植物檢疫性病害的檢測及防除研究方法技術(shù)課件

緒論目的：發(fā)現(xiàn)、檢出和鑒定有害生物，作為出證或檢疫處理的依據(jù)（食品安全，化妝品安全，疾病控制）方式：現(xiàn)場檢查、實(shí)驗(yàn)室檢驗(yàn)一檢疫（QUARANTINE)檢疫Quarantine是拉丁語，原意是40。14世紀(jì)，歐洲發(fā)生了一場非常大的鼠疫流行。當(dāng)時(shí)整個(gè)歐洲流行鼠疫，死亡了2000萬人，也就是當(dāng)時(shí)歐洲1/4的人口因患鼠疫而死掉了。感染了鼠疫的病人先是淋巴結(jié)潰爛，接著是引起肺部的病變，到后期由于缺氧，整個(gè)皮膚變黑。到死的時(shí)候，整個(gè)人是黑的。黑死病流行非常廣泛，在歐洲的一些港口城市，為防止疫病的侵入，對來往船只采取了限制措施。最早是在1377年的拉古薩共和國（相當(dāng)于現(xiàn)在的克羅地亞）頒布了對海員的管理規(guī)則，規(guī)定來自疫區(qū)的人員必須在海港以外一定距離的小島上停留30天，然后才能進(jìn)港。后來意大利的威尼斯港規(guī)定，若有船隊(duì)從疫區(qū)來，必須在小島上停留40天。由此拉丁語“40”－－－“quarantine”一詞就具有英語“檢疫”的意思。人類在社會實(shí)踐中逐漸認(rèn)識到防止外來的動植物有害生物傳播和蔓延也可采取檢疫的措施來達(dá)到目的。因此也就有了動植物檢疫。動植物檢疫最初是單純的隔離檢疫，后來人類的認(rèn)識不斷提高，認(rèn)識到在人類活動越來越頻繁，地區(qū)間貿(mào)易越來越多的情況下，有害生物已不單單可以通過植物或動物進(jìn)行傳播，動植物產(chǎn)品、運(yùn)輸工具和其他物品也可以是有害生物傳播的媒介，單純的隔離檢疫已不能全面防止外來有害生物的傳播和蔓延。動植物檢疫才逐漸演變成現(xiàn)在的模式。并且檢疫的內(nèi)容還在不斷地完善?，F(xiàn)行的動植物檢疫就是通過對進(jìn)出境貨物、運(yùn)輸工具、郵寄物、人員攜帶物實(shí)施檢疫，防止外來有害生物傳入，保護(hù)農(nóng)、林、牧、漁業(yè)生產(chǎn)和人體健康，促進(jìn)對外經(jīng)濟(jì)貿(mào)易的發(fā)展。二、植物檢疫的意義外來有害生物的危害外來（有害）生物的傳入對農(nóng)林業(yè)生產(chǎn)和人民身體健康造成危害，還將造成生態(tài)系統(tǒng)多樣性、物種多樣性、生物遺傳資源多樣性的喪失和破壞。導(dǎo)致外來有害生物大爆發(fā)的因素天敵：自然界存在著一個(gè)生物鏈。生物的生存和發(fā)展在當(dāng)?shù)厥艿礁鞣矫嬉蛩氐闹萍s，處于一個(gè)相對平衡的狀態(tài)，有害生物也不例外。但是，一旦有害生物傳入到一個(gè)新的地區(qū)，沒有了生物（天敵）的制約，將導(dǎo)致種群的大發(fā)展，大爆發(fā)；環(huán)境：傳入地區(qū)的環(huán)境如果適宜外來有害生物的生存和發(fā)展，將導(dǎo)致外來有害生物的大爆發(fā)和危害；寄主：外來有害生物有了新的食物（寄主）或易感病寄主，導(dǎo)致大爆發(fā)；人為因素：外來有害生物傳入初期由于人們沒有看到它的危害（危害有量變到質(zhì)變的過程），沒有引起人們的足夠重視和防治，沒有防微杜漸，最后導(dǎo)致大爆發(fā)；人們對外來有害生物危害性認(rèn)識不足，缺乏對其生物學(xué)特性的了解，缺乏防治的經(jīng)驗(yàn)和有效的方法和手段或沒有及時(shí)采取防治措施，導(dǎo)致外來有害生物的大爆發(fā)和危害。動植物檢疫的目的境外的植物病、蟲、雜草，動物傳染病和寄生蟲病可能隨著進(jìn)境的貨物（動植物、動植物產(chǎn)品和其他檢疫物）、運(yùn)輸工具、旅客攜帶物、郵寄物傳入，從而對我國境內(nèi)的動植物、動植物產(chǎn)品，人體健康和環(huán)境造成威脅或潛在的威脅。為防止外來有害生物傳入和危害，必須實(shí)施動植物檢疫。三、重大歷史事件及動植物檢疫的起源

馬鈴薯晚疫病

1845年，愛爾蘭由于從美洲傳入馬鈴薯晚疫病，導(dǎo)致病害大流行，使馬鈴薯造受了毀滅性災(zāi)害。當(dāng)時(shí)，僅800萬人口的愛爾蘭島死于饑荒者達(dá)20萬人，外出逃荒者164萬人。引起了全世界的震驚。這就是有名的“愛爾蘭大饑荒”。

葡萄根瘤蚜

1860年，法國從美國引進(jìn)了葡萄苗，結(jié)果也從美國傳入了葡萄的害蟲－－葡萄根瘤蚜，結(jié)果在25年內(nèi)使250萬英畝葡萄園毀滅，經(jīng)濟(jì)損失達(dá)200萬法郎。地中海實(shí)蠅地中海實(shí)蠅是一種能危害200多種水果和蔬菜的世界公認(rèn)的頭號害蟲。1980年美國本土從夏威夷傳入地中海實(shí)蠅后，僅1981年就花費(fèi)了十幾個(gè)億的美元來防治地中海實(shí)蠅。當(dāng)年有30多個(gè)國家和地區(qū)（包括中國）禁止從美國進(jìn)口水果和蔬菜，給美國的水果生產(chǎn)商一個(gè)沉重的打擊。廣肩星天牛光肩星天牛是一種破壞性極大的林木害蟲，生長在中國、日本、朝鮮半島等地區(qū)。1996年以來，美國紐約、芝加哥等地發(fā)生光肩星天牛的危害。據(jù)美國有關(guān)方面統(tǒng)計(jì)，光肩星天牛一旦在美國傳播開來，將對美國槭糖業(yè)、旅游業(yè)和生態(tài)環(huán)境造成約1380億美元的直接經(jīng)濟(jì)損失。因此，美國將光肩星天牛的發(fā)生歸咎于中國輸美貨物木質(zhì)包裝攜帶入境，并以此為由于1998年9月11日對中國所有輸美貨物木質(zhì)包裝采取了緊急檢疫措施，要求所有貨物木質(zhì)包裝在出口前必須經(jīng)過熏蒸等除害處理，否則將被銷毀或連同貨物一并退回。繼美國之后，歐盟、加拿大等國家和地區(qū)也相繼對我國出口木質(zhì)包裝提出了嚴(yán)格的檢疫要求，嚴(yán)重阻礙了我國具木質(zhì)包裝貨物的出口，一是大大增加了出口成本，二是延遲了出口的時(shí)間。無論在主觀和客觀上都起到了技術(shù)性貿(mào)易壁壘的作用。一場世界性的蔓延大戰(zhàn)就此拉開了序幕。松材線蟲松材線蟲是一種能夠?qū)е箩樔~樹致病和死亡的植物有害生物，原產(chǎn)于北美。二戰(zhàn)結(jié)束后通過日本被美國占領(lǐng)，松材線蟲也隨著木質(zhì)包裝（包裝軍需品）等傳到日本。我國于1982年首次在江蘇南京中山陵發(fā)現(xiàn)了松材線蟲病。當(dāng)時(shí)發(fā)病死亡的松材線蟲僅265株。現(xiàn)在此病已在全國十二個(gè)省市、自治區(qū)、特別行政區(qū)迅速蔓延。發(fā)生面積已超過8萬公頃，死亡的寄主樹木2000萬株以上，累計(jì)給中國造成直接經(jīng)濟(jì)損失近50億元、對社會和生態(tài)等產(chǎn)生的間接損失上百億元。在重點(diǎn)發(fā)生區(qū)，部分林地已退化為荒山，疫區(qū)相關(guān)農(nóng)副產(chǎn)品和林產(chǎn)品的流通和出口也直接受到影響。為防止松材線蟲的傳入，中國政府于2000年1月1日開始對美、日進(jìn)口的貨物木質(zhì)包裝實(shí)施檢疫。2001年10月1日起，歐盟因中國部分地區(qū)有松材線蟲的危害，也針對中國出口歐盟的貨物木質(zhì)包裝采取了檢疫措施。植物檢疫的起源據(jù)資料記載，法國里昂地區(qū)在1660年首先制定了鏟除小蘗并禁止其傳入，以防止小麥桿銹病的法令。法國在從美國引進(jìn)葡萄苗時(shí)導(dǎo)致葡萄根瘤蚜蔓延，約1/3（10萬ha）的葡萄園絕收，造成重大損失。為此法國政府于1872年頒布了禁止從國外輸入葡萄枝條的法令。為避免引起國際貿(mào)易糾紛，防止此類事件的發(fā)生，1881年在瑞士簽約了《葡萄根瘤蚜（芽）公約》，這是世界上第一個(gè)防止植物危險(xiǎn)性病蟲害的國際條約。該公約在防止葡萄根瘤蚜的傳播方面起到積極的作用。美國的葡萄根瘤蚜傳入法國并造成了嚴(yán)重災(zāi)害后，美國農(nóng)業(yè)部于1912年頒布了國家植物檢疫法令，以防止植物病蟲害在國際間的傳播。1912年，美國佛羅里達(dá)的柑橘潰瘍病大發(fā)生，造成了嚴(yán)重的危害，美國花費(fèi)了巨資進(jìn)行防治，因此，美國植物檢疫法把柑橘潰瘍病為主的柑橘病蟲害列為嚴(yán)格禁止進(jìn)境的對象。國際植物保護(hù)公約的產(chǎn)生為了進(jìn)一步發(fā)揮國際植物檢疫的作用，在《葡萄根瘤蚜（芽）公約》的基礎(chǔ)上，于1929年在羅馬將其修改為《國際植物保護(hù)公約》，并成立了國際植物保護(hù)公約組織（IPPC）。國際動物衛(wèi)生組織的產(chǎn)生國際動物衛(wèi)生組織（OIE）成立于1924年。《國際動物衛(wèi)生法典》由OIE在1961年制定并通過。2001年4月中國檢驗(yàn)檢疫的產(chǎn)生：國家質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)檢疫總局主權(quán)的體現(xiàn)管理職能的體現(xiàn)四、進(jìn)出口商品檢驗(yàn)

（食用性植物產(chǎn)品）

進(jìn)出口商品檢驗(yàn)

（INSPECTION)

通過對進(jìn)出口商品的檢驗(yàn)，達(dá)到保護(hù)人類健康和安全、保護(hù)動物或植物的生命健康、保護(hù)環(huán)境、防止欺詐行為、維護(hù)國家安全的目的。

食用性植物產(chǎn)品檢驗(yàn)由于科學(xué)的發(fā)達(dá)和人類對健康的重視，發(fā)達(dá)國家和一些發(fā)展中國家不僅對致病微生物十分關(guān)注，而且越來越重視藥物殘留和重金屬超標(biāo)的問題，限量的要求也越來越高。已苛刻到無法接受的程度，這就是所謂的技術(shù)性貿(mào)易壁壘措施。對食用性動植物產(chǎn)品實(shí)施檢驗(yàn)就是要檢驗(yàn)這些產(chǎn)品是否含有致人生病的微生物，農(nóng)、獸藥和重金屬殘留是否超標(biāo)，以保證人類食用安全。對進(jìn)出口供人類食用的動植物產(chǎn)品實(shí)施檢驗(yàn)就是要使進(jìn)出口的產(chǎn)品符合我國或進(jìn)口國的衛(wèi)生要求，符合食用標(biāo)準(zhǔn)，促進(jìn)外貿(mào)的發(fā)展。致病微生物動植物、動植物產(chǎn)品在養(yǎng)殖、生產(chǎn)、加工、儲藏和運(yùn)輸過程中都有可能感染致人生病的微生物，人類接觸或食用后將導(dǎo)致感病，危害健康，嚴(yán)重的將導(dǎo)致死亡。高致病性禽流感H5N1：O157大腸感菌：日本（死亡7萬）李斯特菌：法國金色葡萄球菌腸毒素：日本雪牌牛奶（死亡14500人）藥物殘留動物、植物在飼養(yǎng)和種植過程由于生病、生蟲或外部環(huán)境的影響，需要使用相應(yīng)的農(nóng)藥、獸藥或飼料添加劑等農(nóng)藥類化學(xué)品來進(jìn)行預(yù)防和治療。因此在動物、植物及其產(chǎn)品中有可能存在一定的藥物殘留。動植物生長期間在吸取養(yǎng)分和水分的同時(shí)有可能吸取了污染于其中的重金屬，導(dǎo)致體內(nèi)重金屬含量超標(biāo)。人類食用農(nóng)、獸殘或重金屬超標(biāo)的食品后會受到危害。以含抗生素的牛奶為例，人類食用含抗生素超標(biāo)的牛奶后，不僅會增加人體內(nèi)細(xì)菌的耐藥性，一旦患病，很可能無藥可治，而且會抑制和殺死人體內(nèi)正常的寄生的菌落，破壞腸道內(nèi)細(xì)菌的平衡，降低人體的免疫力，引起感染性疾病。長期飲用“有抗奶”相當(dāng)于經(jīng)常低劑量服用抗生素，會增加人體耐藥性，對于過敏體質(zhì)的消費(fèi)者而言，還可能會引起皮疹、過敏性休克等反應(yīng)。

生鮮牛乳收購標(biāo)準(zhǔn)國家標(biāo)準(zhǔn)委員會相關(guān)專家委員會已通過對《生鮮牛乳收購標(biāo)準(zhǔn)》的審核，有望在近期正式出臺，屆時(shí)“有抗奶”將被叫停。農(nóng)作物農(nóng)藥殘留有機(jī)磷殺蟲劑：甲胺磷、對硫磷、甲基對硫磷、久效磷和磷胺（2007年1月1日禁用），甲拌磷、乙拌磷、甲基異硫磷、氧化樂果等；有機(jī)氯殺蟲劑：六六六、滴滴涕、硫丹、林丹和七氯等；除蟲菊酯：聯(lián)苯菊酯、氯氰菊酯、氯氰菊脂、氰戊菊脂等；殺菌劑：惡醚唑等?？蓸凤L(fēng)波可口可樂公司和百事可樂公司在印度12個(gè)邦生產(chǎn)的11種軟飲料的57份樣本中，林丹、毒死蜱和七氯等殺蟲劑的平均含量為10億分之11．85，比印官方規(guī)定的10億分之0．5高出20多倍。而在加爾各答銷售的可口可樂中林丹含量是規(guī)定標(biāo)準(zhǔn)的140倍，而孟買附近生產(chǎn)的可口可樂中毒死蜱的含量是規(guī)定標(biāo)準(zhǔn)的200倍！印度的一個(gè)地方法院要求可口可樂和百事可樂公司公布可樂的配方?？蓸饭緵]有過濾地下水，所以認(rèn)為水源污染是最大的可能。由于印度對農(nóng)藥使用管理很不嚴(yán)格，濫用殺蟲劑，結(jié)果使大部分地下水都受到了污染，可樂罐裝廠抽取地下水制造可樂，自然也受到了污染。兩大美國可樂巨頭沒有對取自印度的地下水做足夠的過濾，沒有應(yīng)用有效的凈化水源技術(shù)。獸藥殘留漁藥殘留添加劑藥殘綠霉素出口蝦仁、小龍蝦出口蜂蜜飼料添加劑硝基呋喃硝基呋喃類（Nitrofurans）是一類合成的抗菌藥物，它們作用于微生物酶系統(tǒng)，抑制乙酰輔酶A，干擾微生物糖類的代謝，從而起抑菌作用。水生動物：出口活鰻、烤鰻、河豚和小龍蝦；牲畜：出口腸衣。鹽酸克倫特羅俗稱瘦肉精食用豬肉內(nèi)臟后出現(xiàn)心慌、手腳不由自主抖動、頭暈、乏力，心率加速、肌肉顫動、頭痛、惡心、發(fā)熱及寒戰(zhàn)?？兹甘G孔雀石綠是一種帶有金屬光澤的綠色結(jié)晶體，其既是殺真菌劑，又是染料，長期以來，漁民都用它來預(yù)防魚的水霉病、鰓霉病、小瓜蟲病等，而且為了使鱗受損的魚延長生命，在運(yùn)輸過程中和存放池內(nèi)，也常使用孔雀石綠?？兹甘G是一種具有高毒、高殘留及“三致”（致畸、致癌、致突變）的殺菌劑。出口日本的活鰻。硫丹對人有致突變作用。對中樞神經(jīng)系統(tǒng)有損害。主要損害中樞神經(jīng)系統(tǒng)的運(yùn)動中樞、小腦、腦干和肝、腎、生殖系統(tǒng)，為致腫瘤物?？梢痼@厥。一般表現(xiàn)為頭痛、痙攣、口吐泡沫，嗜睡，震顫。硫丹是一種農(nóng)藥，用于防治螨等有害生物，一般用于農(nóng)作物的防治在出口日本的泥鰍，活鰻等檢測殘留超標(biāo)。蘇丹紅1號蘇丹紅1號是一種紅色染料。蘇丹紅1號具有致癌性，我國和歐盟都禁止其用于食品生產(chǎn)。2005年2月18日，英國食品標(biāo)準(zhǔn)署就食用含有添加蘇丹紅色素的食品向消費(fèi)者發(fā)出警告，并在其網(wǎng)站上公布了亨氏、聯(lián)合利華等30家企業(yè)生產(chǎn)的可能含有蘇丹紅1號的產(chǎn)品清單。由于發(fā)現(xiàn)含有蘇丹紅1號成分，全國所有肯德基餐廳停止售賣新奧爾良烤翅和新奧爾良烤雞腿堡兩種產(chǎn)品，同時(shí)銷毀所有剩余調(diào)料。

重金屬超標(biāo)動植物、動植物產(chǎn)品在飼養(yǎng)、種植和生產(chǎn)加工過程中會受到環(huán)境（土壤、水）的污染，造成重金屬超標(biāo)，人類食用后危害嚴(yán)重。重金屬：鉻、鎘、汞、砷、鉛、氟等檢疫對象出入境的植物，植物產(chǎn)品交通運(yùn)輸工具人員攜帶物快件第二章植物檢疫程序法定檢驗(yàn)檢疫目錄列入目錄內(nèi)的商品通過評定程序：抽樣，檢驗(yàn)和檢查，評估，驗(yàn)證和合格保證；注冊認(rèn)可和批準(zhǔn)另外一些必須進(jìn)行檢驗(yàn)的入境貨物：廢舊物品，出口紡織品非必須檢驗(yàn)檢疫的進(jìn)出口商品進(jìn)行抽查檢驗(yàn)，有關(guān)機(jī)構(gòu)公布檢驗(yàn)結(jié)果檢驗(yàn)合格加施檢疫標(biāo)志進(jìn)境，出境，過境的植物，植物產(chǎn)品和其他檢疫物（臘腸非洲不容許進(jìn)口）裝載動植物檢疫物的裝載容器，包裝物，鋪墊材料來自植物疫區(qū)的運(yùn)輸工具（禽流感）進(jìn)境拆解的廢舊船舶法律法規(guī)國際條約的植物退回或銷毀處理：檢疫監(jiān)管；消毒處理入境植物檢疫程序出境植物檢疫程序出入境集裝箱檢疫交通工具和人員檢疫植物檢疫工作流程報(bào)檢申報(bào)（報(bào)檢員提交單證，資料）計(jì)收費(fèi)抽樣采樣（形式實(shí)驗(yàn)，處理加工）檢驗(yàn)檢疫衛(wèi)生除害處理（木質(zhì)包裝）簽證放行（檢驗(yàn)檢疫處理證，合格證書，通行證）報(bào)檢員自理報(bào)檢單位代理報(bào)檢單位報(bào)檢員資格考試合格人員取得報(bào)考員資格證，兩年內(nèi)未從事報(bào)檢業(yè)務(wù)的，自動失效報(bào)檢員資格對檢疫檢驗(yàn)技術(shù)的要求①準(zhǔn)確可靠，靈敏高度，能檢出低量有害生物；②快速、簡單、方便易行；③有標(biāo)準(zhǔn)化的操作規(guī)程，檢驗(yàn)結(jié)果重復(fù)性好④安全，不擴(kuò)散有害生物。檢驗(yàn)檢疫的樣品同一國家和地區(qū)來源，同一運(yùn)輸工具，同一品名（種苗則為同一品種）的貨物統(tǒng)稱為一批，按批進(jìn)行檢驗(yàn)、放行或處理。通常一批貨物的數(shù)量很大，不可能全部檢驗(yàn)，必須按規(guī)定的方法從批的總體中抽取適當(dāng)數(shù)量的代表性部分，稱為樣品，用以檢驗(yàn)。每份送檢樣品量的規(guī)定：谷物、棉籽、瓜子、飼料類為1000g；大粒種子（玉米、蠶豆等）1000~1500g；小粒種子（芝麻）500g；蔬菜、煙草：10~100g；蔥頭、紅棗、馬鈴薯等：2000~5000g。取樣方法的依據(jù)有害生物的分布規(guī)律貨物的數(shù)量裝載方式等因素確定樣品數(shù)量（容量）大小依據(jù)有害生物的帶有率;檢驗(yàn)方法的靈敏度;檢驗(yàn)所要求的精度;貨物種類與特點(diǎn);檢驗(yàn)所允許的時(shí)間和花費(fèi)等許多因素確定。有害生物的帶有率越低，檢驗(yàn)方法的靈敏度越低，檢驗(yàn)精度要求越高，所需樣品數(shù)量就越多。檢驗(yàn)檢疫的方法真菌主要由培養(yǎng)方法檢出，根據(jù)形態(tài)特征鑒定；細(xì)菌、病毒及與之類似的有害生物則需應(yīng)用多種生物學(xué)的、生理生化的和免疫學(xué)的技術(shù)檢驗(yàn)；線蟲和雜草種子主要由直接檢驗(yàn)和機(jī)械分離而檢出，根據(jù)形態(tài)特征鑒定。第一節(jié)植物病原真菌的檢驗(yàn)檢疫技術(shù)病原真菌的屬、種主要依據(jù)其形態(tài)特征鑒定，有時(shí)形態(tài)相似的近似種類需接種寄主，測定其致病性。鑒定病原真菌?；秃托》N，也需接種鑒別寄主。除洗滌檢驗(yàn)法的檢驗(yàn)結(jié)果用單位重量種子的孢子負(fù)載量表示外，其它檢驗(yàn)方法都能獲得帶菌百分率或發(fā)病百分率。一、直接檢驗(yàn)

是用于檢驗(yàn)檢疫具有明顯癥狀的植物材料，可作初步的診斷現(xiàn)場快速檢查肉眼，放大鏡或?qū)嶓w顯微鏡。

二、過篩檢驗(yàn)

檢驗(yàn)糧谷、種子、油料、干果和生藥材，檢驗(yàn)病粒，菌嬰、菌核、病殘?bào)w等種子過篩后可檢出夾雜的菌癭、菌核、病株殘屑和土壤，都需仔細(xì)鑒別。小麥矮腥黑穗病的菌嬰三、比重檢驗(yàn)法原理：菌嬰、菌核和病秕籽粒都要比健康的籽粒輕。用于種子、糧谷、豆類中的菌嬰、菌核和病秕籽粒。

四、染色檢驗(yàn)法

某些植物或植物器官被病原感染后，或某些病原菌本身，?？捎锰厥獾幕瘜W(xué)藥品處理，使其染上特有顏色，利于檢出和區(qū)分病蟲種類

洗滌檢驗(yàn)法用于檢測種子表面附著的真菌孢子，包括黑粉菌的厚垣孢子、霜霉菌的卵孢子、銹菌的夏孢子以及多種半知菌的分生孢子等。洗滌檢驗(yàn)的操作程序一定數(shù)量的種子樣品放入容器并加入定量蒸餾水或其它洗滌液，振蕩5-10min，使孢子脫離種子，轉(zhuǎn)移到洗滌液中。洗脫孢子將孢子洗滌液移入離心管，低速離心（2500-3000r／min）10-15min，使孢子沉集在離心管底部。離心富集棄去離心管內(nèi)的上清液，加入一定量蒸餾水或其它浮載液，重新懸浮沉集在離心管底部孢子，取懸浮液。滴加在血球計(jì)數(shù)板上，用高倍顯微鏡檢查孢子種類并計(jì)數(shù)，據(jù)此可計(jì)算出種子的帶菌量。鏡檢計(jì)數(shù)用常規(guī)孢子萌發(fā)測定法、分離培養(yǎng)法或紅四氯唑（TTC）染色法判定孢子死活。孢子生活力測定影響洗滌檢驗(yàn)的因素種子或其他糧谷類產(chǎn)品表面所黏附的病菌孢子不一定能完全洗滌下來;離心管內(nèi)容已形成一層極難沉降的孢子薄膜。管壁也可能黏附孢子;視野內(nèi)孢子分布不均勻;操作不規(guī)范，不嚴(yán)格。

保濕萌芽檢驗(yàn)法

適用于病菌隨種子萌發(fā)或幼苗生長階段就開始侵然危害，并表現(xiàn)癥狀的病原菌。優(yōu)點(diǎn)：容易檢查根部和綠色部分，也可避免相互傳染。缺點(diǎn)：腐生菌干擾；病菌之間干擾。

沙內(nèi)萌芽檢驗(yàn)－主要用于植物繁殖材料的入境后隔離檢疫。供試材料種植在經(jīng)過高壓蒸汽滅菌處理或干熱滅菌的沙礫、石英砂中，在隔離場所和適宜條件下栽培，根據(jù)幼苗和成株的癥狀鑒定。土內(nèi)萌芽檢驗(yàn)試管幼苗癥狀測定－在試管中水瓊脂培養(yǎng)基斜面上播種種子，在適宜條件下培養(yǎng)，根據(jù)幼苗癥狀、結(jié)合病原菌檢查，確定種傳真菌種類。生長檢驗(yàn)花費(fèi)時(shí)間長，使其應(yīng)用受到限制。保濕培養(yǎng)檢驗(yàn)

優(yōu)點(diǎn)－設(shè)備簡單、操作方便、花費(fèi)少、快速準(zhǔn)確;缺點(diǎn)－某些菌絲生長不旺盛和產(chǎn)孢少，雜菌已影響

有利于病原菌形成孢子，同時(shí)又避免因種子萌芽伸長過快造成相互覆蓋，便于檢查冰凍吸水法：含水量均勻一致，有利于病菌生長，皿內(nèi)潔凈，雜菌少。

瓊脂平皿法：

吸水紙法：

培養(yǎng)皿

培養(yǎng)皿

吸水紙

培養(yǎng)皿

蒸餾水種子

培養(yǎng)皿

日光或紫外燈

20-25℃7-10d

實(shí)體顯微鏡下逐粒種子檢查

特別注意觀察種子上菌絲體的顏色、疏密程度和生長特點(diǎn)、真菌繁殖結(jié)構(gòu)的類型和特征。

培養(yǎng)皿吸水紙培養(yǎng)檢驗(yàn)法實(shí)例種子

1％-2％次氯酸鈉溶液和抗菌素表面消毒5-10min植床于培養(yǎng)基平板上，在適宜溫度和光照下培養(yǎng)7-10d手持放大鏡從培養(yǎng)皿兩面觀察，依據(jù)菌落形態(tài)、色澤來鑒別真菌種類必要時(shí)挑取培養(yǎng)物制片，用高倍顯微鏡檢查瓊脂培養(yǎng)基培養(yǎng)檢驗(yàn)七、分離培養(yǎng)檢驗(yàn)主要應(yīng)用于檢驗(yàn)潛伏于種子、苗木或其他之物產(chǎn)品內(nèi)部，不易發(fā)現(xiàn)和鑒定的病原菌；當(dāng)種子、苗木或其他植物產(chǎn)品上雖有病斑，但無特殊的病原菌可供鑒定的場合。分離培養(yǎng)檢驗(yàn)方法根據(jù)不同的目的分為5種：種子表面或深層的病菌檢測病菌的潛伏部位了解種子外部附著的病菌種群檢驗(yàn)病菌種類、菌落類型和萌發(fā)率分離塊莖、塊根和苗木、接穗等繁殖材料所帶的病菌分離培養(yǎng)檢驗(yàn)步驟

消毒接種培養(yǎng)研究方法進(jìn)境美國小麥中黑麥草腥黑穗病菌的檢測和鑒定（洗滌檢測和熒光PCR）水稻腥黑粉病菌的單孢檢測（分離培養(yǎng)）大豆疫病的田間鑒定與防治第二節(jié)病原細(xì)菌的檢疫檢驗(yàn)技術(shù)

植物細(xì)菌病害有軟腐、環(huán)腐、萎蔫、潰瘍、瘡痂、枝枯、葉斑、組織增生（癭瘤、發(fā)根）等多種癥狀。葉片上病斑常呈水漬狀，上有細(xì)菌溢膿。病部切片鏡檢可見細(xì)菌溢。田間診斷――了解病害和寄主的群體特征，即病害在田間發(fā)生的情況，以及當(dāng)?shù)氐淖魑镌耘嗉案髑闆r。初步診斷――通過肉眼觀察植株的癥狀、病原分泌物以及鏡檢觀察。例如水稻細(xì)菌性條斑?。∫恍K病葉組織，低倍鏡下觀察，微管束有噴菌現(xiàn)象。

進(jìn)一步診斷

分離培養(yǎng)：選擇新鮮的病斑或病鍵組織交界處――表面消毒――清水洗凈――碾碎稀釋――劃線培養(yǎng)――觀察提取液系列稀釋在金氏B（KB）培養(yǎng)基平板上涂布在25℃和無光照條件下培養(yǎng)3d后紫外光或近紫外光照射下有藍(lán)色熒光的菌落，為假單胞桿菌，可能是暈?zāi)璨【x擇典型菌落作進(jìn)一步的鑒定菜豆種傳暈?zāi)璨【姆蛛x致病性測定：目的是區(qū)分致病性細(xì)菌和腐生菌。

過敏性反應(yīng)(Hypersensitivereaction,HR)是指病原細(xì)菌在非寄主植物上引起枯斑反應(yīng)的現(xiàn)象，腐生性細(xì)菌則不表現(xiàn)典型的枯斑。大部分病原細(xì)菌，特別是Pseudomonas屬的病原細(xì)菌注射到煙草葉片上，能在24小時(shí)內(nèi)產(chǎn)生枯斑反應(yīng)。接種方法

按照柯赫氏法則，從發(fā)病植物上得到的分離物，在健康的寄主植物上接種發(fā)病并與先前癥狀一致，然后再次從發(fā)病部位分離到與先前相同的分離物，才能證明該分離物是引致這種病害的病原物。常用的接種方法有噴霧、注射、針刺和浸泡等。操作：細(xì)菌溢膿或分離純化細(xì)菌――自然或人工接種――觀察針刺接種法接種甘藍(lán)葉片中肋如確系該菌，則接種部位軟腐、維管束褐變切片置于1.5％水瓊脂平板上，在28℃和黑暗條件下培養(yǎng)3d生理生化及快速測定法生化測定試劑盒：鑒定某一類細(xì)菌的關(guān)鍵碳源、氮源、特殊酶和有機(jī)酸等并附有比較和檢索用的計(jì)算機(jī)數(shù)據(jù)庫。Biolog測定：美國Biolog公司研制的專門鑒定細(xì)菌的專家系統(tǒng)。將大量的細(xì)菌生理生化測定參數(shù)與先進(jìn)的計(jì)算機(jī)技術(shù)有機(jī)的結(jié)合起來。噬菌體檢測噬菌體是感染細(xì)菌的病毒，能在活細(xì)菌細(xì)胞中寄生繁殖，破壞和裂解寄主細(xì)胞，在液體培養(yǎng)時(shí)，使混濁的細(xì)菌懸浮液變得澄清，在固體平板上培養(yǎng)時(shí)，則出現(xiàn)許多邊緣整齊，透明光亮的圓形無菌空斑，稱為“噬菌斑”，肉眼即可分辯。噬菌體法的主要優(yōu)點(diǎn)是簡便、快速，能直接用種子提取液測定。缺點(diǎn)是非目標(biāo)菌多量存在時(shí)敏感性較差，噬菌體的寄生?；院图?xì)菌對噬菌體的抵抗性都可能影響檢驗(yàn)的準(zhǔn)確性。

取10g稻種，脫下谷殼，剪碎或磨碎，放入已滅菌處理的燒杯中取10g稻種，脫下谷殼，剪碎或磨碎，放入已滅菌處理的燒杯中混勻后加入10ml融化的肉汁胨瓊脂培養(yǎng)基，搖勻凝成平板在25-28℃溫箱中，培養(yǎng)10-12h記載各培養(yǎng)皿中的噬菌斑數(shù)，然后再換算成每克種子的噬菌斑數(shù)細(xì)菌的?；允删w測定酶聯(lián)免疫吸附技術(shù)(ELISA)--酶聯(lián)免疫吸附測定(Enzymelinkedimmunologyassay,ELISA)是把抗原、抗體的免疫反應(yīng)和酶的高效催化反應(yīng)有機(jī)結(jié)合而發(fā)展起來的一種綜合技術(shù)。血清學(xué)檢測技術(shù)血清學(xué)檢測技術(shù)ELISA的測定方法:直接法、間接法、競爭法、酶抗酶法、雙夾心法、雙抗體夾心法等6種。ELISA的特征:靈敏度高，特異性強(qiáng)，安全、快速并易觀察。它可進(jìn)行定性定量測定，適于大批量樣品的檢查、可用于病害普查，口岸檢疫和產(chǎn)地檢疫等。雙抗體夾心法間接法

競爭法免疫熒光技術(shù)原理--將熒光物與微生物抗體結(jié)合得到熒光抗體，熒光抗體與相應(yīng)的抗原結(jié)合，在熒光顯微鏡下發(fā)生熒光，以此來檢測抗原。免疫熒光技術(shù)有直接法和間接法兩種，在實(shí)踐中常用間接法，一抗與結(jié)合有熒光色素的二抗結(jié)合，通過免疫熒光顯微鏡來檢測所發(fā)出的熒光。免疫熒光技術(shù)診斷試劑盒分子檢測技術(shù)PCR檢測技術(shù)是利用相應(yīng)的引物，在DNA聚合酶催化下對目標(biāo)DNA進(jìn)行體外擴(kuò)增，根據(jù)預(yù)期DNA條帶的有無來判斷檢測的結(jié)果。分子檢測技術(shù)其特異性取決于引物和擴(kuò)增反應(yīng)條件;靈敏度取決于每次分析樣品中目標(biāo)病原菌的最低劑量，以及樣品制備方法對PCR反應(yīng)的影響。PCR的快速檢測，引物尤其重要，通常有下列特異性基因和DNA序列供設(shè)計(jì)PCR引物用于檢測和鑒定病原菌。特異性基因或DNA序列用于檢測病原菌利用病原菌的致病基因--以病原菌的致病基因?yàn)槟繕?biāo)，設(shè)計(jì)特異性引物，通過PCR擴(kuò)增進(jìn)行病原菌特異性檢測例如土壤桿菌Agrobacterium的菌株，所有致病菌株都有介導(dǎo)DNA在細(xì)菌和寄主間轉(zhuǎn)導(dǎo)的毒性基因(Vir基因)，詳細(xì)了解致病機(jī)制后，可以設(shè)計(jì)出許多針對該致病性基因序列的DNA引物。核糖體DNA基礎(chǔ)的PCR策略細(xì)菌核糖體DNA的操縱子由3個(gè)有功能的保守序列16SrDNA,23SrDNA和5SrDNA組成，由可變異的轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)(InternallyTranscribedSpacer,ITS)分隔。擴(kuò)增DNA保守區(qū)域的引物通常稱做通用引物，己經(jīng)在廣泛的系統(tǒng)進(jìn)化變異細(xì)菌中應(yīng)用，來擴(kuò)增核糖體基因片段。通過核糖體基因庫(/RDP/)和核糖體基因擴(kuò)增產(chǎn)物的序列分析，選擇病菌專化序列，設(shè)計(jì)專化引物，可以用來?；瘷z測病原細(xì)菌。分子檢測試劑盒研究方法河北鴨梨黑斑病病原菌的鑒定番茄上兩種細(xì)菌性病害的診斷與防治梨火疫病菌噬菌體的初步研究Biolog系統(tǒng)和16SrDNA序列分析方法在植物病原細(xì)菌鑒定中的應(yīng)用第三節(jié)植物病毒檢驗(yàn)檢疫技術(shù)病毒（virus）是一組（一種或一種以上）DNA或RNA核酸分子，包圍在蛋白或脂蛋白外殼內(nèi)，在合適的寄主細(xì)胞借助于寄主蛋白合成體系、物質(zhì)和能量完成復(fù)制，伴隨核酸突變發(fā)生變異。主要特征：①結(jié)構(gòu)簡單的（核酸+蛋白或脂蛋白衣殼）；②嚴(yán)格專性寄生的（依賴寄主的核酸和蛋白質(zhì)合成系統(tǒng)）；③非細(xì)胞生物（分子寄生物）。非典型肺炎”元兇冠狀病毒生物學(xué)檢測技術(shù)

鑒別寄主檢測--以鑒別寄主反應(yīng)或指示植物為依據(jù)的方法。曾廣泛運(yùn)用，目前卻由于其檢測速度慢、受環(huán)境和季節(jié)影響較大等諸多因素限制，而運(yùn)用較少。電子顯微鏡觀察目前通常認(rèn)為運(yùn)用負(fù)染和超薄切片電鏡觀察能診斷和鑒別植物病毒，一般可診斷到屬的水平。免疫學(xué)檢測法酶聯(lián)免疫吸附測定(ELISA)快速免疫濾紙測定法(Rapidimmunoafterpaperassay,RIPA)免疫膠體金技術(shù)(Immune

colloidal

gold

technique)免疫印跡法--Western印跡(Westernblot)；斑點(diǎn)免疫結(jié)合技術(shù)(Dotimmunobindingassay,DIBA)組織免疫印跡(Tissue-blotimmunoassay,TBIA)

快速免疫濾紙測定法(Rapidimmunoafterpaperassay,RIPA)快速免疫濾紙測定類似乳膠凝集反應(yīng)。其原理是把待測病毒的抗體吸附在乳膠顆粒上，通過大顆粒乳膠間接反應(yīng)小顆粒病毒的存在，所不同的是RIPA使用了一種紅色乳膠，從而使檢測更加簡單和直觀，RIPA測檢測提純TMV的靈敏度分別可達(dá)5ngPml/50ngPml免疫膠體金技術(shù)(Immune

colloidal

gold

technique)G處為金標(biāo)抗體(免疫金)，T處包被抗體，C處包被抗金標(biāo)抗體，B處為吸水紙。測試時(shí)A端滴加待測標(biāo)本，通過層析作用，待測標(biāo)本向B端移動，流經(jīng)G處時(shí)將金標(biāo)抗體復(fù)溶，若待測標(biāo)本中含待測抗原，即形成金標(biāo)抗體-抗原復(fù)合物，移至T區(qū)時(shí)，形成金標(biāo)抗體-抗原-抗體復(fù)合物，金標(biāo)抗體被固定下來，在T區(qū)顯示紅色線條，呈陽性反應(yīng)，多余的金標(biāo)記抗體移至C區(qū)被抗金標(biāo)抗體捕獲，呈現(xiàn)紅色質(zhì)控線條。

免疫用抗原來源提純病毒粒子；原核或真核表達(dá)外殼蛋白單克隆抗體的制備多克隆抗體的制備抗原分子生物學(xué)檢測方法

多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)分子信標(biāo)(Molecularbeacon)TaqMan實(shí)時(shí)RT-PCR(Real-timeRT-PCR)核酸雜交技術(shù)(Nucleicacidhybridization)多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)RT-PCR嵌套PCR雙重PCR多重PCR雜交誘捕PCR-ELISA實(shí)時(shí)熒光PCR反應(yīng)前：“分子信標(biāo)”為一發(fā)夾型探針，探針的柄部兩端序列互補(bǔ)，使其呈發(fā)夾狀，環(huán)與靶序列互補(bǔ)。位于柄部的５’和３’端分別標(biāo)記熒光染料和猝火劑。在發(fā)夾關(guān)閉時(shí)，熒光染料和猝滅劑極端靠近，熒光幾乎完全被猝滅分子信標(biāo)(Molecularbeacon)變性：“分子信標(biāo)”柄部因高溫變性而呈卷曲狀，熒光染料遠(yuǎn)離淬滅劑，發(fā)出熒光分子信標(biāo)(Molecularbeacon)退火：“分子信標(biāo)”發(fā)夾環(huán)部因與靶序列互補(bǔ)而雜交，“分子信標(biāo)”發(fā)夾完全展開，發(fā)出熒光：如無靶序列存在“分子信標(biāo)”因柄部序列互補(bǔ)回復(fù)發(fā)夾，無熒光分子信標(biāo)(Molecularbeacon)延伸：“分子信標(biāo)”因升溫與靶序列脫離，延伸反應(yīng)順利進(jìn)行分子信標(biāo)(Molecularbeacon)反應(yīng)結(jié)束：“分子信標(biāo)”與擴(kuò)增產(chǎn)物雜交發(fā)出熒光，熒光強(qiáng)度與擴(kuò)增產(chǎn)物量成正比分子信標(biāo)(Molecularbeacon)雜交誘捕PCR-ELISA原理實(shí)時(shí)熒光PCR原理

核酸斑點(diǎn)雜交技術(shù)原理：采用帶有放射性或非放射性物質(zhì)標(biāo)記的已知序列核酸單鏈作為探針，在一定條件下與靶病毒的核酸單鏈退火形成雜交雙鏈。通過雜交信號的檢測，檢測出樣本中病毒的基因組份。其優(yōu)點(diǎn)是可檢測同種病毒的不同株系，還可檢測類病毒、衛(wèi)星ＲＮＡ以及某些不能形成病毒粒體蛋白的病毒分離物；缺點(diǎn)是同位素標(biāo)記有放射性污染及安全問題。分子生物學(xué)和免疫學(xué)相結(jié)合檢測方法免疫捕獲反轉(zhuǎn)錄PCR（ImmunocapturereversetranscriptPCR,IC-RT-PCR）反轉(zhuǎn)錄PCR擴(kuò)增研究方法日本進(jìn)口南瓜的病毒隔離檢疫和田間疫情監(jiān)測煙草環(huán)斑病毒的檢疫檢測方法番茄斑萎病毒的檢疫技術(shù)侵染觀賞南瓜的黃瓜綠斑駁花葉病毒的初步鑒定第四節(jié)植物病原線蟲的檢疫檢驗(yàn)技術(shù)植物病原線蟲是軀體很小，而內(nèi)部又有各種較復(fù)雜器官的低等動物，再加上其一些特殊的分布和生物學(xué)習(xí)性等，檢測方法有所不同。罹病樣品的采集及保存方法罹病植物――采集有明顯癥狀的地上或地下部分土壤樣本――20－30cm耕作層的土壤，定點(diǎn)或棋盤式多點(diǎn)采樣。保存方法――所有材料均應(yīng)裝入塑料袋中保濕，及時(shí)分離或4度低溫保存。植物寄生線蟲的各種分離方法直接解剖法--內(nèi)生線蟲在體視顯微鏡下用解剖針直接解剖病組織簡易貝爾曼漏斗法:分離少量植物材料中有活動能力的線蟲。浸入漏斗12h清洗材料切成小段收集線蟲裹紗布淺盤法――20目和300目的網(wǎng)篩各一個(gè)，材料放入鋪有線蟲濾紙的不銹鋼盆內(nèi)，25度左右浸泡1d，過篩收集線蟲。

卡勃過篩分離法――本法用于從大量土壤中分離各類線蟲。懸浮土壤――0.5min靜置――過篩，由大到小。線蟲的殺死固定技術(shù)熱力殺死：1.臨時(shí)加熱殺死――在災(zāi)玻片上加熱5－6s，線蟲突然伸直時(shí)即殺死了。2.溫和加熱殺死――65度水浴中加熱2min。