芒果細(xì)菌性角斑病菌對(duì)芒果酚類代謝的影響

芒果細(xì)菌性角斑病菌對(duì)芒果酚類代謝的影響李國(guó)平,鄭磊,柳收稿日期：收稿日期：修回日期：基金項(xiàng)目：國(guó)家重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃（No.2019YFD1001100）；中央非盈利性研究機(jī)構(gòu)基本科研業(yè)務(wù)費(fèi)專項(xiàng)（No.1630062020014）。作者簡(jiǎn)介：李國(guó)平(1968-)，男，農(nóng)藝師，從事熱帶果樹(shù)病蟲(chóng)害綜合防控研究。E-mail：guopinli@163.com。*通信作者：柳鳳（1984-），女，副研究員，從事植物病害防治工作，E-mail：liufengneau@163.com。（中國(guó)熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院南亞熱帶作物研究所農(nóng)業(yè)部熱帶果樹(shù)生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,廣東湛江,524091）摘要由柑橘黃單胞菌芒果致病變種引起的芒果細(xì)菌性角斑病是芒果生產(chǎn)上的重要病害，為探討芒果感染細(xì)菌性角斑病過(guò)程中芒果葉片內(nèi)酚類代謝的變化規(guī)律，以細(xì)菌性角斑病高抗品種紅芒6號(hào)和高感品種貴妃芒為試驗(yàn)材料，測(cè)定了接種病菌（Xanthomonascitripv.mangiferaeindicae，Xcm）后芒果葉片內(nèi)總酚、類黃酮、阿魏酸、木質(zhì)素含量及酚類代謝相關(guān)酶（PPO和PAL）活性的變化趨勢(shì)。接種病菌后，感（貴妃芒）、抗（紅芒6號(hào)）芒果品種體內(nèi)酚類物質(zhì)均發(fā)生明顯的變化?？偡印㈩慄S酮、阿魏酸、木質(zhì)素含量、PAL和PPO活性在接種病菌后均直線上升，但總酚、類黃酮、阿魏酸、木質(zhì)素含量增幅抗病品種較高，且感病品種在侵染后期總酚和類黃酮均迅速降低；而PAL、PPO活性感病品種增幅較高。相關(guān)性分析表明芒果葉片的總酚、類黃酮、阿魏酸、木質(zhì)素含量與芒果抗性呈正相關(guān)，而PAL、PPO活性與抗病性呈負(fù)相關(guān)。關(guān)鍵詞芒果；細(xì)菌性角斑病菌；酚類代謝芒果細(xì)菌性角斑病又名芒果細(xì)菌性黑斑病、芒果細(xì)菌性潰瘍病，是由柑橘黃單胞菌芒果致病變種（Xanthomonascitripv.mangiferaeindicae，Xcm）引起的芒果生產(chǎn)上的主要病害，該病可危害芒果的葉、莖、花和果實(shí)等大部分芒果組織，如遇到高溫高濕或者臺(tái)風(fēng)雨天氣，病害發(fā)生尤為嚴(yán)重。該病的最大特點(diǎn)是果實(shí)染病后，果面布滿斑點(diǎn)，失去商品價(jià)值，嚴(yán)重時(shí)可造成落果失收，且該病一旦發(fā)生后即使利用化學(xué)農(nóng)藥控制住其進(jìn)一步蔓延，但染病的果面上的斑點(diǎn)卻無(wú)法去除，因而果實(shí)商品價(jià)值大打折扣，因此預(yù)防該病的發(fā)生是芒果生產(chǎn)保駕護(hù)航的唯一手段[1]。次生代謝在寄主植物抵御微生物侵染過(guò)程中發(fā)揮著至關(guān)重要的作用，酚類物質(zhì)是植物抗病反應(yīng)的主要次生代謝生化物質(zhì)。植物體內(nèi)酚類物質(zhì)的代謝是一個(gè)復(fù)雜過(guò)程，主要通過(guò)苯丙氨酸解氨酶、多酚氧化酶等酶類催化苯丙烷代謝途徑合成木質(zhì)素、類黃酮、植保素、醌類等物質(zhì)[2-3]，這些物質(zhì)參與殺死植物自身細(xì)胞引起過(guò)敏性反應(yīng)、氧化還原反應(yīng)、木質(zhì)化形成和對(duì)毒素的應(yīng)激活性等生理過(guò)程[4-5]。研究表明，酚類物質(zhì)的升高降低與植物抗性無(wú)明顯相關(guān)性，各種物質(zhì)之間通過(guò)相關(guān)轉(zhuǎn)化從而協(xié)調(diào)作用[6-7]。本研究以細(xì)菌性角斑病高抗品種紅芒6號(hào)和高感品種貴妃芒為試驗(yàn)材料，通過(guò)比較人工接種Xcm后感病和抗病品種芒果內(nèi)酚類代謝的差異，旨在闡明Xcm侵染對(duì)芒果酚類代謝的影響，豐富芒果細(xì)菌性角斑病病理的基礎(chǔ)理論，為進(jìn)一步研究病害發(fā)生的內(nèi)在機(jī)制以及芒果細(xì)菌性角斑病的防控提供有價(jià)值的理論依據(jù)。1材料與方法1.1供試菌株供試病原菌編號(hào)為Xcm003，由本實(shí)驗(yàn)室分離自典型芒果細(xì)菌性角斑病癥狀的芒果果實(shí)，致病性測(cè)定具有強(qiáng)致病力，經(jīng)形態(tài)學(xué)觀察、生理生化測(cè)定及全基因組測(cè)序鑒定為柑橘黃單胞菌芒果致病變種Xanthomonascitripv．mangiferaeindicae[8]。1.2供試芒果品種根據(jù)田間表型和室內(nèi)離體接種病菌觀察的結(jié)果，選擇細(xì)菌性角斑病高抗品種紅芒6號(hào)和高感品種貴妃芒為試驗(yàn)芒果品種。1.3試驗(yàn)設(shè)計(jì)試驗(yàn)在本單位農(nóng)業(yè)部隔離檢驗(yàn)檢疫室內(nèi)進(jìn)行，選取健康生長(zhǎng)的紅芒6號(hào)和貴妃芒的一年實(shí)生苗為材料，每個(gè)品種5棵，選取嫩葉（黃轉(zhuǎn)綠）采用刺傷接種法接種，以搖床培養(yǎng)48h后濃度約為4×106cfu/mL的Xcm懸浮液作為接種體，接種后保濕培養(yǎng)，分別在接種后12、24、48、96、144、192h取樣，每次取樣隨機(jī)選取5個(gè)葉片，重復(fù)測(cè)定3次，以相同處理的無(wú)菌水為對(duì)照。1.4酚類物質(zhì)的測(cè)定多酚氧化酶（PPO）和苯丙氨酸解氨酶（PAL）活性測(cè)定參照李榮花等（2005）的方法加以改進(jìn)[9]?？偡?、類黃酮含量測(cè)定參照PirieandMullins（1976）的方法，總酚含量表示為OD280/gFW，類黃酮含量用OD325/gFW表示[10]。阿魏酸含量參考邱永祥的方法并略有改進(jìn)[11]。木質(zhì)素的方法參照翟艷霞（2006）的方法[12]。1.5數(shù)據(jù)處理數(shù)據(jù)的處理和分析均采用MicrosoftExcel2007軟件及SPSS10.0forWindows統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析和Duncan's（鄧肯氏）多重差異比較，P<0.05為差異具有顯著性。2結(jié)果與分析2.1多酚氧化酶（PPO）的變化接種Xcm后，芒果抗感品種的PPO酶活性變化如圖1所示。無(wú)論是抗病品種還是感病品種，接種病菌后PPO活性均明顯高于清水處理。感病品種貴妃芒接種48h就達(dá)到頂峰，是清水對(duì)著的1.8倍，隨后一直保持較高水平，紅芒6號(hào)接種病菌96h前變化不明顯，與清水對(duì)著之前無(wú)顯著差異，但在接種病菌144h后上升3-4倍，比清水對(duì)照高2.5倍。綜合比較芒果抗感品種在接種Xcm后PPO酶活性可以看出，感病品種應(yīng)激反應(yīng)較快，但是上升幅度低于抗病品種。圖1芒果接種Xcm后PPO活性的變化2.2苯丙氨酸解氨酶（PAL）的變化芒果抗感品種接種細(xì)菌性角斑病病菌后，葉片內(nèi)PAL酶活性變化如圖2所示?？垢衅贩N葉片PAL酶活性均有所提高，在接種病菌48h和144h時(shí)達(dá)到頂峰，分別為4371U/(g·min)和8837.5U/(g·min)，是相應(yīng)清水對(duì)著的2和6.2倍。綜合比較發(fā)現(xiàn)，接種病菌后抗感病品種PAL活性變化速度基本一致，但感病品種貴妃芒PAL活性升高的幅度較大。圖2芒果接種Xcm后PAL活性的變化2.3總酚含量的變化從圖3中可以看出，接種Xcm后芒果抗感病品種葉片內(nèi)總酚含量較對(duì)照發(fā)生明顯變化，感病品種紅芒6號(hào)總酚含量呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢(shì)，但是總體水平明顯高于清水對(duì)照處理。感病品種貴妃芒接種病菌后前期（96h）與清水對(duì)照之前無(wú)明顯差異，總酚含量呈下降趨勢(shì)，綜合抗感品種結(jié)果可以初步推斷，總酚含量與芒果的抗性呈正相關(guān)。圖3芒果接種Xcm后總酚含量的變化2.4類黃酮含量的變化類黃酮因其具有殺菌和抑菌作用，因而在植物抗病反應(yīng)中被廣泛關(guān)注。由表1可以看出，抗感品種清水對(duì)照處理的芒果葉片類黃酮的含量始終保持在一個(gè)穩(wěn)定狀態(tài)，其中感病品種中類黃酮含量高于抗病品種，取樣階段的平均值分別為99.46OD325/g和76.78OD325/g。接種Xcm后，類黃酮在抗感品種中均發(fā)生明顯變化?？共∑贩N紅芒6號(hào)葉片中類黃酮的含量迅速上升，12h增幅約40%，24-96h期間增幅在1-1.5倍之間。144-192h趨于穩(wěn)定，但仍顯著高于清水處理。感病品種貴妃芒的增幅不明顯，且后期顯著低于清水處理。綜合抗感品種類黃酮含量變化的結(jié)果可以推斷，類黃酮含量變化與芒果的抗性呈正相關(guān)。表1芒果接種Xcm后類黃酮含量的變化芒果品種接種時(shí)間紅芒6號(hào)（抗病品種）貴妃芒（感病品種）清水Xcm增幅1清水Xcm增幅1256.9180.4341.31c83.0090.468.98c2460.54108.8097.70b89.20102.8015.24b4867.70130.5092.70b106.00113.316.88c9683.55162.2094.10b87.30115.3032.07a144138.50140.201.20d168.82119.20-29.39d19253.54135.5150.01a62.4645.40-27.31d注：（1）增幅=（接菌類黃酮含量－對(duì)照類黃酮含量）/對(duì)照類黃酮含量*100%。（2）數(shù)字后的字母表示Duncan氏新復(fù)極差檢驗(yàn)結(jié)果,不同小寫(xiě)字母表示同列處理間差異達(dá)顯著水平(P<0.05)，下同。2.5阿魏酸含量的變化病菌的侵染對(duì)芒果葉片中阿魏酸含量有著明顯的影響（表2），在抗病品種紅芒6號(hào)中，阿魏酸含量呈現(xiàn)先增加后下降的趨勢(shì)，24h增幅最大為清水對(duì)照的34%。感病品種貴妃芒阿魏酸含量與清水對(duì)照相比，隨著時(shí)間的延長(zhǎng)不斷的減少。從表3中還可以看出，未接種比較的抗病品種紅芒6號(hào)和感病品種貴妃芒阿魏酸含量較穩(wěn)定，且差異不顯著。由此推動(dòng)，阿魏酸含量與芒果的抗性可能呈現(xiàn)正相關(guān)。表3芒果接種Xcm后阿魏酸含量的變化芒果品種接種時(shí)間紅芒6號(hào)（抗病品種）貴妃芒（感病品種）清水Xcm增幅清水Xcm增幅120.730.8414.75b0.960.84-12.50a240.921.2434.78a1.161-13.80a481.471.36-7.58c1.581.30-17.90b960.830.9311.06b1.441.20-16.70ab1441.121.2611.74b1.120.89-20.07c1921.231.05-14.61c1.2381.012-18.25bc2.6木質(zhì)素含量的變化木質(zhì)素作物植物細(xì)胞壁的主要成分，在植物抵御病菌侵染過(guò)程中起到重要作用。芒果接種Xcm后，抗感品種葉片中木質(zhì)素含量變化如表3所示。從表3中可以看出，抗病品種紅芒6號(hào)接種病菌后木質(zhì)素含量有所提高，增幅最大值出現(xiàn)在接種病菌24h，比對(duì)照高10%。感病品種貴妃芒在接種病菌后木質(zhì)素含量變化緩慢，增長(zhǎng)幅度約5%。綜合比較發(fā)現(xiàn)，病菌侵染后，抗病品種木質(zhì)素含量提高幅度高于感病品種，可能通過(guò)增加細(xì)胞壁的厚度來(lái)抵御病菌的侵入，從而達(dá)到抗病效果。表4芒果接種Xcm后木質(zhì)素含量的變化芒果品種接種時(shí)間紅芒6號(hào)（抗病品種）貴妃芒（感病品種）清水Xcm增幅清水Xcm增幅125.145.7812.45b6.106.425.20b245.726.3511.01b6.406.653.90c486.6946.832.03d6.656.873.40c966.547.037.50c6.396.836.80a1445.806.8417.90a6.196.667.60a1926.407.039.80c6.666.873.15c3結(jié)果與討論酚類化合物是植物體本身的固有成分，是植物體次生代謝產(chǎn)物中最重要的化合物之一，參與植物色素合成、生長(zhǎng)發(fā)育、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、抗氧化機(jī)理和逆境防御等生化過(guò)程中。酚類化合物包括苯丙烷類、黃酮類、倍酸型、鞣花酸型、羥基芪類和單寧類等[3,13]。酚類化合物在植物抵御不良環(huán)境、病原物侵染的過(guò)程中起到重要的抗逆作用已引起研究者們的廣泛關(guān)注，其主要通過(guò)合成抗性物質(zhì)、抑制或殺死病原細(xì)胞和刺激寄主細(xì)胞產(chǎn)生抗性反應(yīng)等方式來(lái)提高寄主的抗病能力[14]?？Х仁芸Х忍烤也【秩竞螅剐云贩N在早期發(fā)生黃酮類、羥基肉桂酸衍生物等酚類物質(zhì)致使咖啡發(fā)生過(guò)敏性反應(yīng)形成壞死斑和加速細(xì)胞壁的木質(zhì)化增加細(xì)胞厚度，從而進(jìn)一步阻礙病菌的蔓延[15]。唐永萍等以秦冠、富士、金冠蘋(píng)果果實(shí)為材料，通過(guò)損傷接種灰葡萄孢菌后發(fā)現(xiàn)，抗病蘋(píng)果品種通過(guò)調(diào)節(jié)果肉內(nèi)酚類物質(zhì)代謝，增強(qiáng)次生代謝能力，其中類黃酮和木質(zhì)素含量的增加強(qiáng)化了果實(shí)的抗性反應(yīng)，進(jìn)而提高對(duì)灰霉病的抗性，但總酚含量與植物抗病性關(guān)系不大[16]。張?jiān)葡嫉葹樘綄じ仕{(lán)抗黑腐病的生理生化機(jī)制，以抗病材料C7和感病材料C26為試驗(yàn)材料，在甘藍(lán)幼苗期，噴施病菌懸浮液發(fā)現(xiàn)，抗病品種和感病品種PAL活性均先顯著增加后迅速下降，但抗病品種的酚類物質(zhì)和木質(zhì)素含量后期無(wú)明顯變化[17]。本研究以芒果細(xì)菌性角斑病不同抗性芒果品種為材料，研究了接種病菌后芒果葉片內(nèi)總酚、類黃酮、木質(zhì)素含量及酚類代謝相關(guān)酶（PPO和PAL）活性的變化趨勢(shì)。結(jié)果表明，接種病菌后，感病品種貴妃芒、抗病品種紅芒6號(hào)內(nèi)總酚、類黃酮、阿魏酸、木質(zhì)素含量、PAL和PPO活性在接種病菌后均直線上升，其中總酚、類黃酮、阿魏酸、木質(zhì)素含量增幅在抗病品種中高于感病品種，且感病品種在侵染后期總酚和類黃酮含量均迅速降低；PAL、PPO活性感病品種增幅較高。Xcm侵染對(duì)芒果酚類代謝產(chǎn)生顯著影響，相關(guān)性分析表明芒果葉片的總酚、類黃酮、阿魏酸、木質(zhì)素含量與芒果抗性呈正相關(guān)，而PAL、PPO活性與抗病性呈負(fù)相關(guān)。然而，由于植物的抗病體系是一個(gè)多體系混合作用的復(fù)雜機(jī)制，酚類物質(zhì)代謝途徑與其他抗病機(jī)制如何協(xié)調(diào)互作尚有待進(jìn)一步研究。參考文獻(xiàn)張大智.芒果細(xì)菌性角斑病菌致病因子研究[D].海南:海南大學(xué),2015PETKOVSEKMM,SLATNARA,?TAMPARF,etal.Phenoliccompoundsinappleleavesafterinfectionwithapplescab[J].BiologiaPlantarum,2011,55(4):725-730華曉雨,陶爽,孫盛楠,等.植物次生代謝產(chǎn)物-酚類化合物的研究進(jìn)展[J].生物技術(shù)通報(bào),2017,33(12):22-29EHLTINGJ,HAMBERGERB,MILLIONRR,etal.CytochromesPphenolicmetabolism[J].PhytochemistryReviews,2006,5:239-270AHUJAI,KISSENR,BINESAM.Phytoalexinsindefenseagainstpathogens[J].TrendsinPlantScience,2012,17(2):73-90SANTIAGOR,DEARMASR,LEGAZME,etal.Changesinphenolicacidscontent,phenylalanineammonia-lyaseandperoxidaseactivitiesinsugarcaneleavesinducedbyelicitorsisolatedfromXanthomonasalbilineans[J].AustralasianPlantPathology,2009,38:357-365李嘉,徐德林,龍海,等.禾谷孢囊線蟲(chóng)侵染對(duì)小麥根部防御酶的影響[J].應(yīng)用與環(huán)境生物學(xué)報(bào),2012,18(3):359-363LIUF,OUXC,ZHANRL.Whole-genomesequenceandgenomeannotationofXanthomonascitripv.mangiferaeindicae,causalagentofbacterialblackspotonMangiferaindica[J].ArchivesofMicrobiology,2018,200:835-840李榮花,陳捷,高增貴,等.玉米紋枯病抗性與防御酶關(guān)系的研究[J].天津師范大學(xué)學(xué)報(bào):自然科學(xué)版,2005,25(4):32-36PIREA,MULLINSMG.Changesinanthocyaninandphenolicscontentofgrapevineleafandfruittissuestreatedwithsucrose,nitrate,andabscisicAcid.Plantphysiology,1976,58(4):46