第三部分細(xì)胞培養(yǎng)與細(xì)胞融合詳解演示文稿

第三部分細(xì)胞培養(yǎng)與細(xì)胞融合詳解演示文稿當(dāng)前第1頁\共有71頁\編于星期五\22點(diǎn)優(yōu)選第三部分細(xì)胞培養(yǎng)與細(xì)胞融合當(dāng)前第2頁\共有71頁\編于星期五\22點(diǎn)3第一部分植物細(xì)胞分離與培養(yǎng)1、物理方法2、化學(xué)方法3、酶法一、植物細(xì)胞的分離當(dāng)前第3頁\共有71頁\編于星期五\22點(diǎn)41、物理方法將疏松的愈傷組織放入液體培養(yǎng)基中，經(jīng)搖床不斷振動，使細(xì)胞分散。若向細(xì)胞懸浮液中吹入脈沖壓縮氣體，細(xì)胞分散的更好。2、化學(xué)方法是在細(xì)胞懸浮培養(yǎng)中加入草酸鹽（能結(jié)合細(xì)胞間質(zhì)中果膠鈣的鈣離子）、秋水仙素（0.1mmol/L）或2,4-D或水解乳蛋白（對細(xì)胞分散有一定的作用）。3、酶法利用果膠酶和纖維素酶使細(xì)胞分離。當(dāng)前第4頁\共有71頁\編于星期五\22點(diǎn)5單細(xì)胞培養(yǎng)：平板培養(yǎng)、看護(hù)培養(yǎng)、液體淺層培養(yǎng)、微室培養(yǎng)（微滴培養(yǎng)）等據(jù)培養(yǎng)基形態(tài)：分為固體培養(yǎng)與液體培養(yǎng)（懸浮培養(yǎng)）細(xì)胞固定化培養(yǎng)：

二、植物細(xì)胞的培養(yǎng)當(dāng)前第5頁\共有71頁\編于星期五\22點(diǎn)6此法適用于難于培養(yǎng)的植物種類

優(yōu)點(diǎn)：簡便、成功率高缺點(diǎn)：不能在顯微鏡下直接觀察當(dāng)前第6頁\共有71頁\編于星期五\22點(diǎn)7優(yōu)點(diǎn)：可以連續(xù)觀察細(xì)胞的分化和發(fā)育；缺點(diǎn)：通氣性差，水分難保持，pH易變動。

當(dāng)前第7頁\共有71頁\編于星期五\22點(diǎn)8一）、懸浮培養(yǎng)(suspensionculture)

定義：是指將單個游離細(xì)胞或小細(xì)胞團(tuán)在液體培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)增殖的技術(shù)。懸浮培養(yǎng)的過程當(dāng)前第8頁\共有71頁\編于星期五\22點(diǎn)9一是增加培養(yǎng)細(xì)胞與培養(yǎng)液的接觸面，改善營養(yǎng)供應(yīng)；二是在振蕩條件下可避免細(xì)胞代謝產(chǎn)生的有害物質(zhì)在局部積累而對細(xì)胞自身產(chǎn)生毒害；三是振蕩培養(yǎng)可以適當(dāng)改善氣體的交換；1、懸浮培養(yǎng)的優(yōu)點(diǎn)：當(dāng)前第9頁\共有71頁\編于星期五\22點(diǎn)10懸浮培養(yǎng)物分散性良好，細(xì)胞團(tuán)較??；均一性好，細(xì)胞形狀和細(xì)胞團(tuán)大小大致相同；細(xì)胞生長迅速（2～3天加倍）。2、一個成功的懸浮細(xì)胞培養(yǎng)體系必須滿足怎樣的條件？當(dāng)前第10頁\共有71頁\編于星期五\22點(diǎn)113、懸浮細(xì)胞培養(yǎng)方法

分披培養(yǎng)法

半連續(xù)培養(yǎng)法

連續(xù)培養(yǎng)法當(dāng)前第11頁\共有71頁\編于星期五\22點(diǎn)12起始愈傷組織的質(zhì)量；接種細(xì)胞密度；培養(yǎng)條件：方式、溫度；繼代周期。4、影響懸浮細(xì)胞生長的因素有哪些？當(dāng)前第12頁\共有71頁\編于星期五\22點(diǎn)13定義：即把細(xì)胞固定在一種惰性基質(zhì)上，細(xì)胞不能運(yùn)動而培養(yǎng)液可在細(xì)胞間流動以供應(yīng)營養(yǎng)。按照其支持物不同可以分為兩大類：

A、包埋式固定化培養(yǎng)系統(tǒng)：瓊脂、瓊脂糖、藻酸鹽、聚丙烯酰胺；B、附著式固定化培養(yǎng)系統(tǒng)：尼龍網(wǎng)、聚氨酯泡沫、中空纖維。二）、細(xì)胞固定化培養(yǎng)

固定化細(xì)胞培養(yǎng)特點(diǎn)（見P112)當(dāng)前第13頁\共有71頁\編于星期五\22點(diǎn)14流化床生物反應(yīng)器：細(xì)胞包裹在膠粒、泡沫顆粒中，通入空氣使固定化細(xì)胞懸浮于反應(yīng)器中。填充床生物反應(yīng)器：細(xì)胞固定在膠粒、泡沫顆?；蜻B續(xù)的多個網(wǎng)中，細(xì)胞固定不動，通過流動的培養(yǎng)液傳質(zhì)。常見的幾種固定化培養(yǎng)系統(tǒng)出口進(jìn)口填充床生物反應(yīng)器出口進(jìn)口流化床生物反應(yīng)器當(dāng)前第14頁\共有71頁\編于星期五\22點(diǎn)15膜生物反應(yīng)器：－－常見的是中空纖維和螺線式卷繞反應(yīng)器，傳質(zhì)效率低，易阻塞，產(chǎn)物收獲較困難，投資大。細(xì)胞細(xì)胞營養(yǎng)物入口營養(yǎng)物入口營養(yǎng)物出口營養(yǎng)物出口營養(yǎng)物質(zhì)中空纖維反應(yīng)器螺線式卷繞反應(yīng)器當(dāng)前第15頁\共有71頁\編于星期五\22點(diǎn)16三、植物細(xì)胞培養(yǎng)的應(yīng)用

植物細(xì)胞含有人類所需的成分，包括初生代謝物（蛋白質(zhì)、碳水化合物、脂肪等）和次生代謝物（多酚類、香精油、生物堿、樹脂等），傳統(tǒng)提取分離這些物質(zhì)由于資源短缺和需求量的加大，難以滿足需求，通過細(xì)胞培養(yǎng)生產(chǎn)植物產(chǎn)品成為解決的有效途徑。

當(dāng)前第16頁\共有71頁\編于星期五\22點(diǎn)171、生產(chǎn)藥用代謝產(chǎn)物生物堿（吡啶、喹啉、嗎啡）、蛋白質(zhì)類（氨基酸、植物抗生素、胰島素）、酚類化合物（黃酮類、單酚類、醌類）、萜類化合物（三萜皂甙、甾體皂甙、單萜、倍半萜、二萜）等。豆杉細(xì)胞紫杉醇（抗癌藥物）紫草細(xì)胞紫草寧（燒傷、痔瘡）例子：苦瓜細(xì)胞胰島素聚合草愈傷組織L-谷氨酰胺當(dāng)前第17頁\共有71頁\編于星期五\22點(diǎn)182、生產(chǎn)天然食品、食品添加劑色素（胡蘿卜素、葉黃素、單寧）、甜味劑（甜菊苷）、香料物質(zhì)、飲料（可可堿、咖啡堿）等；3、生產(chǎn)殺蟲劑、殺菌劑萬壽菊細(xì)胞中獲得農(nóng)藥噻吩烷；除蟲菊的愈傷組織中得到除蟲菊脂；香草細(xì)胞中分離到魚藤酮?dú)⑾x劑等；4、生產(chǎn)飼料、精細(xì)化工產(chǎn)品桑細(xì)胞培養(yǎng)養(yǎng)蠶飼料銀膠菌細(xì)胞培養(yǎng)橡膠當(dāng)前第18頁\共有71頁\編于星期五\22點(diǎn)191、兩步培養(yǎng)技術(shù)（使用兩個反應(yīng)器）四、細(xì)胞培養(yǎng)中提高代謝產(chǎn)物的技術(shù)(1)第一個用于細(xì)胞生物量的累積，即盡可能快的使細(xì)胞量增長，用維持培養(yǎng)基；(2)第二個用于次級代謝產(chǎn)物的生產(chǎn)，即誘發(fā)和保持次生代謝旺盛并積累相應(yīng)代謝產(chǎn)物，一般用生產(chǎn)培養(yǎng)基。當(dāng)前第19頁\共有71頁\編于星期五\22點(diǎn)202、固定化培養(yǎng)技術(shù)

應(yīng)用淀粉、瓊脂、瓊脂糖、藻酸鈉、聚丙烯酰胺等作載體，將細(xì)胞固定在珠狀膠囊或各種形狀的支持物上。含CaCl2的培養(yǎng)基蓋子空氣出口海藻酸鈉+細(xì)胞懸浮液噴嘴無菌空氣入口當(dāng)前第20頁\共有71頁\編于星期五\22點(diǎn)21

在培養(yǎng)體系中加入水溶性和脂溶性有機(jī)物，或是具有吸附作用的多聚化合物（如大孔樹脂等），使培養(yǎng)體系形成上、下兩相，細(xì)胞在水相中生長和合成次生物質(zhì)，次生物質(zhì)分泌出來轉(zhuǎn)到有機(jī)相中。3兩相培養(yǎng)技術(shù)(2)前提條件：a添加的有機(jī)物無毒害作用

b產(chǎn)物溶于有機(jī)物或被其吸收

c兩相易分離，有利于產(chǎn)物回收

d有機(jī)物等不吸收培養(yǎng)基中的有效成分當(dāng)前第21頁\共有71頁\編于星期五\22點(diǎn)22(1)誘導(dǎo)劑：

可引起代謝途徑改變或代謝強(qiáng)度改變的物質(zhì),

如無機(jī)離子、真菌提取液、葡聚糖等。

作用機(jī)理:

可以調(diào)節(jié)代謝進(jìn)程某些酶的活性,并對某些關(guān)鍵酶在轉(zhuǎn)錄水平上進(jìn)行調(diào)節(jié)。4加入誘導(dǎo)劑及前體物當(dāng)前第22頁\共有71頁\編于星期五\22點(diǎn)23作用：消除關(guān)鍵酶的阻礙、阻斷內(nèi)源性中間體的分隔和有效貯存，大大提高次生代謝物的產(chǎn)量。(2)前體物煙草：加入天仙子胺，則尼古丁產(chǎn)量降低而新煙堿含量大大提高當(dāng)前第23頁\共有71頁\編于星期五\22點(diǎn)24第二部分

動物細(xì)胞分離與培養(yǎng)

在活體內(nèi)，動物細(xì)胞的形態(tài)與其功能密切相關(guān)。如肌細(xì)胞呈纖維狀，便于收縮；神經(jīng)細(xì)胞發(fā)出許多分支，便于形成網(wǎng)絡(luò)；紅細(xì)胞呈圓盤狀，便于氣體交換；上皮細(xì)胞呈不規(guī)則狀，便于覆蓋在器官表面相互擠壓。當(dāng)前第24頁\共有71頁\編于星期五\22點(diǎn)25原代培養(yǎng)（primaryculture):將組織取出來后，先用胰蛋白酶等使組織分散成單個細(xì)胞，然后配制成一定濃度的細(xì)胞懸浮液，再將該懸浮液放入培養(yǎng)瓶中，在培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，這個過程稱為原代培養(yǎng)。當(dāng)前第25頁\共有71頁\編于星期五\22點(diǎn)26雞胚原代細(xì)胞：在無菌條件下采取9－10日齡雞胚↓除去頭(或僅除去喙和眼)、爪和內(nèi)臟，并剪成塊↓用Hanks液等充分沖洗↓剪將其剪成lmm大小的碎塊↓加入Hanks液或其他洗液，充分沖洗↓約4倍量的0.25％胰酶，并調(diào)整pH至7.6－7.8↓37℃水浴中感作30分鐘，每10分鐘輕輕搖動一次↓吸棄上層胰酶溶液↓用洗液輕洗2次后↓吸管充分吹打，直至形成均勻的細(xì)胞懸液↓準(zhǔn)備細(xì)胞計數(shù)↓單層細(xì)胞培養(yǎng)當(dāng)前第26頁\共有71頁\編于星期五\22點(diǎn)27傳（繼）代培養(yǎng)（secondaryculture,passage,split):細(xì)胞在培養(yǎng)瓶中貼壁生長。隨著細(xì)胞的生長和增殖，培養(yǎng)瓶中的細(xì)胞越來越多，需要定期地用胰蛋白酶使細(xì)胞從瓶壁上脫離下來，配制成細(xì)胞懸浮液，分裝到兩個或兩個以上的培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)，這稱為傳代培養(yǎng)。當(dāng)前第27頁\共有71頁\編于星期五\22點(diǎn)28在離體條件下，細(xì)胞一般表現(xiàn)為三種形態(tài)：（1）貼壁依賴型（anchorage-dependent)細(xì)胞；（2）非貼壁依賴型（anchorage-independent)細(xì)胞：也稱為懸浮型細(xì)胞，包括來源于血液的細(xì)胞和許多腫瘤細(xì)胞。（3）兼性貼壁細(xì)胞：主要是一些細(xì)胞系，如CHO細(xì)胞。當(dāng)前第28頁\共有71頁\編于星期五\22點(diǎn)29一、動物細(xì)胞體外培養(yǎng)的方法懸浮培養(yǎng)貼壁培養(yǎng)固定化培養(yǎng)大規(guī)模培養(yǎng)法當(dāng)前第29頁\共有71頁\編于星期五\22點(diǎn)30類似于微生物發(fā)酵培養(yǎng)，但對機(jī)械剪切力敏感，常采用轉(zhuǎn)瓶和搖瓶培養(yǎng)方式。缺點(diǎn)：培養(yǎng)細(xì)胞密度低且易發(fā)生變異1、懸浮培養(yǎng)當(dāng)前第30頁\共有71頁\編于星期五\22點(diǎn)312、貼壁培養(yǎng)貼壁培養(yǎng)

指必須將細(xì)胞帖附在固體介質(zhì)表面上（帶適量正電荷）才能進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)的方式，包括成纖維型細(xì)胞（如肌細(xì)胞)、上皮型細(xì)胞(如皮膚表皮細(xì)胞)。細(xì)胞貼壁培養(yǎng)過程

貼壁因子吸附于培養(yǎng)表面、細(xì)胞與表面接觸、細(xì)胞貼附于培養(yǎng)表面和細(xì)胞在培養(yǎng)表面上擴(kuò)展等幾個過程。當(dāng)前第31頁\共有71頁\編于星期五\22點(diǎn)32細(xì)胞貼壁的過程：當(dāng)前第32頁\共有71頁\編于星期五\22點(diǎn)33貼壁培養(yǎng)正常細(xì)胞在生長過程中隨著細(xì)胞數(shù)量不斷增多，生長空間日趨減少，細(xì)胞相互接觸匯合成片，呈現(xiàn)接觸抑制現(xiàn)象（Contactinhibition），而惡性細(xì)胞則無接觸抑制現(xiàn)象，因此接觸抑制可作為區(qū)分正常與癌細(xì)胞標(biāo)志之一。癌細(xì)胞則由于營養(yǎng)成分的消耗和細(xì)胞代謝產(chǎn)物的影響而發(fā)生密度抑制（Densityinhibition）當(dāng)前第33頁\共有71頁\編于星期五\22點(diǎn)34容易更換培養(yǎng)基；可采用灌注培養(yǎng)；方便產(chǎn)物表達(dá)；方便調(diào)節(jié)培養(yǎng)液與細(xì)胞的比例；易于觀察等。細(xì)胞貼壁生長優(yōu)點(diǎn)當(dāng)前第34頁\共有71頁\編于星期五\22點(diǎn)35滾瓶系統(tǒng)培養(yǎng)

操作簡單，重復(fù)性好，但單位體積提供細(xì)胞生長的表面積小，產(chǎn)量低，監(jiān)測難。微載體培養(yǎng)

細(xì)胞貼附在微載體表面生長成細(xì)胞單層，而微載體懸浮于培養(yǎng)基中，綜合了單層培養(yǎng)與懸浮培養(yǎng)的優(yōu)點(diǎn)。貼壁培養(yǎng)細(xì)胞培養(yǎng)方法當(dāng)前第35頁\共有71頁\編于星期五\22點(diǎn)363、固定化細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)固定化細(xì)胞培養(yǎng)（immobilizationculture)是指采用吸附（固體吸附劑）、共價貼附（與固相載體結(jié)合）、共價交連（用試劑處理形成細(xì)胞絮結(jié)）、包埋（將細(xì)胞包埋在多孔材料內(nèi)）和微囊化等方法將細(xì)胞固定在支持物上，或形成細(xì)胞絮結(jié)，或?qū)⒓?xì)胞嵌入微囊或高分子聚合物的網(wǎng)絡(luò)中進(jìn)行培養(yǎng)。該方法對貼壁依賴性細(xì)胞與非貼壁依賴性細(xì)胞均適用。

當(dāng)前第36頁\共有71頁\編于星期五\22點(diǎn)374、大規(guī)模培養(yǎng)技術(shù)

動物細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)技術(shù)（large-scaleculturetechnique)是指在動物細(xì)胞生物反應(yīng)器中大量地培養(yǎng)動物細(xì)胞以獲得生物制品的技術(shù)。主要包括：微載體（microcarrier)培養(yǎng)技術(shù)中空纖維(hollowfiber)培養(yǎng)技術(shù)微囊化(micro-encapsulation)技術(shù)

當(dāng)前第37頁\共有71頁\編于星期五\22點(diǎn)38（1）微載體培養(yǎng)技術(shù)微載體是指直徑在60-250μm的微珠、能夠適用于貼壁細(xì)胞生長，細(xì)胞貼壁于微載體上，微載體(和細(xì)胞)懸浮于培養(yǎng)基中，細(xì)胞在微載體表面逐漸生長成單層。優(yōu)點(diǎn)：是表面積與體積比大、可攪拌、便于顯微觀察、占用空間小、易放大；具有單層培養(yǎng)和懸浮培養(yǎng)的特點(diǎn)；缺點(diǎn)：是培養(yǎng)液用量大。玻璃微珠當(dāng)前第38頁\共有71頁\編于星期五\22點(diǎn)39微載體的主要特性微載體的大?。和ǔＶ睆皆?00-200微米之間。微載體的密度：在慢速（40-50rpm)攪拌下，一般為1.03-1.05g/cm3微載體的表面電荷：表面電荷密度應(yīng)適中，太低不利于細(xì)胞貼附；太高則有細(xì)胞毒性。當(dāng)前第39頁\共有71頁\編于星期五\22點(diǎn)40微載體的種類以交連葡聚糖為基質(zhì)的微載體：DEAE-交連葡聚糖微載體、cytodex2微載體、dormacell微載體、cytodex3微載體等。以塑料為基質(zhì)的微載體：聚苯乙烯微載體、聚苯烯酰胺微載體。明膠(gelatin)微載體以玻璃為基質(zhì)的微載體以纖維素為基質(zhì)的微載體（DE-52、DE-53）液膜微載體（形成聚賴氨酸微液珠）大孔微載體（載體內(nèi)部有大孔互相連通）當(dāng)前第40頁\共有71頁\編于星期五\22點(diǎn)41（2）中空纖維培養(yǎng)技術(shù)中空纖維培養(yǎng)技術(shù)由Knazek于1972年研制成功?？招睦w維的材料是聚砜或聚丙烯等高分子物質(zhì)。纖維壁為半透膜。數(shù)百或數(shù)千條纖維捆成一束并集中開口，培養(yǎng)液從管腔流過，細(xì)胞貼附在纖維外壁生長。當(dāng)前第41頁\共有71頁\編于星期五\22點(diǎn)42（3）微囊化技術(shù)微囊化培養(yǎng)由Lim等于1981年提出，其原理是采用一層親水性的半透膜將細(xì)胞包圍在珠狀的微囊內(nèi)，因而降低了培養(yǎng)液對細(xì)胞的剪切力，培養(yǎng)密度高。目前采用最多的是多聚賴氨酸/海藻酸法（PLL/ALG法），通過氯化鈣成囊，再用檸檬酸液化。缺點(diǎn)：成囊技術(shù)較難，成功率約50%。當(dāng)前第42頁\共有71頁\編于星期五\22點(diǎn)43二、動物細(xì)胞體外生長的要求環(huán)境要求營養(yǎng)要求溫度pH值氣體滲透壓葡萄糖氨基酸無機(jī)鹽維生素動物血清等CO2培養(yǎng)箱當(dāng)前第43頁\共有71頁\編于星期五\22點(diǎn)441）、溫度：不同來源的細(xì)胞，其培養(yǎng)的最適溫度不同。例如，昆蟲及魚類細(xì)胞25-28度，哺乳動物細(xì)胞一般為37度；細(xì)胞對低溫的耐受力比高溫強(qiáng)。溫度除直接影響細(xì)胞生長外，還與培養(yǎng)液的pH值有關(guān)，溫度低時CO2溶解性增加，從而影響pH。環(huán)境要求當(dāng)前第44頁\共有71頁\編于星期五\22點(diǎn)452）、pH值：動物細(xì)胞培養(yǎng)最適pH值為，低于6.8或高于7.6均對細(xì)胞產(chǎn)生嚴(yán)重影響，甚至導(dǎo)致細(xì)胞死亡；一般原代培養(yǎng)的細(xì)胞對pH值要求嚴(yán)格，細(xì)胞系對一定范圍的pH值改變有抵抗力。酚紅是常用的指示劑，用來檢測pH的變化：紅色--pH7.4，橙色--pH7.0，黃色--pH6.5，藍(lán)紅色--pH7.6，紫色--pH7.8。當(dāng)前第45頁\共有71頁\編于星期五\22點(diǎn)463）、氣體：細(xì)胞在培養(yǎng)初期對溶氧要求較少，但在快速增殖（對數(shù)增長期或指數(shù)增長期）要求有較多的溶氧。4）、滲透壓：培養(yǎng)液的滲透壓一般保持在與體液相同的水平，對細(xì)胞較為適宜。例如，生理鹽水或平衡鹽溶液。當(dāng)前第46頁\共有71頁\編于星期五\22點(diǎn)47動物細(xì)胞培養(yǎng)營養(yǎng)要求高，培養(yǎng)液的主要成分：葡萄糖、氨基酸、無機(jī)鹽、維生素和動物血清等。分天然培養(yǎng)基、合成培養(yǎng)基和無血清培養(yǎng)基。營養(yǎng)要求當(dāng)前第47頁\共有71頁\編于星期五\22點(diǎn)481）、天然培養(yǎng)基：來自動物的體液或組織液，早期廣泛采用。例如：血清、血漿、和組織提取液（如雞胚和牛胚浸液）等；優(yōu)點(diǎn)：營養(yǎng)成分豐富，培養(yǎng)效果好，符合細(xì)胞生長的要求；缺點(diǎn)：成分不確定，來源復(fù)雜、有限，不能做到標(biāo)準(zhǔn)化，易發(fā)生支原體污染。當(dāng)前第48頁\共有71頁\編于星期五\22點(diǎn)49血清中含有：①多種蛋白質(zhì)（白蛋白、球蛋白、鐵蛋白等）；②多種金屬離子；③激素；④促貼附物質(zhì)，如纖粘蛋白、冷析球蛋白、膠原等；⑤各種生長因子；⑥轉(zhuǎn)移蛋白；⑦其它不明成分。當(dāng)前第49頁\共有71頁\編于星期五\22點(diǎn)50血清種類及來源：(1)胎牛血清(2)犢牛血清：犢牛出生后，不給吮乳，盡早由頸動脈無菌放血。(3)牛、馬、羊血清：通常由頸靜脈采取，或屠宰時由頸動脈放血采取。(4)其它血清：如兔血清和雞血清等，

當(dāng)前第50頁\共有71頁\編于星期五\22點(diǎn)512）、合成培養(yǎng)基：根據(jù)動物的體液成份和細(xì)胞生長的需要，由各種營養(yǎng)物質(zhì)組合而成，如MEM、DMEM、RPMI1640等。優(yōu)點(diǎn)：能夠標(biāo)準(zhǔn)化生產(chǎn)，組分和含量相對固定，成本低；缺點(diǎn)：不能完全滿足細(xì)胞生長與增殖的需要。因此，在培養(yǎng)時，一般在培養(yǎng)液中加入一定量（10-15%）的血清，為細(xì)胞提供促貼壁因子或促生長因子。3）、無血清培養(yǎng)基當(dāng)前第51頁\共有71頁\編于星期五\22點(diǎn)52第三部分細(xì)胞融合

細(xì)胞融合（cellfusion）是20世紀(jì)60年代創(chuàng)立的，是指在一定條件下，將兩個或多個細(xì)胞融合在一個細(xì)胞的過程，又稱細(xì)胞雜交。當(dāng)前第52頁\共有71頁\編于星期五\22點(diǎn)53注意事項：動物細(xì)胞因沒有細(xì)胞壁，可以直接融合；植物細(xì)胞和微生物細(xì)胞具有細(xì)胞壁不能直接融合，需除去細(xì)胞壁后獲得原生質(zhì)體（protoplast）,而后再進(jìn)行融合，又稱原生質(zhì)體融合。當(dāng)前第53頁\共有71頁\編于星期五\22點(diǎn)54一、細(xì)胞融合的方法：生物法——仙臺病毒法化學(xué)法——PEG等物理法——電融合法當(dāng)前第54頁\共有71頁\編于星期五\22點(diǎn)551、生物法——仙臺病毒法

原理：病毒被膜具有凝聚細(xì)胞的能力，它一邊黏連一個細(xì)胞的表面，另一邊黏連另一個細(xì)胞的表面，從而使兩個細(xì)胞在病毒的作用下靠近發(fā)生凝結(jié)，誘導(dǎo)細(xì)胞的融合。當(dāng)前第55頁\共有71頁\編于星期五\22點(diǎn)562、化學(xué)法主要包括：鹽類融合法（NaNO3）高Ca2+和高pH值誘導(dǎo)法聚乙二醇（PEG）融合法PEG與高Ca2+和高pH值結(jié)合融合法當(dāng)前第56頁\共有71頁\編于星期五\22點(diǎn)571）、鹽類融合法（NaNO3）的原理：

鹽（如NaNO3）能中和原生質(zhì)體表面的電荷，促進(jìn)原生質(zhì)體的聚集，誘導(dǎo)細(xì)胞的融合。鹽類融合劑種類硝酸鹽類：NaNO3、KNO3、Ca(NO3)2氯化物類：NaCl、CaCl2

、MgCl2

、BaCl2葡聚糖硫酸鹽類：葡聚糖硫酸鉀、葡聚糖硫酸鈉當(dāng)前第57頁\共有71頁\編于星期五\22點(diǎn)582）、聚乙二醇（PEG）融合法PEG的作用機(jī)理：

PEG分子具有輕微的負(fù)極性，與具有正極性基團(tuán)的物質(zhì)形成氫鍵，在原生質(zhì)體之間形成分子橋，使原生質(zhì)體發(fā)生粘連進(jìn)而促使原生質(zhì)體的融合。當(dāng)前第58頁\共有71頁\編于星期五\22點(diǎn)59PEG誘導(dǎo)原生質(zhì)體融合過程當(dāng)前第59頁\共有71頁\編于星期五\22點(diǎn)60PEG誘導(dǎo)融合的優(yōu)點(diǎn)與缺點(diǎn)優(yōu)點(diǎn)：融合成本低，勿需特殊設(shè)備；

融合子產(chǎn)生的異核率較高；

融合過程不受物種限制。缺點(diǎn)：

融合過程繁瑣；

PEG可能對細(xì)胞有毒害。當(dāng)前第60頁\共有71頁\編于星期五\22點(diǎn)613、物理法—電融合法

原理：

改變原生質(zhì)體質(zhì)膜表面的電荷和氧化還原電位發(fā)生改變，使異種原生質(zhì)體粘合并發(fā)生質(zhì)膜瞬間破裂，進(jìn)而質(zhì)膜開始連接，直到閉合成完整的膜，形成融合體。當(dāng)前第61頁\共有71頁\編于星期五\22點(diǎn)62細(xì)胞電融合過程當(dāng)前第62頁\共有71頁\編于星期五\22點(diǎn)63融合過程：?細(xì)胞膜的接觸：電場通電后，電流即通過原生質(zhì)體而不是通過溶液，使原生質(zhì)體極化而產(chǎn)生偶極子，從而使原生質(zhì)體緊密接觸排列成串；?膜的擊穿：高頻直流脈沖使原生質(zhì)膜擊穿，導(dǎo)致兩個緊密接觸的細(xì)胞融合在一起。當(dāng)前第63頁\共有71頁\編于星期五\22點(diǎn)64電融合優(yōu)點(diǎn)：不存在對細(xì)胞的毒害問題；融合效率高，重復(fù)性強(qiáng)；融合技術(shù)裝置精巧，操作簡便?？稍陲@微鏡下觀察或錄像融合過程，免去PEG誘導(dǎo)后的洗滌過程，誘導(dǎo)過程可控性強(qiáng)。當(dāng)前第64頁\共有71頁\編于星期五\22點(diǎn)65二、細(xì)胞融合類型對稱融合（symmetricfusion）：即兩個完整的細(xì)胞或原生質(zhì)體融合。非對稱融合（asymmetricfusion）：利用物理或化學(xué)方法使某親本的核或細(xì)胞質(zhì)失活后再進(jìn)行融合。當(dāng)前第65頁\共有71頁\編于星期五\22點(diǎn)66核或細(xì)胞質(zhì)失活的方法：物理方法：常采用射線處理，如X射線、γ射線等，使細(xì)胞核失活；化學(xué)處理：

核失活－碘乙酰胺、碘乙酸；

細(xì)胞質(zhì)失活－羅丹明（能抑制線粒體的氧化磷酸化過程）。當(dāng)前第66頁\共有71頁\編于星期五\22點(diǎn)67三、影響細(xì)胞或原生質(zhì)體融合的因素：⊙首先，細(xì)胞或原生質(zhì)體質(zhì)量；⊙其次，融合方法：

PEG誘導(dǎo)法：PEG規(guī)格、純度，作用時間

電誘導(dǎo)法：細(xì)胞或原生質(zhì)體密度、交流電壓、交變電場的振幅頻率、交變電場的處理時間、直流高頻電壓、脈沖寬度、脈沖次數(shù)。當(dāng)前第67頁\共有71頁\編于星期五\22點(diǎn)68四、體細(xì)胞雜種的鑒定形態(tài)鑒定：根據(jù)雙親的形態(tài)學(xué)性狀觀察進(jìn)行鑒定。細(xì)胞學(xué)鑒定：細(xì)胞器鑒定、染色體鑒定（如核型）。生化鑒定：同功酶鑒定。分子鑒定：RFLP鑒定、RAPD標(biāo)記鑒定。當(dāng)前第68頁\共有71頁\編于星期五\22點(diǎn)69幾種細(xì)胞融合成功的例子融合生物種類細(xì)胞來源成功年代煙草兩個種間葉——葉1972甘藍(lán)——青菜葉——根