第12章 DNA的生物合成

第12章DNA的生物合成DNABiosynthesis*1*2第5節(jié)DNA損傷（突變）與修復(fù)第4節(jié)反轉(zhuǎn)錄和其他復(fù)制方式第3節(jié)DNA復(fù)制的基本過程第2節(jié)DNA復(fù)制的酶學(xué)和拓?fù)鋵W(xué)變化第1節(jié)DNA復(fù)制的基本規(guī)律第12章DNA的生物合成

1865年，奧地利生物學(xué)家孟德爾(Mendel)總結(jié)8年的豌豆雜交實(shí)驗(yàn)提出：“hereditaryfactor(遺傳因子)”決定生物性狀、分離定律和自由組合定律。1910年，美國生物學(xué)家摩爾根(Morgan)對果蠅進(jìn)行系統(tǒng)研究，提出基因在染色體上直線排列、連鎖遺傳和連鎖交換定律。1933年獲諾貝爾獎。1909年，丹麥生物學(xué)家約翰遜(Johannsen)進(jìn)行了６年的菜豆自交與純系實(shí)驗(yàn)；據(jù)希臘文“給予生命”之義，最先用“基因”替代了“遺傳因子”。*31.基因概念的提出和發(fā)展

1928年格里非斯(Griffith)，1944年艾弗里(Avery)的肺炎雙球菌遺傳轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)，證實(shí)了遺傳物質(zhì)是DNA而不是蛋白質(zhì)。*42.遺傳物質(zhì)化學(xué)本質(zhì)的探索

1952年赫爾希(Hershey)和沙斯(Chase)的T2噬菌體侵染細(xì)菌實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步證明攜帶遺傳信息的是DNA。與德爾布呂克(Delbrück)和魯利亞(Luria)同獲1969諾貝爾生理醫(yī)學(xué)獎。

1951年，鮑林(Pauling)，威爾金斯(Wilkins)和富蘭克林(Franklin)用X線晶體衍射技術(shù)發(fā)現(xiàn)了蛋白質(zhì)α雙鏈螺旋結(jié)構(gòu)。FranklinDNAX射線衍射圖譜即將面世。1952年，查戈夫(Chargaff)等用層析和紫外光譜分析技術(shù)發(fā)現(xiàn)：①A=T，G=C；

②不同種屬DNA的4種堿基組成不同；

③同一種屬不同組織的DNA堿基組成相同。

1953年4月，Watson和Crick提出的DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)模型，《Nature》雜志上發(fā)表。同一雜志上還發(fā)表了Franklin的DNAX射線衍射圖譜，及Wilkins的DNAX射線衍射分析數(shù)據(jù)。

*63.DNA分子的雙螺旋結(jié)構(gòu)模型提出DNARNAProtein中心法則TheCentralDogma1958F.Crick翻譯轉(zhuǎn)錄反轉(zhuǎn)錄復(fù)制復(fù)制中心法則的補(bǔ)充：①1965年發(fā)現(xiàn)RNA復(fù)制②1970年發(fā)現(xiàn)逆轉(zhuǎn)錄酶*74.中心法則的提出和發(fā)展復(fù)制的基本規(guī)律第一節(jié)BasicRulesofDNAReplication*8學(xué)習(xí)要求：

掌握復(fù)制及其基本規(guī)律、半保留復(fù)制、雙向復(fù)制、半不連續(xù)性復(fù)制、復(fù)制叉、復(fù)制子、領(lǐng)頭鏈、隨從鏈、岡崎片段的概念。

熟悉半保留復(fù)制的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。DNA復(fù)制的概念:復(fù)制親代DNA子代DNA*9DNA復(fù)制是一個(gè)由多種酶催化，多種蛋白因子參與，并且受到精密調(diào)控的復(fù)雜過程。E.coli染色質(zhì)的復(fù)制涉及約30種蛋白質(zhì)。指遺傳物質(zhì)的傳代，是以母鏈DNA為模板，按堿基配對的原則,合成兩個(gè)完全相同的子鏈DNA分子的過程。復(fù)制的基本規(guī)律半保留復(fù)制

(semi-conservativereplication)雙向復(fù)制

(bidirectionalreplication)半不連續(xù)復(fù)制

(semi-discontinuousreplication)*10一、半保留復(fù)制DNA復(fù)制時(shí)，母鏈DNA解開成兩股單鏈作為模板，按堿基配對規(guī)律合成與模板互補(bǔ)的子鏈；形成的2個(gè)子代DNA中，一股單鏈從親代完整地接受過來，另一股單鏈則完全從新合成；2個(gè)子代DNA堿基序列都和親代DNA的一致。Watson

andCrick,1953.親代DNA子代DNA模板榮獲1962年諾貝爾醫(yī)學(xué)與生理學(xué)獎。圖12-1DNA復(fù)制理論上有三種可能形式*121958,M.Mmlson

&F.W.Stahl設(shè)計(jì)的實(shí)驗(yàn)*131958,M.Messelson

&F.W.Stahl設(shè)計(jì)的實(shí)驗(yàn)*14按半保留復(fù)制方式，子代DNA與親代DNA的堿基序列一致，即子代保留了親代的全部遺傳信息，體現(xiàn)了遺傳的保守性。

半保留復(fù)制的意義遺傳的保守性，是物種穩(wěn)定性的分子基礎(chǔ)，但不是絕對的。*15二、雙向復(fù)制DNA復(fù)制從固定的復(fù)制起始點(diǎn)(origin，ori)開始，分別向兩個(gè)方向進(jìn)行解鏈、復(fù)制，稱為雙向復(fù)制。復(fù)制叉復(fù)制叉5’3’5’5’3’3’5’3’3’5’原核DNA：單點(diǎn)雙向復(fù)制*16ori是指DNA復(fù)制起始時(shí)必需的一段特殊DNA序列。共同特征：這些短重復(fù)序列被多亞基的復(fù)制起始因子(DnaA；RC:originrecognitioncomplex)所識別并結(jié)合；一般富含AT，利于雙螺旋DNA解旋解鏈產(chǎn)生單鏈

DNA。①由多個(gè)獨(dú)特的短重復(fù)序列組成；E.Coli的稱oriC，由245bp的保守序列和控制元件組成；酵母的稱自主復(fù)制序列(autonomouslyreplicatingsequence,ARS),含含11bp富含AT的核心序列。*175’3’oriorioriori5’3’5’5’3’3’真核DNA：多點(diǎn)雙向復(fù)制復(fù)制子長度兩個(gè)相鄰復(fù)制起始點(diǎn)之間的距離定為一個(gè)復(fù)制子長度。*18復(fù)制子(replicon)：獨(dú)立完成復(fù)制的功能單位。

三、復(fù)制的半不連續(xù)性35353′5′領(lǐng)頭鏈(leadingstrand)隨從鏈(laggingstrand)3′5′3′5′*19

半不連續(xù)性復(fù)制過程中，領(lǐng)頭鏈連續(xù)復(fù)制，而隨從鏈不連續(xù)復(fù)制的現(xiàn)象。岡崎片段(okazakifragment)

指不連續(xù)復(fù)制的片段原核:1000~2000個(gè)核苷酸（nt）

(相當(dāng)于1個(gè)順反子，即基因的大小)

真核:100~200個(gè)核苷酸（nt）(相當(dāng)于1個(gè)核小體DNA的大小)*20DNA復(fù)制的酶學(xué)和拓?fù)鋵W(xué)變化第二節(jié)TheEnzymologyofDNAReplication*21學(xué)習(xí)要求：

掌握參與DNA復(fù)制的主要物質(zhì)種類，原核和真核生物DNA聚合酶作用、種類及特點(diǎn)，拓補(bǔ)異構(gòu)酶、引物酶、單鏈DNA結(jié)合蛋白和DNA連接酶的作用和特點(diǎn)。

熟悉DNA復(fù)制的化學(xué)反應(yīng)、保真性的酶學(xué)依據(jù)。

了解DNA聚合酶的分子結(jié)構(gòu)特點(diǎn)，復(fù)制中DNA分子的拓補(bǔ)學(xué)變化。底物(substrate):dATP,dGTP,dCTP,dTTP；(dNTP)聚合酶(polymerase):

依賴DNA的DNA聚合酶，簡寫為DNA-pol；模板(template):

解開成單鏈的DNA母鏈；引物(primer):

提供3-OH末端使dNTP可以依次聚合；其他的酶和蛋白質(zhì)因子。參與DNA復(fù)制的物質(zhì):*22一、復(fù)制的化學(xué)反應(yīng)

(dNMP)n+dNTP(dNMP)n+1+PPiDNApol只可沿5→3方向延長；需模板和引物；聚合反應(yīng)特點(diǎn)：消耗2個(gè)高能磷酸鍵?；钚裕?.53

聚合酶活性，需要引物；

2.35核酸外切酶活性。二、DNA聚合酶是指以DNA作為模板，催化底物dNTP合成DNA的一類酶。全稱：依賴DNA的DNA聚合酶(DNA-dependentDNApolymerase)簡稱：DNA-pol*24DNA-pol的5′3′聚合作用3′5

53′3′5DNA-pol5

3′OHP*253′5′外切酶5′3′外切酶5′3′內(nèi)切酶3′5′外切酶5′3′外切酶外切酶與內(nèi)切酶作用圖解*265′3′（一）原核生物的DNA聚合酶共同點(diǎn)：1.53

的聚合活性，需要引物；

2.35外切酶活性。DNA-polⅠDNA-polⅡDNA-polⅢ不同點(diǎn)：DNA-polⅠ還有53外切酶活性。*27DNA-polⅠDNA-polⅡDNA-polⅢ5′→3′多聚酶活性有有有3′→5′外切酶活性有有有5′→3′外切酶活性有無無聚合速度（核苷酸數(shù)/酶分子·分鐘）60030約30000組成單體單體多亞基復(fù)合物分子數(shù)/細(xì)胞400？20分子量（kD）109120250基因突變后的致死性可能不可能可能功能切除引物、修復(fù)、填補(bǔ)空缺修復(fù)？復(fù)制大腸桿菌三種DNA聚合酶性質(zhì)與功能*28功能：對復(fù)制中的錯誤進(jìn)行校讀，對復(fù)制

和修復(fù)中出現(xiàn)的空隙進(jìn)行填補(bǔ)。DNA-polⅠ(109kD)*291959年諾貝爾生理學(xué)醫(yī)學(xué)獎得主DNA-pol

I

5′3′外切酶活性的功能切除引物，切除突變片段5′3′*30DNA-pol

I

3′5′外切酶活性的功能校讀（proofread）功能5′3′GC將錯配的核苷酸從引物鏈的3′端除去

*31323個(gè)氨基酸小片段5核酸外切酶活性大片段/Klenow片段

604個(gè)氨基酸

5核酸外切酶活性；DNA聚合酶活性N端C端枯草桿菌蛋白酶DNA-polⅠ酶切片段Klenow片段是實(shí)驗(yàn)室合成DNA，進(jìn)行分子生物學(xué)研究中常用的工具酶。

*32DNA-polⅡ（120kD）DNA-polII基因發(fā)生突變，細(xì)菌依然能存活；對模板的特異性不高；它參與DNA損傷的應(yīng)急狀態(tài)修復(fù)。

*33*是由A.Kornberg的二兒子TomB.Kornberg發(fā)現(xiàn)的。

DNA-polⅢ(含10多個(gè)亞基的異二聚體)核心酶:由α、ε、θ構(gòu)成*34功能:原核生物復(fù)制延長中真正起催化作用的酶。

DNA-polⅢ同時(shí)合成領(lǐng)頭鏈和隨從鏈*35聚合酶αβγδε定位核核線粒體核核5′→3′聚合活性有有有有有3′→5′外切活性無無有有有持續(xù)合成能力中等低高有PCNA(β亞基)時(shí)高高功能起始引發(fā)，引物酶活性低保真度的復(fù)制線粒體DNA復(fù)制延長子鏈的主要酶，解旋酶活性填補(bǔ)空缺，切除修復(fù)，重組

（二）真核生物的DNA聚合酶*36三、復(fù)制的保真性(fidelity)

（1）嚴(yán)格按照堿基配對規(guī)律外進(jìn)行復(fù)制，突變率約為1/103；

（2）DNA聚合酶對模板的依賴性和對堿基的選擇，是子鏈與母鏈能準(zhǔn)確配對(突變率1/104~5)，使遺傳信息延續(xù)和傳代的保證；

（4）DNA修復(fù)系統(tǒng)和復(fù)制起始必須利用引物等機(jī)制，使突變率由1/106~8降低到1/109~10

。

（3）DNA聚合酶3′→5′外切酶功能和5′→3′聚合酶活性實(shí)現(xiàn)的即時(shí)校讀(proofread)，可使突變率由1/104~5降低到1/106~8；*37四、復(fù)制中的解鏈和DNA分子拓?fù)鋵W(xué)變化

DNA分子的堿基埋在雙螺旋內(nèi)部，只有把DNA解開成單鏈，它才能起模板作用；因此，DNA復(fù)制涉及DNA雙螺旋構(gòu)象變化及解鏈過程。*38

種類：解旋酶Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ和rep蛋白解旋酶Ⅱ、Ⅲ：沿著隨從鏈的模板，從5’→3’方向，促使復(fù)制叉向前延伸；rep蛋白(六聚體)：沿著領(lǐng)頭鏈的模板，從3’→5’方向向前移動，促使雙鏈不斷解開；（一）解螺旋酶和單鏈DNA結(jié)合蛋白解螺旋酶(helicase)又稱解鏈酶，利用ATP供能，作用于氫鍵，使雙螺旋DNA解旋和解鏈成為兩條單鏈。*39解螺旋酶和單鏈DNA結(jié)合蛋白協(xié)同作用單鏈DNA結(jié)合蛋白

(singlestrandedDNAbindingprotein,SSB)在復(fù)制中維持模板處于單鏈狀態(tài)并保護(hù)單鏈的完整。*40（二）引物酶(primase)

所有細(xì)胞和多數(shù)病毒的DNA復(fù)制，都須首先利用DNA模板合成一段被稱之為引物的，長度從幾個(gè)到幾十個(gè)核苷酸的，短鏈RNA序列，為DNA聚合酶提供游離3’-OH端合成DNA鏈。原核細(xì)胞的引物酶是一種僅用于DNA復(fù)制所需引

物合成的RNA聚合酶；

真核細(xì)胞的引物酶是DNA聚合酶α的兩個(gè)小亞基。

G4噬菌體等利用宿主菌引物酶合成引物，M13噬菌體則利用細(xì)菌RNA聚合酶合成引物。*41

反轉(zhuǎn)錄病毒利用宿主細(xì)胞tRNA的3′-OH端

作為反轉(zhuǎn)錄引物；

線粒體DNA復(fù)制利用RNA聚合酶的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物3′-OH端作為引物；ΦX174噬菌體利用環(huán)形雙鏈DNA中一條鏈的

切口處為DNA聚合酶提供游離3′-OH端。特殊形式的引物：2023/6/542*42

是一種可逆的核酸酶，它既能水解DNA分子中的磷酸二酯鍵，又能將其重新連接；可快速消除DNA解鏈過程中所產(chǎn)生的正超螺旋累積，使復(fù)制叉能夠順利前進(jìn)。

（三）DNA拓?fù)洚悩?gòu)酶

(DNAtopoisomerase,Topo)

*43*44

拓?fù)洚悩?gòu)酶可快速消除DNA解鏈過程中所產(chǎn)生的正超螺旋累積，使復(fù)制叉能夠順利前進(jìn)。原核和真核生物都發(fā)現(xiàn)了三類拓?fù)洚悩?gòu)酶：TopoⅠ、TopoⅡ和近期發(fā)現(xiàn)的TopoⅢ；TopoⅢ只消除負(fù)超螺旋，而且活性較弱。原核生物：TopoⅡ?qū)⑶胺降恼菪D(zhuǎn)變?yōu)樨?fù)超螺旋；TopoⅠ使DNA變?yōu)樗沙跔顟B(tài)，與轉(zhuǎn)錄有關(guān)。真核生物：TopoⅠ和TopoⅡ都能清除前方的正超螺旋。作用：通過切斷、旋轉(zhuǎn)和再連接，理順DNA鏈。

*45DNA正超螺旋與負(fù)超螺旋負(fù)超螺旋DNA雙螺旋正超螺旋原核TopoⅡ原核TopoⅠ真核TopoⅠ、ⅡDNA聚合酶*46切割DNA雙鏈，此時(shí)不需ATP；爾后由ATP供能，使DNA分子成負(fù)超螺旋再連接切口。不需ATP，切割雙鏈DNA中的一條鏈，使DNA松弛后,連接切口。TopoⅠ:TopoⅡ：

臨床上使用的某些抗腫瘤藥(如喜樹堿、鬼臼乙叉甙等)可通過抑制Topo酶活性而殺死腫瘤細(xì)胞。作用機(jī)制*47五、DNA連接酶(DNAligase)由RNaseH與DNA-polⅠ外切酶活性除去岡崎片段中的RNA引物，間隙由DNA-polⅠ填補(bǔ)成DNA，缺口由DNA連接酶催化相鄰岡崎片段間的3′-OH和5′-P形成磷酸二酯鍵而連成完整的DNA鏈。注意：只能連接堿基互補(bǔ)基礎(chǔ)上雙鏈中的單鏈缺口；而對單獨(dú)存在的DNA單鏈或RNA單鏈沒有連接的作用。AMP+PPi*48連接酶連接模板鏈上相鄰兩個(gè)片段的切口*49

在復(fù)制中起最后接合缺口(雙鏈中的單鏈

缺口)的作用；在DNA修復(fù)、重組及剪接過程中起縫合缺

口的作用；基因工程的重要工具酶之一。DNA連接酶功能*50

DNA復(fù)制因子和酶原核生物真核生物功能起始識別因子OriginRec.FactorDnaAHU(類組蛋白)ORC(6聚體)Cdc6、MCM識別、結(jié)合復(fù)制起始點(diǎn)解螺旋酶HelicaseDanB(6聚體)DnaC(6聚體)DNA-pol

解開DNA雙螺旋鏈單鏈結(jié)合蛋白SingleStrandBPSSBSSB結(jié)合、穩(wěn)定DNA單鏈拓?fù)涿窽opoisomerase拓?fù)涿涪蛲負(fù)涿涪裢負(fù)涿涪蚯宄龔?fù)制叉前方的超螺旋引物酶PrimaseDnaGDNA-pol

合成一小段RNA引物DNA聚合酶DNAPolymeraseDNA-PolⅠDNA-PolⅢβ亞基DNA-pol

DNA-pol

PCNA以親代DNA單鏈為模板，按5′→3′方向延長子鏈DNARNA酶HRNaseHRNA酶HDNA-PolⅠRNA酶HRNaseH分解、清除引物連接酶Ligase連接酶連接酶連接DNA片段參與DNA復(fù)制的主要因子和酶*51DNA生物合成過程第三節(jié)TheProcessofDNAReplication*52學(xué)習(xí)要求：

掌握原核生物DNA復(fù)制過程和各階段的特點(diǎn)；掌握端粒和端粒酶概念，

熟悉真核生物DNA復(fù)制過程和各階段的特點(diǎn)；熟悉復(fù)制起始、引發(fā)體、負(fù)超螺旋等概念。

了解端粒延長機(jī)制。（一）復(fù)制的起始(initiation)一、原核生物的DNA生物合成

復(fù)制是一個(gè)連續(xù)的過程，根據(jù)復(fù)制的特點(diǎn)，人為分成起始、延長和終止三個(gè)階段。引物合成DNA解鏈引發(fā)體生成1.DNA復(fù)制起始點(diǎn)的辨認(rèn)結(jié)合與解鏈原核生物DNA的復(fù)制有一個(gè)特定的復(fù)制起始點(diǎn)；E.coli的復(fù)制起始點(diǎn)稱為oriC，由245bp的保守序列和控制元件組成。*53上游有3組13bp串連重復(fù)序列能被DnaB(解螺旋酶)和DnaC蛋白識別結(jié)合下游有2對9bp反向重復(fù)序列能被DnaA蛋白(起始因子)識別結(jié)合復(fù)制起始辨認(rèn)oriC并解鏈主要需要6種蛋白因子：DnaA(起始因子)、DnaB(解螺旋酶)、DnaC、HU(類組蛋白)、拓?fù)涿?即促旋酶)和SSB*54ArrangementofsequencesintheE.colireplicationorigin,oriC.*DUE:DNAunwindingelement.ModelforinitiationofreplicationattheE.coliorigin,oriC.EightDnaAproteinmolecules,eachwithaboundATP,bindattheRandIsitesintheorigin.引物3'HO5'3535引物酶HO3'5'引物酶DanC解螺旋酶SSB引物SSBHO3'(DnaB)(DnaG)(DnaG)引發(fā)體：含有解螺旋酶(DnaB)、DnaC蛋白、引物酶(DnaG)和DNA復(fù)制起始區(qū)域的復(fù)合結(jié)構(gòu)。引物：是由引物酶催化合成的短鏈RNA分子,能提

供3′-OH。

2.引發(fā)體的形成和引物*56（二）復(fù)制的延長(elongation)復(fù)制延長指在DNA-polⅢ催化下，dNTP以dNMP的方式逐個(gè)加入引物或延長中的子鏈上，其化學(xué)本質(zhì)是磷酸二酯鍵的不斷生成。

3——AAGACCTATTGCAAT--------—55——TTCTGGATAA-OH3*57領(lǐng)頭鏈：合成一段RNA引物（比岡崎片段的引物略長），開始合成后通常一直繼續(xù)下去。*58隨從鏈：分段進(jìn)行，需要不斷合成RNA引物和岡崎

片段。*59領(lǐng)頭鏈：合成一段RNA引物（比岡崎片段的引物略長），開始合成后通常一直繼續(xù)下去。隨從鏈：分段進(jìn)行，需要不斷合成RNA引物和岡崎

片段。*60在營養(yǎng)豐富培養(yǎng)基，E.Coli每20分鐘即可分裂一次；其基因組堿基數(shù)為4.6×106bp,DNA為單點(diǎn)雙向復(fù)制，可推算出復(fù)制速度約115kb/min(1,900bp/s)；真核染色體DNA為多點(diǎn)雙向復(fù)制，復(fù)制叉移動速度約1～3kb/min(16~50bp/s)；復(fù)制子長度為100～200kb，約30～60分鐘內(nèi)完成復(fù)制(25~110bp/s)；完成染色體復(fù)制時(shí)間通常要用6～8小時(shí)。*611.原核生物基因是環(huán)狀DNA，雙向復(fù)制的匯合點(diǎn)就是復(fù)制的終止點(diǎn)。（三）復(fù)制的終止oriter

E.coli8232SV40oriter500*622.終止區(qū)含有多個(gè)約22bp的終止子(termi-nator,ter),識別結(jié)合ter序列的是Tus蛋白。

Tus(terminusutilizationsubstance)蛋白具有反解旋酶活性，Tus-ter復(fù)合物可以抑制DnaB蛋白的解旋作用，阻止復(fù)制叉前進(jìn)。

Tus蛋白除了使復(fù)制叉停止運(yùn)動以外，還可能造成復(fù)制體解體；解體后大約仍有10～100bp未被復(fù)制，這時(shí)通過修復(fù)方式填補(bǔ)空缺。*633.隨從鏈上不連續(xù)性片段的連接*64WhenDNAreplicated,itsstrandsareseparatedbytheenzymehelicase.SinglestrandDNAbindingproteinkeepsthestrandfromre-annealing.OneDNAstrandwecalledtheleadingstrand,whichformfrom5primeto3primeend,usingDNApolymeraseIII,noproblemhere.Butthelaggingstrandpresentsproblem.Ithasformedfrom5primeto3primetoo.ItformspiecescalledOkazakifragments.FirstaRNAprimaselaysdowntheRNAprimer,thenDNApolymeraseIIIlaysdownnewDNA.theprocessrepeatsagainandagain.DNApolymeraseIreplacestheRNAprimerithDNA,finallyDNAligaselinkstheOkazakifragments.原核生物的DNA生物合成

*65二、真核生物的DNA生物合成

復(fù)制起始點(diǎn)多、岡畸片段短、復(fù)制叉前進(jìn)速度慢等特點(diǎn)，最重要的是參與復(fù)制的酶種類、數(shù)量更多更復(fù)雜。細(xì)胞完成一輪分裂的過程稱為細(xì)胞周期(cellcycle)，分為4期；在良好營養(yǎng)條件下培養(yǎng)細(xì)胞，歷時(shí)約24小時(shí)。

復(fù)制僅發(fā)生在細(xì)胞分裂的合成期(S期)，而且只復(fù)制一次。*66（一）復(fù)制的起始（與原核生物比較）1、過程同原核生物：解鏈引發(fā)體形成生成引物2、特點(diǎn)：起始點(diǎn)稱自主復(fù)制序列(autonomousreplicationsequence,ARS),結(jié)構(gòu)較oriC短(酵母：為150bp

含有11bp富含AT的

核心序列的片段;

被ORC(originrecognitioncomplex)識別結(jié)合。多起點(diǎn)（多復(fù)制子）時(shí)序性（分組激活，非同步進(jìn)行）*673、參與酶和蛋白因子：

DNA-pol（引物酶活性）

DNA-pol（解螺旋酶活性）拓?fù)洚悩?gòu)酶復(fù)制因子(RF，如：RFA、RFC)

增殖細(xì)胞核抗原(proliferationcellnuclearantigen，PCNA)4、通過細(xì)胞周期實(shí)現(xiàn)其調(diào)節(jié)：蛋白激酶磷酸化激活各種RF而調(diào)控細(xì)胞周期進(jìn)入S期，相關(guān)cyclin和CDK相互作用，實(shí)現(xiàn)對DNA復(fù)制的多樣化和精確的調(diào)節(jié)。

*68ARSARS：自主復(fù)制序列，為150bp含11bp富AT核心序列的片段。復(fù)制起始分兩步：G1期，ORC對ARS的識別結(jié)合及前復(fù)制復(fù)合物(pre-RC)的形成：ORC識別結(jié)合ARS、Cdc6與ORC結(jié)合、MCM2~7成環(huán)狀復(fù)合體，組裝成pre-RC。S期，pre-RC磷酸化激活：

CDK使pre-RC磷酸化激活，復(fù)制起點(diǎn)DNA解旋、募集DNA聚合酶，起始復(fù)制。Cdc6:Celldivisioncycle6，細(xì)胞分裂周期蛋白6MCM:minchromosomemaitenanceproteins，小染色體維持蛋白領(lǐng)頭鏈3535親代DNA5335隨從鏈（二）復(fù)制的延長DNA-polδ：在PCNA和RF-C協(xié)同下，替代DNA-polα繼續(xù)催化領(lǐng)頭鏈和隨從鏈合成。DNA-polα：催化10個(gè)堿基引物和頭20~30個(gè)堿基組成的DNA合成；*703`5`3`5`5`3`核小體引物注：當(dāng)隨從鏈延長了大致相當(dāng)于一個(gè)或若干個(gè)核小

體的長度(135bp，或135bp的若干倍)就要重

新合成引物長度。*715’PHO3’P5’3’OHHO5’PP5’HO3’3’OHP5’5’P3’OH真核生物染色體DNA是線性結(jié)構(gòu)，染色體兩端新鏈的引物被去除后，分別留下一段空隙和一段單鏈DNA母鏈。

（三）復(fù)制終止和端粒酶引物水解（RNA酶）補(bǔ)缺（DNA-pol

）連接（連接酶）1、復(fù)制終止基本過程*72兩端單鏈DNA母鏈不填補(bǔ)成雙鏈，就會被核內(nèi)DNase酶解，造成子代染色體末端縮短。某些低等生物出現(xiàn)少數(shù)特例，經(jīng)多次復(fù)制后的染色體越來越短，造成末端相鄰的一些重要基因丟失、遺傳信息完整性破壞。*73端粒染色體端粒(telomere)是指真核生物染色體末端DNA與它的結(jié)合蛋白緊密結(jié)合而形成的特殊結(jié)構(gòu)。端粒的功能：

☆穩(wěn)定染色體末端結(jié)構(gòu)；☆防止染色體間末端連接；☆補(bǔ)償DNA5′末端在清除RNA引物后造成的空缺。*74端粒的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)TTTTGGGGTTTTGGGG…端粒的共同結(jié)構(gòu)是富含(TmGn)x重復(fù)序列，重復(fù)的次數(shù)由幾十到數(shù)千不等，并能反折成二級結(jié)構(gòu)。水解引物后每個(gè)染色體的3’末端比5’末端長,伸出約12～16個(gè)單核苷酸鏈，這一特殊結(jié)構(gòu)可募集一種稱為端粒酶(telomerase)的特殊酶。P5’HO3’3’OHP5’5’P3’OH*75

端粒酶(telomerase)人端粒酶組成(1997,成功克隆)功能特點(diǎn)由RNA和蛋白質(zhì)組成，是一種特殊的反轉(zhuǎn)錄酶?！疃肆Ｃ窻NA(hTR,能與染色體的3’ssDNA互補(bǔ))☆端粒酶協(xié)同蛋白1(hTP1)☆端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶(hTRT)

☆能夠延伸其DNA底物的3’端；☆以自己的RNA組分作為模板，

以染色體3’端ssDNA作引物。*76

端粒酶催化作用的爬行模型G-C配對回折*77-OH-OH-OH

正常細(xì)胞：細(xì)胞分裂

衰老死亡

細(xì)胞年輕化細(xì)胞分裂

端粒酶抗衰老端粒、端粒酶與細(xì)胞衰老*78端粒、端粒酶與腫瘤但某些腫瘤形成時(shí)可產(chǎn)生端粒缺失、融合、或縮短等現(xiàn)象。☆癌細(xì)胞可通過某些機(jī)制啟動端粒酶基因的表達(dá)，使染色體端粒穩(wěn)定地維持一定的長度，使癌細(xì)胞得以持續(xù)增殖、轉(zhuǎn)移并獲得永生。大多數(shù)增殖活躍的腫瘤細(xì)胞（約85%）端粒酶活性增高。☆端粒酶可作為為病變組織良惡性鑒別指標(biāo)，及抗癌治療的靶位點(diǎn)。*79*80真核與原核生物復(fù)制的主要區(qū)別*81反轉(zhuǎn)錄和其他的復(fù)制方式第四節(jié)ReverseTranscriptionandOtherDNAReplicationWays*82學(xué)習(xí)要求：

掌握反轉(zhuǎn)錄概念、作用特點(diǎn)、作用過程及生物學(xué)意義。了解滾環(huán)復(fù)制和D環(huán)復(fù)制。逆轉(zhuǎn)錄酶(reversetranscriptase)RNA病毒逆轉(zhuǎn)錄(reversetranscription)現(xiàn)象RNADNA

逆轉(zhuǎn)錄酶又稱反轉(zhuǎn)錄酶，為依賴RNA的DNA聚合酶(RNAdependentDNApolymerase,RDDP)。一、反轉(zhuǎn)錄酶和反轉(zhuǎn)錄

1.逆轉(zhuǎn)錄酶活性：以RNA為模板(tRNA為引物)合成DNA2.RNaseH活性：水解RNA-DNA雜合分子中的RNA3.DNA-pol活性：以DNA為模板合成DNA逆轉(zhuǎn)錄酶沒有3′→5′外切酶活性,無校對功能。*83圖12-18反轉(zhuǎn)錄酶催化RNA轉(zhuǎn)變?yōu)殡p鏈cDNA的途徑AAnATTnT5′5′mRNA反轉(zhuǎn)錄酶mRNAcDNA3′TTnTAAnARnaseHTTnT3′DNApolyIcDNA核酸酶S1雙鏈cDNA3′5′3′5′5′B．試管內(nèi)合成cDNA逆轉(zhuǎn)錄病毒的生活周期：進(jìn)入宿主細(xì)胞

雙鏈RNA

逆轉(zhuǎn)錄酶

雙鏈cDNA(前病毒)

整合到宿主細(xì)胞基因組DNA中

宿主細(xì)胞RNA聚合酶II

mRNA

病毒RNA基因組合成病毒蛋白質(zhì)包裝成新的病毒顆粒，離開宿主*85*86反轉(zhuǎn)錄病毒細(xì)胞內(nèi)的逆轉(zhuǎn)錄過程：受體:CD4輔受體：CCR5/RANTES

或CXCR4/SDF-1gp120二、逆轉(zhuǎn)錄研究的意義

（1）擴(kuò)展了中心法則；表明RNA可同時(shí)兼有遺傳信

息傳代與表達(dá)的功能。（2）對反轉(zhuǎn)錄病毒的研究，有助于腫瘤和艾滋等疾

病發(fā)病機(jī)制和診治的研究。（3）cDNA法、反轉(zhuǎn)錄病毒載體已成為基因工程和

基因治療的重要工具。

1964~1970,Baltimore、Temin和Dulbecco在RSV和MLV研究，發(fā)現(xiàn)反轉(zhuǎn)錄酶、腫瘤病毒和細(xì)胞遺傳物質(zhì)間的相互作用，獲1975諾貝爾生理/醫(yī)學(xué)獎。*87AZT(3′疊氮-2′,3′雙脫氧胸腺核苷)是已用于艾滋病臨床治療的抑制反轉(zhuǎn)錄酶的藥物AZT經(jīng)T淋巴細(xì)胞吸收后轉(zhuǎn)變?yōu)锳ZT三磷酸酯。

一方面AZT三磷酸酯與HIV反轉(zhuǎn)錄酶有高親和力，競爭性抑制了酶對dNTP的結(jié)合；

另一方面AZT可被加接到合成中的DNA鏈3′端，但AZT沒有3′-OH，故病毒DNA合成被迅速終止。*882007年，艾滋病疫苗研究接連受挫：9月底，美國國立衛(wèi)生研究院(NIH)在最后一刻決定：停止一項(xiàng)耗資達(dá)1.3億美元的艾滋病疫苗試驗(yàn)。9月中旬，默克制藥公司宣布，其耗時(shí)10年研制的艾滋病疫苗中期臨床試驗(yàn)失敗；默克的疫苗被認(rèn)為是最有希望的艾滋病疫苗。2009年，艾滋病疫苗研究再現(xiàn)新希望：

2009，美國和泰國研究人員在泰國首都曼谷聯(lián)合宣布,一種新型試驗(yàn)疫苗可使人體感染艾滋病病毒的風(fēng)險(xiǎn)降低31.2%。中國艾滋病疫苗類型：復(fù)制型多價(jià)活病毒重組疫苗疫苗載體：疫苗原毒株：HIV-1CRF-07株，中國流行最廣毒株。可選用的重組DNA抗原成分：gag、pol、env和nef基因。

復(fù)制型天壇株痘苗病毒。是自1926年從天花患者的皰痂中分離出來的病毒，經(jīng)連續(xù)傳代減毒而獲得。一期臨床實(shí)驗(yàn)：2005年3月12日開始，在廣西進(jìn)行，共有49名志愿者接受了疫苗的注射。二期臨床實(shí)驗(yàn)：2009仍在廣西進(jìn)行，將有230名志愿者開展一系列實(shí)驗(yàn)研究。經(jīng)過基因操作技術(shù)將4個(gè)毒力基因剔除，用4個(gè)HIV基因取代。研究進(jìn)展：*90三、滾動復(fù)制和D環(huán)復(fù)制（自習(xí)）

某些低等生物中存在一種單向復(fù)制的特殊方式——滾環(huán)復(fù)制（rollingcirclereplication）。如ΦΧ174和M13噬菌體，爪蟾卵rDNA。*91

線粒體DNA（mitochondrialDNA,mtDNA）采用另一種單向復(fù)制的特殊方式，稱為D-環(huán)或取代環(huán)式（displacementloop）復(fù)制。*92第五節(jié)DNADamage(Mutation)andRepairDNA損傷(突變)與修復(fù)*93學(xué)習(xí)要求：

掌握DNA損傷(突變)的概念、突變的類型，切除修復(fù)的基本原理。熟悉突變的意義、引發(fā)因素，光修復(fù)、SOS修復(fù)及重組修復(fù)的概念。了解光修復(fù)、SOS修復(fù)及重組修復(fù)的機(jī)制?；蚪MDNA分子序列的異常變化，稱為DNA突變(mutation)，或DNA損傷(DNAdamage)。一、突變的意義（1）突變是進(jìn)化、分化的分子基礎(chǔ)（2）突變導(dǎo)致基因基因多態(tài)性產(chǎn)生（3）突變是某些疾病的發(fā)病基礎(chǔ)（4）突變可導(dǎo)致死亡*94①物理因素:

紫外線(ultraviolet,UV)、各種輻射。②化學(xué)因素：

化學(xué)誘變劑，大多數(shù)是致癌物。③生物誘變劑：*如可移動遺傳因子，即能在基因組中移

動的DNA序列。

如：病毒(如逆轉(zhuǎn)錄病毒)二、引發(fā)突變的因素*95DNA分子上的堿基錯配又稱點(diǎn)突變(pointmutation)發(fā)生在同型堿基之間，即嘌呤代替另一嘌呤，或嘧啶代替另一嘧啶。轉(zhuǎn)換發(fā)生在異型堿基之間，即嘌呤變嘧啶或嘧啶變嘌呤。顛換1.錯配(mismatch)三、突變的分子改變類型*96鐮形紅細(xì)胞貧血病人Hb(HbS)β亞基N-Val

·

His

·

Leu

·

Thr

·

Pro·Val

·

Glu

·

·

·

·

C肽鏈CACGTG基因正常成人Hb(HbA)β亞基N-Val

·His

·

Leu

·Thr

·

Pro·Glu

·

Glu

·

·

·

·

·

C肽鏈CTCGAG基因*972.缺失、插入和框移突變?nèi)笔В阂粋€(gè)堿基或一段核苷酸鏈從DNA大分子上消失。插入：原來沒有的一個(gè)堿基或一段核苷酸鏈插入到DNA大分子中間。缺失或插入都可導(dǎo)致框移(frameshift)突變或稱移碼突變：是指讀碼框三聯(lián)體密碼的閱讀方式改變,造成蛋白質(zhì)氨基酸排列順序發(fā)生改變。*98谷酪蛋絲5’……GCA

GUA

CAU

GUC……丙纈組纈正常5’……GAG

UAC

AUG

UC……缺失C缺失引起框移突變*99由基因重排引起兩種地中海貧血基因型3.重排(rearrangement)DNA分子內(nèi)較大片段的交換，又稱為重組或重排。*100四、DNA損傷的修復(fù)DNA修復(fù)(DNArepair)直接修復(fù)(directrepair)