蛋白質(zhì)的分離和純化

（優(yōu)選）蛋白質(zhì)的分離和純化當(dāng)前第1頁(yè)\共有42頁(yè)\編于星期六\10點(diǎn)一、蛋白質(zhì)的分離

2.根據(jù)蛋白質(zhì)各種特性的差異，如分子的形狀和大小、所帶電荷的性質(zhì)和多少、溶解度、吸附性質(zhì)和對(duì)其他分子的親和力等等，可以用來(lái)分離不同種類(lèi)的蛋白質(zhì)。Q:下列蛋白質(zhì)如何提??？酸性蛋白質(zhì)；水溶性蛋白質(zhì)；脂溶性蛋白質(zhì)；

偏堿性溶液透析液（中性緩沖液）有機(jī)溶劑原理1.根據(jù)細(xì)胞的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)，選擇不同的破碎細(xì)胞的方法（如研磨法、超聲波法、酶解法等），使各種蛋白質(zhì)釋放出來(lái)。當(dāng)前第2頁(yè)\共有42頁(yè)\編于星期六\10點(diǎn)一、蛋白質(zhì)的分離

1.抽提方法：（1）酸性蛋白質(zhì)：

（2）水溶性蛋白質(zhì)：

（3）脂溶性蛋白質(zhì)：偏堿性溶液透析液（中性緩沖液）有機(jī)溶劑當(dāng)前第3頁(yè)\共有42頁(yè)\編于星期六\10點(diǎn)二、常用的分離方法1.離心沉降法2.薄膜透析法3.凝膠色譜法4.電泳法當(dāng)前第4頁(yè)\共有42頁(yè)\編于星期六\10點(diǎn)

1.離心沉降法

原理：通過(guò)控制離心速率，使得分子大小、密度不同的物質(zhì)發(fā)生分層沉降，從而分離出不同種類(lèi)蛋白質(zhì)。離心時(shí)相對(duì)分子質(zhì)量大的物質(zhì)先沉淀。當(dāng)前第5頁(yè)\共有42頁(yè)\編于星期六\10點(diǎn)2.薄膜透析法

（1）原理：利用蛋白質(zhì)分子不能透過(guò)半透膜的特性，可將蛋白質(zhì)與其他小分子化合物分離開(kāi)。（2）方法：將待分離的蛋白質(zhì)溶液裝入用半透膜制成的透析袋內(nèi)，再將透析袋放入透析液中便可進(jìn)行透析。

半透膜能使小分子自由進(jìn)出，而大分子保留在袋內(nèi)。

當(dāng)前第6頁(yè)\共有42頁(yè)\編于星期六\10點(diǎn)

小分子雜質(zhì)（無(wú)機(jī)鹽、單糖、二糖及氨基酸等）從透析袋中出來(lái)，而蛋白質(zhì)留在袋內(nèi)。當(dāng)前第7頁(yè)\共有42頁(yè)\編于星期六\10點(diǎn)3.蛋白質(zhì)分離的方法：（1）透析法當(dāng)前第8頁(yè)\共有42頁(yè)\編于星期六\10點(diǎn)3.凝膠色譜法(1)凝膠：由多糖類(lèi)化合物（如葡聚糖、瓊脂糖）構(gòu)成的多孔球體，內(nèi)含許多貫穿的通道(2)原理：大分子通過(guò)多孔凝膠顆粒的間隙，路程短，流動(dòng)快；小分子穿過(guò)多孔凝膠顆粒內(nèi)部，路程長(zhǎng)，流動(dòng)慢。(3)作用：使樣品中分子大小不同的蛋白質(zhì)按順序分離出來(lái)當(dāng)前第9頁(yè)\共有42頁(yè)\編于星期六\10點(diǎn)下圖中最早洗脫下來(lái)的是什么？為什么？當(dāng)前第10頁(yè)\共有42頁(yè)\編于星期六\10點(diǎn)當(dāng)前第11頁(yè)\共有42頁(yè)\編于星期六\10點(diǎn)分子量大小直徑大小大于凝膠顆粒空隙直徑，被阻擋在顆粒的外面小于凝膠顆?？障吨睆?，可以進(jìn)入顆粒內(nèi)部運(yùn)動(dòng)方式垂直向下移動(dòng)垂直向下移動(dòng)，無(wú)規(guī)則擴(kuò)散進(jìn)入顆粒內(nèi)部運(yùn)動(dòng)速度較快較慢運(yùn)動(dòng)路徑較短較長(zhǎng)洗脫次序先從凝膠柱洗脫出來(lái)后從凝膠柱洗脫出來(lái)當(dāng)前第12頁(yè)\共有42頁(yè)\編于星期六\10點(diǎn)用凝膠色譜法分離蛋白質(zhì)時(shí)，分子量大的蛋白質(zhì)A．路程較長(zhǎng)，移動(dòng)速度較慢B．路程較長(zhǎng)，移動(dòng)速度較快C．路程較短，移動(dòng)速度較慢D．路程較短，移動(dòng)速度較快D當(dāng)前第13頁(yè)\共有42頁(yè)\編于星期六\10點(diǎn)相對(duì)分子質(zhì)量不同的蛋白質(zhì)在凝膠中的進(jìn)行過(guò)程可表示為圖中哪一個(gè)B當(dāng)前第14頁(yè)\共有42頁(yè)\編于星期六\10點(diǎn)

4.電泳

(1)概念：帶電粒子在電場(chǎng)作用下發(fā)生遷移的過(guò)程。

方向：向著與其所帶電荷相反的電極移動(dòng)。

(2)泳動(dòng)速度和方向：

速度：帶電分子的遷移速度跟各種分子帶電性質(zhì)的差異以及分子本身的大小,形狀有關(guān)。

一般來(lái)說(shuō)，帶電顆粒所帶凈電荷越多，直徑越小，越接近于球形，則在電場(chǎng)中的泳動(dòng)速度越快；反之，則越慢。

電泳分離時(shí)，電荷量相差越大的物質(zhì)相距越遠(yuǎn)。當(dāng)前第15頁(yè)\共有42頁(yè)\編于星期六\10點(diǎn)醋酸纖維薄膜電泳瓊脂糖凝膠電泳SDS—聚丙稀酰胺凝膠電泳：測(cè)定蛋白質(zhì)相對(duì)分子質(zhì)量。

SDS能使蛋白質(zhì)完全變性，SDS所帶電荷大大超過(guò)了蛋白質(zhì)原有電荷。

遷移率取決于分子大小。(3)類(lèi)型（載體）:當(dāng)前第16頁(yè)\共有42頁(yè)\編于星期六\10點(diǎn)使用SDS-聚丙烯酰胺電泳過(guò)程中，不同蛋白質(zhì)的電泳遷移率完全取決于A電荷的多少B分子的大小C肽鏈的多少D分子形狀的差異當(dāng)前第17頁(yè)\共有42頁(yè)\編于星期六\10點(diǎn)下列有關(guān)蛋白質(zhì)提取和分離的說(shuō)法，錯(cuò)誤的是 (

)A.透析法分離蛋白質(zhì)的原理是利用蛋白質(zhì)不能通過(guò)半透膜的特性B.采用透析法使蛋白質(zhì)與其他小分子化合物分離開(kāi)來(lái)C.離心沉降法通過(guò)控制離心速率使分子大小、密度不同的蛋白質(zhì)分離D.蛋白質(zhì)在電場(chǎng)中可以向與其自身所帶電荷相同的電極方向移動(dòng)D當(dāng)前第18頁(yè)\共有42頁(yè)\編于星期六\10點(diǎn)三、血紅蛋白的提取和分離

1.樣品處理

2.粗分離

3.純化

4.純度鑒定當(dāng)前第19頁(yè)\共有42頁(yè)\編于星期六\10點(diǎn)1.樣品處理（1）洗滌紅細(xì)胞（低速短時(shí)離心，生理鹽水）目的：去除雜蛋白。

血樣先低速短時(shí)離心分離紅細(xì)胞，然后吸出上層透明的黃色血漿，將下層暗紅色的紅細(xì)胞液體倒入燒杯，再加入五倍體積的生理鹽水，緩慢攪拌10min，低速短時(shí)間離心，如此重復(fù)洗滌三次，直至上清液中沒(méi)有黃色，表明紅細(xì)胞已洗滌干凈。低速離心：防止白細(xì)胞沉淀。緩慢攪拌：防止紅細(xì)胞破裂釋放出血紅蛋白。檸檬酸鈉：防止血液凝固。當(dāng)前第20頁(yè)\共有42頁(yè)\編于星期六\10點(diǎn)（2）血紅蛋白的釋放

在蒸餾水和甲苯作用下，紅細(xì)胞破裂釋放出血紅蛋白。注：加入蒸餾水后紅細(xì)胞液體積與原血液體積要相同。甲苯：溶解細(xì)胞膜，有利于血紅蛋白的釋放和分離。蒸餾水作用：使紅細(xì)胞吸水脹破當(dāng)前第21頁(yè)\共有42頁(yè)\編于星期六\10點(diǎn)1、洗滌紅細(xì)胞的目的是

A.去除血清

B.去除雜蛋白C.除去血小板D.除去水B當(dāng)前第22頁(yè)\共有42頁(yè)\編于星期六\10點(diǎn)2、選用紅細(xì)胞作為分離蛋白質(zhì)的實(shí)驗(yàn)材料，有何好處（）A.血紅蛋白是有色蛋白B.紅細(xì)胞無(wú)細(xì)胞核C.紅細(xì)胞蛋白質(zhì)含量高D.紅細(xì)胞DNA含量高A當(dāng)前第23頁(yè)\共有42頁(yè)\編于星期六\10點(diǎn)3、為了提取血紅蛋白，從學(xué)校附近的屠宰場(chǎng)取新鮮的豬血，對(duì)豬血處理的正確操作是

()A.要在采血容器中預(yù)先加入抗凝血?jiǎng)幟仕徕cB.重復(fù)洗滌直到上清液呈紅色為止C.將離心后的血細(xì)胞加入清水緩慢攪拌D.取血回來(lái)后，馬上進(jìn)行高速長(zhǎng)時(shí)間離心A當(dāng)前第24頁(yè)\共有42頁(yè)\編于星期六\10點(diǎn)

（3）分離血紅蛋白溶液

將攪拌好的混合溶液中速長(zhǎng)時(shí)離心后，試管中的溶液分為4層。第一層為無(wú)色透明的甲苯層，第二層為脂溶性物質(zhì)的沉淀層，第三層是血紅蛋白的水溶液，第四層是其他雜質(zhì)的暗紅色沉淀物。將試管中的液體用濾紙過(guò)濾，除去之溶性沉淀層，于分液漏斗中靜置片刻后，分出下層的紅色透明液體。當(dāng)前第25頁(yè)\共有42頁(yè)\編于星期六\10點(diǎn)分離血紅蛋白溶液有機(jī)溶劑（無(wú)色透明的甲苯層）脂類(lèi)物質(zhì)（白色脂溶性物質(zhì)沉淀層）血紅蛋白溶液（紅色透明液體）紅細(xì)胞破碎物沉（暗紅色沉淀物）當(dāng)前第26頁(yè)\共有42頁(yè)\編于星期六\10點(diǎn)

取1mL的血紅蛋白溶液裝入透析袋中，將透析袋放入盛有300mL的物質(zhì)的量的濃度為20mmol/L的磷酸緩沖液（PH=7）中，透析12h。透析可以去除樣品中分子量較小的雜質(zhì)，或用于更換樣品的緩沖液?！咀ⅰ烤彌_液作用：抵制外界酸、堿對(duì)溶液pH的影響而保持pH穩(wěn)定。使用PH=7的磷酸緩沖液，有利于維持血紅蛋白的正常特性。2.粗分離---薄膜透析法當(dāng)前第27頁(yè)\共有42頁(yè)\編于星期六\10點(diǎn)1、下列操作正確的是（）A.分離紅細(xì)胞時(shí)采用低速長(zhǎng)時(shí)間離心B.紅細(xì)胞釋放出血紅蛋白只需要加入蒸餾水就可C.分離血紅蛋白溶液是低速短時(shí)間離心D.透析時(shí)要用20mmol/l的磷酸緩沖液，透析12hD當(dāng)前第28頁(yè)\共有42頁(yè)\編于星期六\10點(diǎn)2、在蛋白質(zhì)的提取和分離中，關(guān)于對(duì)樣品處理過(guò)程中，分析無(wú)誤的是（）A

洗滌紅細(xì)胞的目的是去除血漿中的葡萄糖、無(wú)機(jī)鹽B

洗滌時(shí)離心速度過(guò)小，時(shí)間過(guò)短，白細(xì)胞等會(huì)沉淀，達(dá)不到分離的效果C

洗滌過(guò)程選用0.1%的生理鹽水D

透析的目的是去除樣品中相對(duì)分子質(zhì)量較小的雜質(zhì)D當(dāng)前第29頁(yè)\共有42頁(yè)\編于星期六\10點(diǎn)

3.純化--凝膠色譜法

去除相對(duì)分子量大的雜質(zhì)蛋白當(dāng)前第30頁(yè)\共有42頁(yè)\編于星期六\10點(diǎn)凝膠色譜柱的裝填

凝膠的前處理：配置凝膠懸浮液：計(jì)算并稱(chēng)取一定量的凝膠浸泡于蒸餾水或洗脫液中充分溶脹后，配成凝膠懸浮液。

凝膠色譜柱的裝填方法：A、固定：將色譜柱裝置固定在支架上。B、裝填：將凝膠懸浮液一次性的裝填入色譜柱內(nèi)，裝填時(shí)輕輕敲動(dòng)色譜柱，使凝膠填裝均勻。注意：1、凝膠裝填時(shí)盡量緊密，以降低凝膠顆粒之間的空隙。2、裝填凝膠柱時(shí)不得有氣泡存在：因?yàn)闅馀輹?huì)攪亂洗脫液中蛋白質(zhì)的洗脫次序，降低分離效果。當(dāng)前第31頁(yè)\共有42頁(yè)\編于星期六\10點(diǎn)

洗滌平衡：裝填完畢后，立即用緩沖液洗脫瓶，在50cm高的操作壓下，用300ml的磷酸緩沖液（pH為7.0）充分洗滌平衡12小時(shí)。注意：1、液面不要低于凝膠表面，否則可能有氣泡混入，影響液體在柱內(nèi)的流動(dòng)與最終生物大分子物質(zhì)的分離效果。2、不能發(fā)生洗脫液流干，露出凝膠顆粒的現(xiàn)象。凝膠色譜柱的裝填50cm高當(dāng)前第32頁(yè)\共有42頁(yè)\編于星期六\10點(diǎn)樣品加入與洗脫

①調(diào)節(jié)緩沖液面：打開(kāi)下端出口，使柱內(nèi)緩沖液緩慢下降到與凝膠面平齊，關(guān)閉出口。

②滴加透析樣品：吸管吸1ml樣品加到色譜柱的頂端，滴加樣品時(shí)，吸管管口貼著管壁環(huán)繞移動(dòng)加樣，同時(shí)注意不要破壞凝膠面。

③樣品滲入凝膠床：加樣后打開(kāi)下端出口，使樣品滲入凝膠床內(nèi)，等樣品完全進(jìn)入凝膠層后，關(guān)閉下端出口。④洗脫：小心加入pH=7.0的20mmol/l的磷酸緩沖液到適當(dāng)高度，連接緩沖液洗脫瓶，打開(kāi)下端出口進(jìn)行洗脫。

⑤收集：待紅色的蛋白質(zhì)接近色譜柱底端時(shí)，用試管收集流出液，每5ml收集一試管，連續(xù)收集。（在分離過(guò)程中，如果紅色區(qū)帶均勻一致的移動(dòng)，說(shuō)明色譜柱制作成功）

當(dāng)前第33頁(yè)\共有42頁(yè)\編于星期六\10點(diǎn)1、在裝填凝膠柱時(shí)，不能有氣泡存在的原因()A、氣泡會(huì)攪亂洗脫液中蛋白質(zhì)的洗脫次序，降低分離效果B、氣泡阻礙蛋白質(zhì)的運(yùn)動(dòng)C、氣泡與蛋白質(zhì)發(fā)生化學(xué)反應(yīng)D、氣泡在裝填凝膠的時(shí)候，使凝膠不緊密A當(dāng)前第34頁(yè)\共有42頁(yè)\編于星期六\10點(diǎn)2、樣品的加入和洗脫的操作不正確的是A

加樣前，打開(kāi)色譜柱下端的流出口，使柱內(nèi)凝膠面上的緩沖液緩慢下降到凝膠面的下面B．加樣后，打開(kāi)下端出口，使樣品滲入凝膠床內(nèi)C．等樣品完全進(jìn)入凝膠層后，關(guān)閉下端出口D．用吸管小心的將1ml透析后的樣品加到色譜柱的頂端，不要破壞凝膠面A當(dāng)前第35頁(yè)\共有42頁(yè)\編于星期六\10點(diǎn)4.純度鑒定---SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳當(dāng)前第36頁(yè)\共有42頁(yè)\編于星期六\10點(diǎn)

蛋白質(zhì)的提取和分離一般分為四步：（1）樣品處理：包括洗滌紅細(xì)胞；血紅蛋白釋放；分離血紅蛋白溶液。（2）粗分離：薄膜透析法除去分子較小的雜質(zhì)。（3）純化：通過(guò)凝膠色譜法將分子量較大的雜質(zhì)蛋白質(zhì)除去。（4）純度鑒定：通過(guò)聚丙烯酰胺凝膠電泳鑒定。（以血紅蛋白的分離純化為例）三、蛋白質(zhì)提取分離的程序當(dāng)前第37頁(yè)\共有42頁(yè)\編于星期六\10點(diǎn)1、下列關(guān)于DNA和血紅蛋白的提取與分離屬于的敘述中，錯(cuò)誤的是()A.可用蒸餾水漲破細(xì)胞的方法從豬紅細(xì)胞中提取到DNA和蛋白質(zhì)B.用不同濃度的NaCl溶液反復(fù)溶解于析出DNA可去除部分雜質(zhì)C.透析法分離蛋白質(zhì)的依據(jù)是利用蛋白質(zhì)不能通過(guò)半透膜的特性D.進(jìn)一步分離與純化血紅蛋白可用凝膠色譜法、離心法、電泳法等A當(dāng)前第38頁(yè)\共有42頁(yè)\編于星期六\10點(diǎn)2、下列關(guān)于血紅蛋白提取和分離實(shí)驗(yàn)中樣品處理步驟的描述，正確的是()A.紅細(xì)胞的洗滌：加入蒸餾水，緩慢攪拌，低速短時(shí)間離心B.血紅蛋白的釋放：加入生理鹽水和甲苯，置于磁力攪拌器上充分?jǐn)嚢鐲.分離血紅蛋