實驗五 細菌的革蘭氏染色

實驗五細菌的革蘭氏染色第一頁，共十四頁，編輯于2023年，星期二一、實驗目的了解革蘭氏染色法的原理，學習并掌握革蘭氏染色方法。第二頁，共十四頁，編輯于2023年，星期二二、實驗原理：細菌的涂片和染色是微生物學實驗中的一項基本技術。細菌的細胞小而透明，在普通的光學顯微鏡下不易識別，必須對它們進行染色。利用單一染料對細菌進行染色，使經染色后的菌體與背景形成明顯的色差，從而能更清楚地觀察到其形態(tài)和結構。常用堿性染料進行簡單染色，這是因為細菌的等電點較低，約在pH2～5之間，故在中性、堿性或弱堿性溶液中，菌體蛋白質電離后帶負電荷，易與帶正電荷的堿性染料如結晶紫、堿性復紅、沙黃（番紅）等結合，使細菌被染成紫色或紅色。第三頁，共十四頁，編輯于2023年，星期二

革蘭氏染色法是1884年由丹麥病理學家C.Gram所創(chuàng)立的。革蘭氏染色法可將所有的細菌區(qū)分為革蘭氏陽性菌（G+）和革蘭氏陰性菌（G—）兩大類，是細菌學上最常用的鑒別染色法。該染色法所以能將細菌分為G+菌和G—菌，是由這兩類菌的細胞壁結構和成分的不同所決定的。

第四頁，共十四頁，編輯于2023年，星期二G-菌的細胞壁中含有較多易被乙醇溶解的類脂質，而且肽聚糖層較薄、交聯度低，故用乙醇脫色時溶解了類脂質，增加了細胞壁的通透性，使初染的結晶紫-碘的復合物易于滲出，結果細菌就被脫色，再經番紅復染后就成紅色。G+菌細胞壁中肽聚糖層厚且交聯度高，類脂質含量少，經脫色劑處理后反而使肽聚糖層的孔徑縮小，通透性降低，保留結晶紫-碘復合物在細胞膜上，因此細菌仍保留初染時的顏色紫色。第五頁，共十四頁，編輯于2023年，星期二三、實驗儀器及材料1.儀器：顯微鏡、酒精燈等2.實驗材料：菌種：金黃色葡萄球菌、大腸桿菌染色劑：草酸銨結晶紫染液、碘液、番紅、95%乙醇

第六頁，共十四頁，編輯于2023年，星期二四、實驗內容與步驟革蘭氏染色流程圖涂片干燥結晶紫染色碘液媒染水洗95%酒精脫色水洗番紅染色水洗晾干鏡檢固定水洗

第七頁，共十四頁，編輯于2023年，星期二1．涂片

取干凈的載玻片于實驗臺上，在載玻片的中央滴一滴無菌蒸餾水，將接種環(huán)在火焰上燒紅，待冷卻后從斜面挑取少量菌種與玻片上的水滴混勻后，在載玻片上涂布成一均勻的薄層，涂布面不宜過大。2．干燥

涂片最好在室溫下使其自然干燥，有時為了使之干得更快些，可將標本面向上，手持載玻片一端的兩側，小心地在酒精燈上高處微微加熱，使水分蒸發(fā)，但切勿緊靠火焰或加熱時間過長，以防標本烤枯而變形。第八頁，共十四頁，編輯于2023年，星期二3．固定

固定常常利用高溫，手持載玻片的一端，標本向上，在酒精燈火焰外層盡快的來回通過2~3次，共約2~3秒鐘，并不時以載玻片背面加熱觸及皮膚，不覺過燙為宜（不超過60℃）,放置待冷后，進行染色。4．初染用草酸銨結晶紫染色1-2min后傾去染液，水洗至流出水無色。5、媒染先用碘液沖去殘留水跡，再加碘液覆蓋媒染1min后水洗。6．脫色

斜置載玻片，滴加95％乙醇脫色，至流出的乙醇不現紫色為止，大約需時20~30s，隨即水洗。第九頁，共十四頁，編輯于2023年，星期二7．復染將玻片上殘留水用吸水紙吸去，用番紅染液復染1min，水洗，吸去殘水晾干。8、鏡檢

待標本片置顯微鏡下，用低倍鏡觀察，發(fā)現目的物后用油鏡觀察，注意細菌細胞的顏色。繪出細菌的形態(tài)圖并說明革蘭氏染色的結果。9.混合涂片染色第十頁，共十四頁，編輯于2023年，星期二注意事項：

1.革蘭氏染色成敗的關鍵是酒精脫色。如脫色過度，革蘭氏陽性菌也可被脫色而染成陰性菌；如脫色時間過短，革蘭氏陰性菌也會被染成革蘭氏陽性菌。

2.菌齡也有影響。若菌齡太老，由于菌體死亡或自溶常使革蘭氏陽性菌轉呈陰性反應。

3.不要涂片太厚，會造成假陰性或假陽性。

第十一頁，共十四頁，編輯于2023年，星期二五、實驗結果：紫色菌：革蘭氏陽性菌紅色菌：革蘭氏陰性菌第十二頁，共十四頁，編輯于2023年，星期二第十三頁，共十四頁，編輯于2