根癌農(nóng)桿菌介導的植物基因遺傳轉(zhuǎn)化技術課件

根癌農(nóng)桿菌介導的植物基因遺傳轉(zhuǎn)化技術1精選課件2精選課件常用的植物基因轉(zhuǎn)化技術農(nóng)桿菌介導法植物病毒載體介導法（如CaMV）DNA直接導入法（PEG介導法、脂質(zhì)體法、基因槍法、電激法、激光微束法、顯微注射法等）種質(zhì)系統(tǒng)介導基因轉(zhuǎn)化（花粉管通道法等）其中農(nóng)桿菌介導法以其費用低、拷貝數(shù)低、重復性好、基因沉默現(xiàn)象少、轉(zhuǎn)育周期短及能轉(zhuǎn)化較大片段等獨特優(yōu)點而備受科學工作者的青睞3精選課件若干主要的植物細胞轉(zhuǎn)化方法的比較評價內(nèi)容植物轉(zhuǎn)化方法農(nóng)桿菌法PEG法電擊法微注射法基因槍法花粉管通道法受體材料外植體原生質(zhì)體懸浮細胞細胞或組織外植體卵細胞宿主限制有無無無無開花植物培養(yǎng)條件簡單復雜復雜復雜簡單無轉(zhuǎn)化頻率10-2~10-110-5~10-410-5~10-410-2~10-110-3~10-210-1~101嵌合體有無無無或有多無操作簡單簡單復雜更復雜復雜簡單設備要求便宜便宜昂貴昂貴昂貴簡便工作效率高低低更低高低4精選課件若干主要的植物細胞轉(zhuǎn)化方法的比較方法優(yōu)點缺點農(nóng)桿菌介導法轉(zhuǎn)化效率高主要以單拷貝或低拷貝形式插入不需要特殊的專用設備只能以T-DNA插入的方式導入寄主細胞化學法及電激法操作簡單轉(zhuǎn)化效率高同一實驗可處理許多樣品化學法不需要特殊的專用設備外源DNA重排率高，常為多拷貝形式插入化學法需通過原生質(zhì)體培養(yǎng)及其再生體系，才能產(chǎn)生有體細胞克隆變異的風險基因槍法不受物種界限的約束可用于不同的轉(zhuǎn)化樣品，如根、莖、葉、愈傷等需復雜的專用設備外源DNA重排率高，常為多拷貝形式插入顯微注射法不受物種界限的約束可用于不同的轉(zhuǎn)化樣品，如根、莖、葉、愈傷等需昂貴的專用設備需接受專門訓練的技術人員進行操作5精選課件與植物基因轉(zhuǎn)化有關的農(nóng)桿菌根癌農(nóng)桿菌（Agrobacteriumtumefaciens）：含有Ti(Tumor-inducingplasmid)質(zhì)粒，能誘導被侵染的植物細胞形成腫瘤，即誘發(fā)冠癭瘤。發(fā)根農(nóng)桿菌（Agrobacteriumrhizogenes）：含有Ri(root-inducingplasmid)質(zhì)粒，能夠誘導被侵染的植物細胞產(chǎn)生毛發(fā)狀根。根癌農(nóng)桿菌的Ti質(zhì)粒和發(fā)根農(nóng)桿菌Ri質(zhì)粒都具有一段轉(zhuǎn)移DNA(transferDNA，又稱T-DNA)，在農(nóng)桿菌侵染植物時，T-DNA可以插入到植物基因組中，使其攜帶的基因在植物中得以表達。由于T-DNA能夠進行高頻率的轉(zhuǎn)移，而且Ti質(zhì)粒和Ri質(zhì)粒上可插入大到甚至150kb的外源基因，因此，Ti質(zhì)粒和Ri質(zhì)粒已成為植物基因轉(zhuǎn)化中的理想載體系統(tǒng)。6精選課件根癌農(nóng)桿菌(Agrobacterium

tumefaciens)在植物基因工程的發(fā)展中,研究最清楚和應用最成功的是根癌農(nóng)桿菌介導的遺傳轉(zhuǎn)化,在已獲得的近200種轉(zhuǎn)基因植物中約80%是由該菌介導完成的.起初,人們認為農(nóng)桿菌僅能轉(zhuǎn)化雙子葉植物、裸子植物以及少數(shù)幾種單子葉植物;而近幾年,由于在一些重要的單子葉植物以及在真菌中應用農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化獲得了成功,該方法以轉(zhuǎn)基因低拷貝、遺傳穩(wěn)定以及能夠轉(zhuǎn)化大片段DNA等優(yōu)點又受到了人們極大的關注.7精選課件Ti質(zhì)粒Ti質(zhì)粒（tumor-inducingplasmid）：Ti質(zhì)粒是根癌農(nóng)桿菌染色體外的遺傳物質(zhì)，為雙鏈共價閉合的環(huán)狀DNA分子。Ti質(zhì)粒中有一段DNA，稱為T-DNA（transfer-DNA），能轉(zhuǎn)移并整合到植物基因組中，并導致冠癭瘤的形成8精選課件Ti質(zhì)?？煞譃?個功能區(qū)域：①T-DNA區(qū)：T-DNA是根癌農(nóng)桿菌侵染植物細胞時從Ti質(zhì)粒上切割下來轉(zhuǎn)移到植物細胞的一段DNA，含有編碼植物激素和冠癭堿的基因；②Vir區(qū)：Vir區(qū)上的基因能激活T-DNA轉(zhuǎn)移，使根癌農(nóng)桿菌表現(xiàn)出毒性；③Con區(qū)(接合轉(zhuǎn)移編碼區(qū))：該區(qū)段上存在與細菌間接合轉(zhuǎn)移的有關基因，調(diào)控Ti質(zhì)粒在農(nóng)桿菌之間的轉(zhuǎn)移；④Ori區(qū)(復制起始區(qū))：Ori區(qū)上的基因調(diào)控Ti質(zhì)粒的自我復制。9精選課件Ti質(zhì)粒介導轉(zhuǎn)化的過程農(nóng)桿菌吸附于植物的表面?zhèn)诓课皇芊宇愇镔|(zhì)（乙酰丁香酮或羥基乙酰丁香酮）的誘導，vir區(qū)基因被激活，virD基因編碼的核酸內(nèi)切酶分別將T-DNA的RB序列和LB序列切出單鏈切口，釋放出T-DNA的單鏈線性拷貝（T-鏈）T-鏈在RB序列的引導下定向穿過農(nóng)桿菌的細胞膜、細胞壁、進入植物細胞壁并整合到植物的染色體基因組中T-DNA在植物細胞中表達10精選課件整個過程大致可分為以下幾個步驟①根癌農(nóng)桿菌對植物細胞的識別和附著；②根癌農(nóng)桿菌對植物信號物質(zhì)的感受；③根癌農(nóng)桿菌Ti質(zhì)粒上的vir基因以及染色體上操縱子的活化；④T-DNA復合體的產(chǎn)生；⑤T-DNA復合體的轉(zhuǎn)運；⑥T-DNA整合到植物基因組中。11精選課件12精選課件植物表達載體構(gòu)建—

Onc卸甲載體（受體Ti質(zhì)粒）的構(gòu)建

野生型Ti質(zhì)粒不能直接用作克隆外源基因的載體：1.質(zhì)量過大2.酶切位點多3.T-DNA區(qū)Onc基因干擾宿主激素平衡4.不能在大腸桿菌中復制5冗余基因Onc卸甲載體：無毒的Ti質(zhì)粒載體。切除了T-DNA中的Onc致癌基因。缺失部分被大腸桿菌的常用質(zhì)粒pBR322區(qū)段（含Ampr)取代。任何適合于克隆在pBR322質(zhì)粒中的外源DNA片段都可以通過與pBR322質(zhì)粒DNA的同源重組而被共整合到Onc-Ti質(zhì)粒載體上。13精選課件改造后的Ti質(zhì)粒的基本結(jié)構(gòu)DNA復制起始位點選擇標記基因T-DNA的邊界序列多克隆位點左邊界序列右邊界序列14精選課件植物表達載體構(gòu)建—中間載體的構(gòu)建帶有重組T-DNA的大腸桿菌質(zhì)粒衍生載體稱為“中間載體”?；驹硎前裈區(qū)（即Ti質(zhì)粒能整合到植物基因組中去的一段DNA，總長度約為23kb）片段克隆到普通載體pBR322上，把外源基因插入到該T區(qū)后再導回受體細胞中，使外源DNA轉(zhuǎn)移到Ti質(zhì)粒上，再經(jīng)根癌土壤桿菌轉(zhuǎn)化植物把該外源片段導入植物體內(nèi)。15精選課件植物表達載體構(gòu)建—共整合載體系統(tǒng)(cointegratevectorsystem)

由卸甲Ti質(zhì)粒載體、中間表達載體組成。例如：pGV3850、pLGVneo1103外源基因首先克隆到一個中間載體（帶有重組T-DNA的大腸桿菌質(zhì)粒）上，該載體含有一段與缺失T-DNA的Ti質(zhì)粒有同源序列。當該載體進入土壤農(nóng)桿菌后，與Ti質(zhì)粒整合，然后由Ti質(zhì)粒提供T-DNA向植物細胞轉(zhuǎn)移的vir基因產(chǎn)物。16精選課件Ampr17精選課件pLGVneo1103Cointegrateplasmid18精選課件植物表達載體構(gòu)建—雙元載體系統(tǒng)(binaryvectorsystem)由微型質(zhì)粒、輔助Ti質(zhì)粒組成。例如：Bin19、pAL4404包括兩個彼此相容的穿梭載體（微型質(zhì)粒）和輔助Ti質(zhì)粒。

穿梭載體不帶有vir基因，但帶有大腸桿菌及土壤農(nóng)桿菌的復制起始位點。所有基因操作可以在大腸桿菌中完成，之后轉(zhuǎn)入一種經(jīng)修飾后的Ti質(zhì)粒農(nóng)桿菌中，該Ti質(zhì)粒包含一整套vir,但缺失T-DNA序列而無法轉(zhuǎn)移，這樣可提供僅vir基因產(chǎn)物幫助雙元載體轉(zhuǎn)移。19精選課件雙元載體桿菌與共整合載體所不同的是，它不依賴兩個質(zhì)粒之間的同源序列，不需要共整合過程就能在農(nóng)桿菌內(nèi)獨立復制，從大腸桿菌轉(zhuǎn)移到農(nóng)的頻率比共整合質(zhì)粒的轉(zhuǎn)移頻率高10000倍。且改造的Ti質(zhì)粒時其多克隆位點無導入pBR322質(zhì)粒的同源片段。lacZ’20精選課件21精選課件三親交配法（triparentalmating）

無論是共整合載體系統(tǒng)還是雙元載體系統(tǒng)，把中間載體質(zhì)粒由大腸桿菌轉(zhuǎn)移到土壤農(nóng)桿菌中都需要三種細菌參與，通常把這一過程稱為三親交配法

1.受體農(nóng)桿菌2.協(xié)助菌（帶有協(xié)助質(zhì)粒的大腸桿菌）3.供體菌（帶有重組植物表達載體的大腸桿菌）

原理：三種菌混合時，協(xié)助質(zhì)粒游動進入供體菌中，將供體菌中的表達載體轉(zhuǎn)移到受體菌中，最后經(jīng)過適當?shù)目股睾Y選即可獲得土壤農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化結(jié)合體22精選課件Ti質(zhì)粒介導的轉(zhuǎn)移轉(zhuǎn)化方法基本程序包括：含重組Ti質(zhì)粒的根癌農(nóng)桿菌的培養(yǎng)，選擇合適的外植體，根癌農(nóng)桿菌與外植體共培養(yǎng)，外植體脫毒及篩選培養(yǎng)，轉(zhuǎn)化植株再生等步驟。葉盤轉(zhuǎn)化法原生質(zhì)體(或愈傷組織)共培養(yǎng)轉(zhuǎn)化法整株感染法直接轉(zhuǎn)化法（電擊法，液氮冷凍法）23精選課件葉盤轉(zhuǎn)化法打孔器從消毒葉片上打孔，獲得圓形葉片，即葉盤將葉盤放入根癌農(nóng)桿菌液浸泡幾秒鐘，使根癌農(nóng)桿菌浸染葉盤濾紙吸干葉盤上多余的菌液，將處理過的葉盤置于培養(yǎng)基上共培養(yǎng)2～3d，再轉(zhuǎn)移到含有頭孢霉素或羧芐青霉素的培養(yǎng)基中，除去根癌農(nóng)桿菌。與此同時在該培養(yǎng)基中加入抗生素進行轉(zhuǎn)化體的篩選，使轉(zhuǎn)化細胞再生為植株。對這些再生植物進行分子檢測就可確定它們是否整合有目的基因及其表達情況。葉盤轉(zhuǎn)化法已在多種雙子葉植物上得到成功的應用。實際上，其他的多種外植體，例如莖段、葉柄、胚軸、子葉愈傷組織、萌發(fā)的種子均可采用類似的方法進行轉(zhuǎn)化。該方法的優(yōu)點是適用性廣且操作簡單，是目前應用最多的方法之一。24精選課件葉盤轉(zhuǎn)化法25精選課件原生質(zhì)體共培養(yǎng)轉(zhuǎn)化法以原生質(zhì)體作為受體細胞，通過將根癌農(nóng)桿菌與原生質(zhì)體作短暫的共培養(yǎng)，然后洗滌除去殘留的根癌農(nóng)桿菌后，置于含抗生素的選擇培養(yǎng)基上篩選出轉(zhuǎn)化細胞，進而再生成植株。與葉盤轉(zhuǎn)化法相比，此法得到的轉(zhuǎn)化體不含嵌合體，一次可以處理多個細胞，得到相對較多的轉(zhuǎn)化體。應用此法進行基因轉(zhuǎn)化時，其先決條件就是要建立起良好的原生質(zhì)培養(yǎng)和再生植物技術體系。

26精選課件整株感染法人為地在植株上造成創(chuàng)傷，然后把含有重組質(zhì)粒的根癌農(nóng)桿菌接種在創(chuàng)傷面上，或把含有重組質(zhì)粒的根癌農(nóng)桿菌注射到植物體內(nèi)，使菌體在植物體內(nèi)進行浸染實現(xiàn)轉(zhuǎn)化。為獲得較高的轉(zhuǎn)化頻率，多采用無菌種子的實生苗或試管苗。在篩選轉(zhuǎn)化體時，可將感染部位的薄壁組織切下放入選擇培養(yǎng)基上及誘發(fā)愈傷組織的培養(yǎng)基上進行篩選和愈傷組織誘導。最后將轉(zhuǎn)化的愈傷組織轉(zhuǎn)移至含合適植物激素的培養(yǎng)基上誘導再生植株在擬南芥(Arabidopsisthaliana)上，將根癌農(nóng)桿菌涂于植株腋芽處或頂牙，可長出轉(zhuǎn)化的新枝條，新的轉(zhuǎn)化枝條開花結(jié)實后，也可以獲得轉(zhuǎn)基因種子；或者通過真空滲透或農(nóng)桿菌浸泡擬南芥開花植株，等結(jié)實之后，利用篩選萌芽種子的方法，也可以得到轉(zhuǎn)基因植株及種子。。

27精選課件根癌農(nóng)桿菌介導轉(zhuǎn)化植株的基本程序

植物表達載體構(gòu)建（E.coli）選擇受體材料

重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌（三親）建立植株再生體系

遺傳轉(zhuǎn)化到宿主細胞（共培養(yǎng)）

轉(zhuǎn)化體篩選（抗生素）

植株再生（組織培養(yǎng)）

轉(zhuǎn)基因植株的檢測（PCR、分子雜交等）

田間試驗、遺傳分析、性狀鑒定28精選課件轉(zhuǎn)基因植株的檢測1報告基因的檢測：報告基因是具有明顯區(qū)別于受體細胞遺傳背景的選擇標記,因而易于進行轉(zhuǎn)化后的篩選。利用酶法分析、通過同位素放射性自顯影技術及底物的顏色反應可以快速鑒定報告基因的表達,從而有效地檢測出重組細胞或組織。根據(jù)報告基因編碼特點,大致分為兩類:抗性基因和編碼催化人工底物產(chǎn)生顏色變化的酶基因。2PCR檢測轉(zhuǎn)化植株：PCR是在體外快速特異地擴增目的基因DNA片段的有效方法。能在幾小時內(nèi)使pg水平的起始物達到ng乃至μg水平,擴增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳,溴化乙錠染色后很容易觀察,不通過雜交分析就可以鑒定出基因組中的一些順序。這項技術可用于轉(zhuǎn)化后外源基因的鑒定和植物基因組的分析3DNA水平：點雜交和Southern雜交，轉(zhuǎn)錄水平：Northern雜交，蛋白質(zhì)水平：Western雜交。這些技術需要轉(zhuǎn)膜、雜交,操作繁瑣,費用高,不適合大批量樣品的檢測,可對轉(zhuǎn)基因植株隨機取樣檢測

29精選課件轉(zhuǎn)基因植物的應用一、轉(zhuǎn)基因植物在植物分子生物學研究中的應用1、轉(zhuǎn)座子標簽法玉米的Ac/Ds、En/Spm和金魚草的Tam轉(zhuǎn)座子系統(tǒng)

Ds農(nóng)桿菌介導轉(zhuǎn)化Ac轉(zhuǎn)Ac植株轉(zhuǎn)Ds植株Ac/Ds植株從F2代篩選Ds插入目標突變植株自交突變植株基因組文庫突變基因克隆以Ds制備探針篩選文庫野生型植株基因組文庫以突變基因制備探針篩選文庫目標基因30精選課件2、T-DNA標簽法

3、反義RNA技術4、位點特異性重組技