實驗一 醋酸纖維薄膜電泳分離血清蛋白

實驗一醋酸纖維薄膜電泳分離血清蛋白第一頁，共十六頁，編輯于2023年，星期二原理電泳:帶電顆粒在電場中泳動的現(xiàn)象

各種蛋白質在同一pH條件下，因分子量和電荷數(shù)量等不同而在電場中的遷移率不同而得以分開。不用支持物的利用支持物1）紙電泳2)淀粉凝膠電泳3)瓊脂糖凝膠電泳4）醋酸纖維薄膜電泳5）聚丙烯酰胺凝膠電泳（PAGE）第二頁，共十六頁，編輯于2023年，星期二影響泳動速度的主要因素1）電場強度：（越大，移動速度越快）常壓電泳：100-500V，2-10V/cm高壓電泳：500-10000V，20-200V/cm2）溶液的pH值：buffer。8.603）溶液的離子強度：（I越大，速度越慢；緩沖效果越好），0.02-0.2之間。0.073）電滲現(xiàn)象：液體在電場中相對于固體支持物的相對移動。盡量避免有高電滲作用的支持物。第三頁，共十六頁，編輯于2023年，星期二聚丙烯酰胺凝膠電泳（PAGE）Davis和Ornstein1959年人血清蛋白聚丙烯酰胺凝膠：由丙烯酰胺（Acr，單體）和N,N′-甲叉雙丙烯酰胺（Bis，交聯(lián)劑）共聚合而成（由過硫酸銨-四乙基乙二胺TEMED系統(tǒng)或核黃素-TEMED系統(tǒng)激發(fā)）。分子篩，可通過調節(jié)單體濃度或與交聯(lián)劑的比例來控制孔徑大小，達到不同的分離目的。凝膠可以是平板（垂直板型）或柱子（盤狀）第四頁，共十六頁，編輯于2023年，星期二第五頁，共十六頁，編輯于2023年，星期二第六頁，共十六頁，編輯于2023年，星期二SDS：十二烷基硫酸鈉CH3（CH2）11OSO3Na，陰離子去污劑，與蛋白質結合，能破裂蛋白質分子中的氫鍵和疏水作用，破壞蛋白質的二級、三級、四級結構。

1）先加還原劑如巰基乙醇打開-S-S-；2）SDS破壞蛋白質構象，與氨基酸側鏈充分結合，形成蛋白質亞基-SDS膠束。SDS是陰離子，使多肽鏈帶上負電荷，該電荷量遠遠超過蛋白質分子原有電荷量，掩蓋了不同蛋白質之間的電荷差別。電泳遷移率主要取決于蛋白質或亞基分子量的大小。SDS：十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳第七頁，共十六頁，編輯于2023年，星期二作用使蛋白質成為亞基物質，形成蛋白質-SDS膠束，消除蛋白質分子之間的電荷、形狀差異；橢圓棒狀，短軸均為1.8nm，長軸正比于蛋白質分子量。MW在15200kDa，電泳遷移率與分子量對數(shù)呈線性關系。logM=a-bRf，Rf為遷移率第八頁，共十六頁，編輯于2023年，星期二第九頁，共十六頁，編輯于2023年，星期二醋酸纖維薄膜電泳(CAME)以醋酸纖維薄膜(CAM)作支持物的一種區(qū)帶電泳技術，將血清樣品點樣于醋纖膜上，在pH8.6的緩沖液中電泳，血清蛋白質均帶負電荷移向正極。由于血清中各蛋白組分等電點不同而使表面凈電荷量不等，加之分子大小和形狀各異，因而電泳遷移率不同，彼此得以分離。電泳后，CAM經(jīng)染色和漂洗，可清晰呈現(xiàn)清蛋白、α1、α2、β、γ—球蛋白5條區(qū)帶。第十頁，共十六頁，編輯于2023年，星期二人血清中常見蛋白質的等電點和分子量蛋白質等電點分子量正常參考值（%）清蛋白4.886900057-68α1-球蛋白5.062000001.0-5.7α2-球蛋白5.063000004.9-11.2β-球蛋白5.1290000-1500007-13γ-球蛋白6.85-7.2156000-3000009.8-18.2負極正極γ—球蛋白/β-球蛋白/α2-球蛋白/α1-球蛋白/清蛋白第十一頁，共十六頁，編輯于2023年，星期二器材1．醋酸纖維薄膜(8X2mm)

2．點樣器

3．染色皿，漂洗器，鑷子

4．電泳儀：電泳儀電源，水平電泳槽

第十二頁，共十六頁，編輯于2023年，星期二試劑1．巴比妥緩沖液(pH8.6)：取巴比妥鈉12.76g，巴比妥1.66g，加蒸餾水加熱溶解后稀釋至1升。2．氨基黑10B染色液：取氨基黑10B0.5g，甲醇50ml，冰醋酸l0ml，加水至100ml。3．漂洗液：95％乙醇45ml、冰醋酸5ml、蒸餾水50ml

第十三頁，共十六頁，編輯于2023年，星期二操作-準備l．醋酸纖維薄膜(CAM)的準備：薄膜放進緩沖液中，自然浸潤，約20分鐘。2．電泳槽的準備：水平放置，將緩沖液注入電泳槽中，兩邊的緩沖液高度要一致，架上濾紙橋，蓋上電泳槽蓋3．點樣：將充分浸透(指膜上無白色斑痕)的薄膜取出，用濾紙吸去膜上過多緩沖液，粗糙面(無光澤面)用于點樣，載玻片蘸取血清，垂直印在CAM粗糙面上。第十四頁，共十六頁，編輯于2023年，星期二操作-電泳4．加樣后，將薄膜條架于支架兩端，點樣面朝下，點樣側置于負極端。薄膜應平直無彎曲，加上槽蓋平衡5分鐘后通電。5．連接電泳槽與電泳儀對應的正負極，開啟電源通電。電壓160V。電泳50分鐘，斷電。6．染色：用鑷子取出薄膜條投入染液8分鐘，染色過程中不時輕輕晃動染色皿，使染色充分。7.漂洗:從染液中取出薄膜條并盡量瀝去染液，投入漂洗皿中反復漂洗，直至背景漂凈為止。此時清晰可見5條色帶，待干。第十五