，后來(lái)又發(fā)明了免疫探針?lè)?。?dāng)前第57頁(yè)\共有80頁(yè)\編于星期四\21點(diǎn)細(xì)胞生物學(xué)（二）Southern雜交是體外分析特異DNA序列的方法，操作時(shí)先用限制性內(nèi)切酶將核DNA或線粒體DNA切成DNA片段，經(jīng)凝膠電泳分離后，轉(zhuǎn)移到醋酸纖維薄膜上，再用探針雜交，通過(guò)放射自顯影，即可辨認(rèn)出與探針互補(bǔ)的特殊核苷序列。將RNA轉(zhuǎn)移到薄膜上，用探針雜交，則稱為Northern雜交。當(dāng)前第58頁(yè)\共有80頁(yè)\編于星期四\21點(diǎn)細(xì)胞生物學(xué)五、應(yīng)用放射自顯影技術(shù)研究生物大分子在細(xì)胞內(nèi)的合成動(dòng)態(tài)用于研究標(biāo)記化合物在機(jī)體、組織和細(xì)胞中的分布、定位、排出以及合成、更新、作用機(jī)理、作用部位等等。原理：將放射性同位素標(biāo)記的化合物導(dǎo)入生物體內(nèi)，經(jīng)過(guò)一段時(shí)間后，制取切片，涂上鹵化銀乳膠，經(jīng)放射性曝光，使乳膠感光。一般用14C和3H標(biāo)記。常用3H-TDR來(lái)顯示DNA，用3H-UDR顯示RNA；用3H氨基酸研究蛋白質(zhì)，用3H甘露糖、3H巖藻糖研究多糖。14C半衰期為5730年，3H為12.5年。當(dāng)前第59頁(yè)\共有80頁(yè)\編于星期四\21點(diǎn)細(xì)胞生物學(xué)六、定量細(xì)胞化學(xué)分析技術(shù)（一）流式細(xì)胞術(shù)用途：對(duì)單個(gè)細(xì)胞進(jìn)行快速定量分析與分選的一門技術(shù)。原理：包在鞘液中的細(xì)胞通過(guò)高頻振蕩控制的噴嘴，形成包含單個(gè)細(xì)胞的液滴，在激光束的照射下，這些細(xì)胞發(fā)出散射光和熒光，經(jīng)探測(cè)器檢測(cè)，轉(zhuǎn)換為電信號(hào)，送入計(jì)算機(jī)處理，輸出統(tǒng)計(jì)結(jié)果，并可根據(jù)這些性質(zhì)分選出高純度的細(xì)胞亞群，分離純度可達(dá)99%。包被細(xì)胞的液流稱為鞘液，所用儀器稱為流式細(xì)胞計(jì)（flowcytometer）。當(dāng)前第60頁(yè)\共有80頁(yè)\編于星期四\21點(diǎn)細(xì)胞生物學(xué)當(dāng)前第61頁(yè)\共有80頁(yè)\編于星期四\21點(diǎn)細(xì)胞生物學(xué)（二）顯微分光光度測(cè)定技術(shù)細(xì)胞中有一些成分具有特定的吸收光譜，核酸、蛋白質(zhì)、細(xì)胞色素、維生素等都有自己特征性的吸收曲線。可利用顯微分光光度計(jì)對(duì)某些成分進(jìn)行定位、定性和定量測(cè)定。當(dāng)前第62頁(yè)\共有80頁(yè)\編于星期四\21點(diǎn)細(xì)胞生物學(xué)七、PCR技術(shù)PCR即：polymerasechainreaction。反應(yīng)體系：①樣品DNA；②引物（primer），約15-20個(gè)核苷酸；③4種dNTP；④TagDNA聚合酶，來(lái)自于嗜熱水生菌Thermusaquaticus，最適作用溫度75~80℃，短時(shí)間在95℃下不失活。⑤緩沖體系和Mg2+。反應(yīng)過(guò)程：①變性：約90-95℃；②復(fù)性：約60℃左右；③延伸：70-75℃；④重復(fù)“變性——復(fù)性——延伸”過(guò)程20-30次循環(huán)。當(dāng)前第63頁(yè)\共有80頁(yè)\編于星期四\21點(diǎn)細(xì)胞生物學(xué)PCR原理當(dāng)前第64頁(yè)\共有80頁(yè)\編于星期四\21點(diǎn)細(xì)胞生物學(xué)第三節(jié)細(xì)胞培養(yǎng)、細(xì)胞工程與顯微操作技術(shù)一、細(xì)胞培養(yǎng)（一）動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)群體培養(yǎng)（massculture）：將含有一定數(shù)量細(xì)胞的懸液置于培養(yǎng)瓶中，讓細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)，匯合（confluence）后形成均勻的單細(xì)胞層；克隆培養(yǎng)（clonalculture）：培養(yǎng)高度稀釋的細(xì)胞懸液，細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)，每一個(gè)細(xì)胞形成一個(gè)細(xì)胞集落，稱為克隆。轉(zhuǎn)鼓培養(yǎng)法：為制取細(xì)胞產(chǎn)品而設(shè)計(jì)，大容量旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)，使培養(yǎng)的細(xì)胞始終處于懸浮狀態(tài)之中。當(dāng)前第65頁(yè)\共有80頁(yè)\編于星期四\21點(diǎn)細(xì)胞生物學(xué)原代培養(yǎng)（primaryculture）：即：培養(yǎng)直接來(lái)自動(dòng)物機(jī)體的細(xì)胞群，將細(xì)胞從一個(gè)培養(yǎng)瓶轉(zhuǎn)移到另外一個(gè)培養(yǎng)瓶稱為傳代或傳代培養(yǎng)（Passage）。細(xì)胞株（cellstrain）：從原代培養(yǎng)細(xì)胞群中篩選出的具有特定性質(zhì)或標(biāo)志的細(xì)胞群。細(xì)胞系（cellline）：從腫瘤組織培養(yǎng)建立的細(xì)胞群或培養(yǎng)過(guò)程中發(fā)生突變或轉(zhuǎn)化的細(xì)胞，可無(wú)限繁殖?？寺。╟lone）：亦稱無(wú)性系。指由同一個(gè)祖先細(xì)胞通過(guò)有絲分裂產(chǎn)生的遺傳性狀一致的細(xì)胞群。當(dāng)前第66頁(yè)\共有80頁(yè)\編于星期四\21點(diǎn)細(xì)胞生物學(xué)細(xì)胞系名稱細(xì)胞類型來(lái)源3T3成纖維細(xì)胞小鼠HeLa宮頸癌上皮細(xì)胞HenriettaLacksBHK21成纖維細(xì)胞敘利亞倉(cāng)鼠PtKl上皮細(xì)胞袋鼠L6成肌細(xì)胞大鼠PCI2嗜鉻細(xì)胞大鼠SP2漿細(xì)胞小鼠SP2／0骨髓瘤漿細(xì)胞小鼠CHO卵巢細(xì)胞中國(guó)地鼠實(shí)驗(yàn)室中常用的幾種細(xì)胞系當(dāng)前第67頁(yè)\共有80頁(yè)\編于星期四\21點(diǎn)細(xì)胞生物學(xué)（二）植物細(xì)胞培養(yǎng)外植體培養(yǎng)：誘發(fā)產(chǎn)生愈傷組織。用于研究植物的生長(zhǎng)發(fā)育、分化和變異；進(jìn)行無(wú)性繁殖；制取代謝產(chǎn)物。懸浮細(xì)胞培養(yǎng)：適合于進(jìn)行產(chǎn)業(yè)化大規(guī)模細(xì)胞培養(yǎng)，制取植物代謝產(chǎn)物。原生質(zhì)體培養(yǎng)：培養(yǎng)脫壁后的細(xì)胞，特點(diǎn)：①比較容易攝取外來(lái)的遺傳物質(zhì)，如DNA；②便于進(jìn)行細(xì)胞融合，形成雜交細(xì)胞；③適宜條件下可產(chǎn)生細(xì)胞壁，經(jīng)誘導(dǎo)分化成完整植株。單倍體培養(yǎng)：通過(guò)花藥或花粉培養(yǎng)可獲得單倍體植株。當(dāng)前第68頁(yè)\共有80頁(yè)\編于星期四\21點(diǎn)細(xì)胞生物學(xué)AnimalCellCulture當(dāng)前第69頁(yè)\共有80頁(yè)\編于星期四\21點(diǎn)細(xì)胞生物學(xué)二、細(xì)胞工程（一）細(xì)胞融合通過(guò)培養(yǎng)和介導(dǎo)，兩個(gè)或多個(gè)細(xì)胞合并成一個(gè)雙核或多核細(xì)胞的過(guò)程稱為細(xì)胞融合（cellfusion）或細(xì)胞雜交。同核體：相同基因型的細(xì)胞融合而成。異核體：不同基因型的細(xì)胞融合而成。自發(fā)融合：同種細(xì)胞在培養(yǎng)過(guò)程中自發(fā)合并的現(xiàn)象。誘發(fā)融合：異種間的細(xì)胞必須經(jīng)誘導(dǎo)劑處理才能融合。誘導(dǎo)細(xì)胞融合的方法：生物方法（仙臺(tái)病毒、副流感病毒和新城雞瘟病毒）、化學(xué)方法（聚乙二醇PEG）、物理方法（電擊和激光）。當(dāng)前第70頁(yè)\共有80頁(yè)\編于星期四\21點(diǎn)細(xì)胞生物學(xué)單克隆抗體技術(shù)正常淋巴細(xì)胞（如小鼠脾細(xì)胞）具有分泌抗體的能力，但不能長(zhǎng)期培養(yǎng)，瘤細(xì)胞（如骨髓瘤）可以在體外長(zhǎng)期培養(yǎng)，但不分泌抗體。于是英國(guó)人Kohler和Milstein1975將兩種細(xì)胞雜交而創(chuàng)立了單克隆抗體技術(shù)，獲1984年諾貝爾獎(jiǎng)。當(dāng)前第71頁(yè)\共有80頁(yè)\編于星期四\21點(diǎn)細(xì)胞生物學(xué)（三）細(xì)胞拆合與顯微操作技術(shù)１、物理法：用機(jī)械方法或短光波把細(xì)胞核去掉或使之失活，然后用微吸管吸取其他細(xì)胞的核，注入去核的細(xì)胞質(zhì)中，組成新的雜交細(xì)胞。２、化學(xué)法：用細(xì)胞松弛素B處理細(xì)胞，細(xì)胞出現(xiàn)排核現(xiàn)象，再結(jié)合離心技術(shù)，將細(xì)胞拆分為核體和胞質(zhì)體兩部分，由于核體外表包有一層細(xì)胞質(zhì)膜和少量的胞漿，因而在PEG或仙臺(tái)病毒的介導(dǎo)下，核體可與另一胞質(zhì)體融合，形成重組細(xì)胞。當(dāng)前第72頁(yè)\共有80頁(yè)\編于星期四\21點(diǎn)細(xì)胞生物學(xué)第四節(jié)用于細(xì)胞生物學(xué)研究的模式生物

生物學(xué)家通過(guò)對(duì)選定的生物物種進(jìn)行科學(xué)研究，用于揭示某種具有普遍規(guī)律的生命現(xiàn)象，此時(shí)，這種被選定的生物物種就是模式生物。比如，孟德?tīng)栐诮沂旧锝邕z傳規(guī)律時(shí)選用豌豆作為實(shí)驗(yàn)材料，而摩根選用果蠅作為實(shí)驗(yàn)材料，在他們的研究中，豌豆和果蠅就是研究生物體遺傳規(guī)律