第6章抗生素的生物合成課件

第六章抗生素的生物合成

及產(chǎn)生的遺傳學(xué)

.第一節(jié)研究方法

完整地闡明生物合成過程應(yīng)包括：(1)促成分子建成的初級代謝物結(jié)構(gòu)單元的確立。(2)代謝途徑中中間產(chǎn)物的分離；這些產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)可能會提供關(guān)于反應(yīng)次序問題的合理假設(shè)。(3)催化每一個反應(yīng)的酶的鑒定。(4)操縱基因及其序列和組成的確定。.一、追蹤技術(shù)為確定相應(yīng)的結(jié)構(gòu)單元，將所設(shè)想的抗生素前體用14C，3H或13C等同位素標(biāo)記，再將其加入到產(chǎn)生菌的培養(yǎng)物中，最好是在生長后期加入。經(jīng)過一段時(shí)間的培養(yǎng)后，提取其中相應(yīng)的抗生素，純化，檢測所摻入的同位素。在使用放射性同位素進(jìn)行標(biāo)記的過程中，常常需要對分子進(jìn)行化學(xué)降解，以確定放射性同位素所摻入的組成該分子的原子。.13C標(biāo)記前體在利用13C標(biāo)記前體時(shí)，摻入單個原子的情況可以通過產(chǎn)物的核磁共振(NMR)光譜來顯示。利用這項(xiàng)技術(shù)，分子中單個碳原子在共振光譜中以高峰出現(xiàn)，其高度與其中13C的含量幾乎成正比。標(biāo)記物的滲入度可由所標(biāo)記分子的峰值與天然產(chǎn)物的峰值之比來表示(13C的天然富足度為1.1％)。.2-13C標(biāo)記的乙酸摻入替考拉寧(A)通過常規(guī)發(fā)酵得出的替考拉寧13C-NMR光譜(δ20-125ppm帶)；(B)通過[2-13C]標(biāo)記的乙酸摻入發(fā)酵所得出的替考拉寧的光譜?？梢钥闯?，乙酸是二羥苯甘氨酸部分(小圓點(diǎn))和脂肪酸鏈(大圓點(diǎn))的前體物質(zhì)。.2H標(biāo)記前體物分子中兩個相鄰的原子對核磁共振光譜峰及其偶合常數(shù)的多重性的高分辨分析，可以揭示出兩個原子是否在整個代謝過程中都連結(jié)在一起，還是保持相對獨(dú)立，或是通過不同的代謝途徑摻入的。通過利用氘標(biāo)記的前體物的NMR的研究，同樣可以獲取重要的信息。與氫不同，氘在NMR中不會產(chǎn)生質(zhì)子的共振信號。在生物合成反應(yīng)機(jī)制的研究中，氘作為一種特殊的標(biāo)記物質(zhì)，在生物合成過程的反應(yīng)位點(diǎn)上取代單個或多個氫原子。在菌株培養(yǎng)過程中，這些中間產(chǎn)物則轉(zhuǎn)變?yōu)榻K產(chǎn)物分子。終產(chǎn)物分子的質(zhì)子NMR可以顯示在酶促反應(yīng)中，該原子是否被保留或被取代。.二、中間代謝物的鑒定生物合成反應(yīng)中某一步反應(yīng)不能進(jìn)行的突變株的分離，是用來鑒定合成途徑中某些中間產(chǎn)物的一種普遍采用的適宜手段。這些被稱為“阻斷變株”的突變體，常導(dǎo)致培養(yǎng)基中那些無法參與下一步反應(yīng)的底物的積累。阻斷變株可通過對產(chǎn)生菌進(jìn)行誘變處理，然后分離出那些不具有產(chǎn)生抗生素能力的菌落而獲得。將這些變株一次兩個在同一搖瓶內(nèi)培養(yǎng)，發(fā)酵液進(jìn)行抗菌活性的測定。.兩種不同的突變株進(jìn)行共培養(yǎng)突變株單獨(dú)培養(yǎng)時(shí)不能產(chǎn)生抗生素，但將兩種不同的突變株進(jìn)行共培養(yǎng)時(shí)，則可以產(chǎn)生抗生素，表明這兩種突變株的突變發(fā)生在生物合成途徑中的兩個不同的階段。其中一種變株所不能合成的中間物，可由另一種能積累該中間物的變株所提供，從而使抗生素合成的一系列反應(yīng)得以進(jìn)行。.所積累的產(chǎn)物可以被分離和鑒定為證實(shí)這些產(chǎn)物的確是生物合成途徑的中間產(chǎn)物，可以通過原始出發(fā)菌株，由這些中間產(chǎn)物轉(zhuǎn)變?yōu)榻K產(chǎn)物的實(shí)驗(yàn)以進(jìn)行評價(jià)。例如，我們可以將中間產(chǎn)物加入到產(chǎn)生菌的細(xì)胞懸浮物中，幾小時(shí)后，測定其中抗生素的生成量，再與對照組中合成抗生素的量進(jìn)行比較。

.三、酶的鑒定通過比較產(chǎn)抗生素株與不產(chǎn)抗生素變株中酶的活力，有時(shí)可以獲取有關(guān)生物合成途徑的一些信息。產(chǎn)抗生素株中一種酶活力的存在，與阻斷變株中該酶的缺失，即可有力地證明這種酶在該生物合成途徑中起著重要的作用。在示蹤技術(shù)和中間物的分離技術(shù)為生物合成次序的確定提供足夠信息的基礎(chǔ)上，有可能從酶的角度來研究單個合成反應(yīng)。.四、遺傳學(xué)與重組DNA技術(shù)在過去幾年里，由于有關(guān)基因的克隆分析等一系列技術(shù)的應(yīng)用，使次級代謝過程的生物合成和調(diào)節(jié)機(jī)制的研究取得了很大進(jìn)展。最初的研究發(fā)現(xiàn)，生物合成基因通常在染色體上成簇存在，在放線菌中尤其是這樣。進(jìn)一步研究又發(fā)現(xiàn)，在通常情況下，這些基因簇還包括調(diào)節(jié)基因和自身抗性基因。.確定生物合成基因兩種不同策略1．將某種抗生素產(chǎn)生菌(通常指放線菌)的其中一個基因文庫轉(zhuǎn)入到對該抗生素敏感的菌株中，篩選抗性克隆。從這些抗性克隆中分離出編碼自身抗性的基因，然后可以著手分離側(cè)翼的結(jié)構(gòu)基因。2．利用在相類似的生物合成途徑中功能相似的基因通常具有的高度的同源性，可將相類似的生物合成途徑的基因進(jìn)行雜交。生物合成基因確定后，將其核苷酸序列與數(shù)據(jù)庫中已知的序列進(jìn)行比較，可以揭示出基因產(chǎn)物的功能和特性，即其酶促作用和調(diào)節(jié)機(jī)能。而且，所推斷的酶的氨基酸序列可能有助于我們了解生物合成反應(yīng)的機(jī)制。.第二節(jié)

生物合成反應(yīng)與途徑合成抗生素的酶促反應(yīng)與生成初級代謝產(chǎn)物的中間代謝并非有根本的不同。事實(shí)上，催化特殊代謝物合成的酶是由普通代謝中的酶進(jìn)化而來。

.抗生素生物合成的途徑可分兩大類１．對初級代謝產(chǎn)物的修飾反應(yīng)。這類反應(yīng)與初級代謝物的合成與分解反應(yīng)相類似，例如象氨基酸或核苷酸的代謝反應(yīng)。這些反應(yīng)的產(chǎn)物可以是一種抗生素，或者是一種結(jié)構(gòu)較為復(fù)雜的抗生素的組成成分。在初級代謝物中，有的分子由兩個或兩個以上的單位組成，如葉酸或輔酶A等。2．相似代謝物的聚合。通過這些反應(yīng)，通常是先形成復(fù)雜而又關(guān)鍵的中間物，然后經(jīng)過進(jìn)一步修飾，生成具有活性的終產(chǎn)物分子。.葉酸蝶啶焦磷酸酯對氨基苯甲酸谷氨酸對氨基苯甲酰谷氨酸蝶啶焦磷酸酯.相似代謝物的聚合(1)來源于聚酮體合成的抗生素。其聚合反應(yīng)機(jī)制與脂肪酸合成反應(yīng)的機(jī)制相類似。(2)肽類抗生素，由氨基酸縮合而成，其過程與聚酮體合成的過程相似。(3)類異戊二烯類抗生素，由多個異戊二烯單位縮合而成。(4)氨基糖苷類抗生素，由多個糖單位聚合而成，類似于多糖的合成過程。.一、初級代謝與次級代謝的關(guān)系次級代謝物的大量生成與細(xì)胞的初級代謝相比發(fā)生了相當(dāng)大的變化。這種變化體現(xiàn)在要為次級代謝物的生成提供物質(zhì)和能量(ATP)以及還原性輔酶。將產(chǎn)抗株(尤其是高產(chǎn)突變株)與不產(chǎn)抗株作比較，二者中與抗生素生物合成并無直接關(guān)系的酶的水平也可能存在實(shí)質(zhì)性的不同。.二、抗生素“家族”的合成一個微生物株系常常會產(chǎn)生幾種代謝物，這些代謝物在其化學(xué)結(jié)構(gòu)與生物學(xué)活性上相類似，因而共同組成一個抗生素“家族”。家族化合物的生成并不僅僅局限于抗生素類，而是次級代謝的一個普遍特征，這一特征歸因于酶對相應(yīng)底物缺乏特異性。事實(shí)上，酶通常只識別底物分子的特異區(qū)。結(jié)構(gòu)非常相似的比較大的分子，在與酶促作用位點(diǎn)無空間關(guān)系的區(qū)域內(nèi)，存在一些細(xì)小的差異。這些大分子物質(zhì)在相應(yīng)的反應(yīng)中，會被酶當(dāng)作底物而識別。

.抗生素家族的合成是由下列因素決定的1.關(guān)鍵中間物通過上述某種途徑而合成。2.這一中間物通過通常的代謝反應(yīng)修飾，如甲基化作用、羥基化作用等等。3.同一種代謝物可以是能生成兩種或兩種以上產(chǎn)物的幾種反應(yīng)的底物，這兩種或兩種以上的產(chǎn)物能被轉(zhuǎn)化，因而形成代謝樹(metabolictree)。4.由于底物明顯缺乏特異性，同樣的代謝物可通過兩種不同順序的反應(yīng)而合成。由此形成代謝網(wǎng)(metabolicnet)。.第三節(jié)

初級代謝產(chǎn)物向抗生素或抗生素組成部分的轉(zhuǎn)化

一、與氨基酸代謝有關(guān)的生物合成途徑二、與核苷酸代謝有關(guān)的生物合成途徑三、與輔酶代謝有關(guān)的生物合成途徑.一、與氨基酸代謝有關(guān)的生物合成途徑一些抗生素，或一些大分子抗生素的組成部分，來源于氨基酸合成代謝或分解代謝的中間產(chǎn)物。

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氯霉素的生物合成對氨基苯丙酮酸轉(zhuǎn)氨基氧化還原羥基化由分離阻斷變株全部中間產(chǎn)物的方法酶已被鑒定.安莎霉素和絲裂霉素C的生物合成中關(guān)鍵的中間物的合成途徑這種產(chǎn)物的一個與眾不同的特征，是有一個氨基出現(xiàn)在苯甲酸羧基的間位上(在初級代謝中只有對位或鄰位氨基苯甲酸)。312123-H2O-H2O重排關(guān)鍵的中間物.林可霉素中脯氨酰部分形成的過程酪氨酸羥基化

環(huán)化氧化,環(huán)化酰胺化

氨基酸分解代謝的例子.氨基酸的β位羥基化次級代謝的一個典型反應(yīng)是氨基酸的β位羥基化。對氨基苯丙氨酸的β位羥基化是氯霉素生物合成第一階段反應(yīng)中的一個反應(yīng)。β－羥化氨基酸作為幾種抗生素分子的組成成分而存在；而在糖肽類抗生素及諾卡菌素中的對羥基苯甘氨酸，則是由酪氨酸經(jīng)過β位羥基化所引發(fā)的一系列反應(yīng)生成的。.克拉維酸的生物合成途徑

精氨酸環(huán)化β位羥基化環(huán)化.二、與核苷酸代謝有關(guān)的生物合成途徑具有核苷類結(jié)構(gòu)的抗生素是經(jīng)過與核苷酸合成有關(guān)的途徑，或通過常見核苷的修飾作用而生成的。

.核苷酸合成的途徑1.從頭合成。2.通過一種稱為“補(bǔ)救途徑”的方式合成。這種補(bǔ)救途徑包括外源嘌呤或嘧啶堿基的核糖基化作用。有幾種抗生素是從修飾常見的核苷或核苷酸而生成的。.阿糖腺苷的合成

氧化還原烯醇化酮基阿糖腺苷是通過2’－羥基腺苷的差向異構(gòu)比作用而合成.嘌呤霉素的生物合成腺嘌呤核苷3’—氨基—3’—脫氧腺苷氨基化酪氨酸酰胺化乙?；疦-甲基化O-甲基化去乙酰化嘌呤霉素失活作用.三、與輔酶代謝有關(guān)的生物合成途徑葉酸中的蝶啶部分及核黃素的合成，是以甲酸的形式，將鳥嘌呤核苷三磷酸第八位碳去掉，以此起始經(jīng)一系列反應(yīng)完成的。核苷類抗生素，包括一些殺結(jié)核菌素，如豐加霉素與蝶啶生物合成的相似性。核糖是完成蝶啶和抗生素分子兩者合成所需要的三個碳原子的供體。.推斷中的豐加霉素的生物合成鳥嘌呤核苷三磷酸187936GTP－甲酰水解酶7—脫氮—腺嘌呤環(huán)三磷酸核糖.第四節(jié)

來源于聚酮體合成的抗生素相當(dāng)數(shù)量的抗生素是通過稱為聚酮體合成的過程生成的，該過程與初級代謝中脂肪酸的合成密切相關(guān)。.脂肪酸的合成脂肪酸的合成是脂肪酸合成酶(FAS)所催化的一個聚合反應(yīng)過程。在脊椎動物和酵母中，F(xiàn)AS是含有兩個亞基(I型FAS)的大的多功能酶；而在細(xì)菌和較高等的植物中，則是一個多酶復(fù)合體，可被分解為七個以上不同的酶(II型FAS)。.脂肪酸聚合反應(yīng)的幾個必要的步驟(1)作為乙酸起始物分子和作為丙二酸延長單位與合成酶如硫脂酶相連接：乙酸與縮合酶亞基(或區(qū)域)相連接，而丙二酸與?；d體蛋白(ACP)相連接。(2)乙酸中的羧基碳縮合成丙二酸的亞甲基碳；與此同時(shí)，丙二酸的自由羧基以CO2的形式失去，形成乙酰乙酸，在硫脂酶作用下與ACP相連接。(3)乙酰乙酸中的酮基被還原為羥基。隨后脫水產(chǎn)生一個雙鍵，該雙鍵在第二步還原反應(yīng)中被飽和生成丁酸酯部分。(4)延伸中的鏈被轉(zhuǎn)移到縮合酶，另一個丙酸單位與ACP連接，反應(yīng)重復(fù)進(jìn)行，直至達(dá)到適合的鏈長。由硫脂酶將該脂肪酸釋放出去。.脂肪酸聚合反應(yīng)的示意圖1234.微生物中脂肪酸的合成模式在微生物中，這一生物合成模式有些不同：在芽胞桿菌屬和幾種放線菌屬中，起始物分子常為小的分支的脂肪酸，并且還形成15～17個碳的分支脂肪酸。另外，還常伴隨有一步還原反應(yīng)被省掉，形成線性不飽和脂肪酸。.聚酮類抗生素合成的聚合反應(yīng)不同點(diǎn)聚酮類抗生素合成的聚合反應(yīng)過程還由兩種類型的合成酶所催化：多功能酶I型聚酮亞甲基合酶(PKSI)和多酶復(fù)合物II型聚酮亞甲基合酶(PKSII)。與FASs不同的是，這兩種類型的酶在同一個屬的一些菌株中均存在。.一、芳香族聚酮類抗生素許多由放線菌或絲狀真菌產(chǎn)生的抗生素都有一個多元芳香環(huán)結(jié)構(gòu)，或者來源于多元芳香環(huán)中間物?？刂坪铣傻幕蚓幋a具有II型PKS特征的蛋白。這些蛋白在結(jié)構(gòu)和功能上與II型FAS相似，但是缺少上述脂肪酸合成第3點(diǎn)中使酮基還原的亞基。聚合反應(yīng)的產(chǎn)物是一個聚酮亞甲基鏈(聚酮體)，即酮基與亞甲基相互更換的一個線性分子。這個鏈具有很高的反應(yīng)活性，并趨向于通過酮基與亞甲基的醛醇縮合作用而折疊成環(huán)。根據(jù)鏈的長度與參與其中酶的特性由立體空間和能量所決定，導(dǎo)致形成許多由芳香環(huán)組成的不同的結(jié)構(gòu)。.

四環(huán)素的生物合成丙二酰胺醛醇縮合氧化氧化氨基化甲基化羥基化還原,烯醇化.

灰黃霉素的生物合成氯化甲基化還原環(huán)化.二、聚酮體抗生素的生物合成有幾種類型的抗生素的生物合成涉及小分子羧酸的聚合，其機(jī)制與脂肪酸合成有關(guān)，然而在許多重要的方面都與后者相異。.與脂肪酸合成的差異1.起始物通常是丙酸，但有時(shí)也包含其他脂肪酸或芳香族酸類。2.較常見的延長分子是甲基丙二酸。若甲基丙二酸是延長單位，結(jié)果所得到的鏈狀分子中就帶有甲基取代基。若是乙基丙二酸，則得到的是乙基取代基。因?yàn)檠娱L中的鏈的縮合總是發(fā)生在羰基的鄰位碳上。3.省略了脂肪酸合成的第三點(diǎn)的還原步驟。.與芳香族聚酮類的差異鏈狀分子中可能存在酮基或羥基功能團(tuán)或雙鍵結(jié)構(gòu)。因?yàn)橥榛〈拇嬖?，鏈狀分子中不含有這一系列由相鄰?fù)せ畹膩喖谆蚨荒芙?jīng)由簡單的脫水反應(yīng)而形成芳香環(huán)。最終的結(jié)構(gòu)只能是鏈狀分子或由酰胺鍵連接的大型環(huán)狀分子(大環(huán)內(nèi)酰胺)，或是酯鍵連接的大型環(huán)狀分子(大環(huán)內(nèi)酯)。.聚酮體抗生素生物合成基因生物合成基因都包含一個或多個被稱為合酶單位(SU)的區(qū)域。每一個SU組成了一個具有類FAS活性的區(qū)域，這種活性對完成一個完整的延長過程是必需的，這包括選擇延長單位，縮合過程、并且在恰當(dāng)?shù)臅r(shí)候?qū)θ炕虿糠秩┗M(jìn)行還原。在一個循環(huán)完成后，新生成的聚酮體被轉(zhuǎn)移到鄰近的合酶單位上，在此處加上另外一個延長單位并繼續(xù)進(jìn)行。因此，SU排列的順序決定功能基因最終產(chǎn)物的順序，SU的數(shù)目決定鏈的長度。.組成紅霉素骨架的分子鏈順序的構(gòu)建6-去氧紅霉內(nèi)酯BI型聚酮亞甲基合酶甲基丙二酸丙酸縮合，還原縮合縮合縮合，還原縮合，還原縮合，還原.鏈狀分子的基本結(jié)構(gòu)及其酶促折疊情況決定了最終的抗生素屬于哪一類型14和16大環(huán)內(nèi)酯抗生素具有26至28原子的多聚烯烴安莎霉素類(大環(huán)內(nèi)酰胺)每一類型中都有大量的抗生素是因不同產(chǎn)生菌的其他生物合成基因的特異性而產(chǎn)生的。.紅霉素A過程的生物合成反應(yīng)的次序6-羥基化5-去氧糖胺3-紅霉糖甲基化12-羥基化甲基化.利福霉素B生物合成主要步驟酰胺化,羥基化羥基化甲基化,乙?；?插氧乙酸化在利福霉素B的結(jié)構(gòu)中，碳鏈被插入其中的氧原子所打斷。.第五節(jié)

來源于氨基酸聚合反應(yīng)的抗生素

.一、硫代模板機(jī)制有很大數(shù)量的微生物經(jīng)由硫代模板機(jī)制的過程合成肽類抗生素。即抗生素分子中氨基酸殘基的順序，是由前體(例如硫酯)與具有催化聚合反應(yīng)作用的一個或多個多功能的特異位點(diǎn)相連接的順序所決定的。.硫代模板機(jī)制基本的過程(1)氨基酸活化為腺嘌呤核苷酸；(2)氨基酸縮合至酶上的含硫基團(tuán)；(3)逐步聚合。.聚合作用示意圖形成肽鍵的能量由硫酯鍵的斷裂來提供。.催化酶的復(fù)合物催化整個過程的酶復(fù)合物由四種以上多功能酶所組成。由編碼基因的順序所決定的氨基酸順序，揭示了在每一個酶中存在單元(module)，其數(shù)目與該酶催化氨基酸的數(shù)目相當(dāng)。在每一個單元中，存在完成一個延長循環(huán)不同過程中的功能區(qū)（氨基酸的活化，含硫基團(tuán)的酯化和肽鍵的形成）。在這些單元中，存在催化由L型氨基酸向D型氨基酸的異構(gòu)化，或酰胺鍵氮原子的甲基化等功能。.短桿肽S的生物合成－NH2COOHCOSEnz異構(gòu)化活化－NH2－NH2硫酯酶.異青霉素N的生物合成異青霉素N是青霉素、頭孢菌素和頭霉素生物合成的共同前體。D異青霉素N合成酶δ－氨基己二酸－半胱氨酸－D－纈氨酸.β－內(nèi)酰胺類抗生素生物合成異青霉素N.第七節(jié)

寡糖類抗生素很重要的一類寡糖類抗生素是氨基糖苷類抗生素，由幾個糖單位和一個氨基環(huán)醇組成。氨基糖苷完全是對通過對普