實驗二 飲料中大腸菌群的測定

實驗二飲料中大腸菌群的測定第一頁，共三十八頁，編輯于2023年，星期二大腸桿菌的定義大腸桿菌（也稱大腸埃希氏菌），分類于腸桿菌科，歸屬于埃希氏菌屬。大腸桿菌指革蘭氏陰性無芽孢桿菌、乳糖發(fā)酵產酸產氣、IMViC試驗（靛基質、MR、V-P、檸檬酸鹽試驗）為++--或-+--的細菌。與人類有關的大腸桿菌統(tǒng)稱為致瀉性大腸桿菌，包括五種：腸毒素性大腸桿菌（ETEC）、致病性大腸桿菌（EPEC）、出血性大腸桿菌（EHEC）、侵襲性大腸桿菌（EIEC）、黏附性大腸桿菌（EAEC）。第二頁，共三十八頁，編輯于2023年，星期二大腸菌群和大腸桿菌的關系耐熱大腸菌群的定義：能在液體乳糖培養(yǎng)基中35/37℃培養(yǎng)48h產酸產氣，并在44.5℃培養(yǎng)24h產酸產氣的細菌（依據ISO標準）第三頁，共三十八頁，編輯于2023年，星期二衛(wèi)生學意義大腸菌群和大腸桿菌是評價衛(wèi)生質量的重要指標，作為食品中的糞便污染指標。食品中檢出大腸菌群，表明該食品有糞便污染，既可能有腸道致病菌存在，因而也就有可能通過污染的食品引起腸道傳染病的流行。大腸菌群數(shù)的高低，表明了糞便污染的程度，也反映了對人體健康危害性的大小。大腸桿菌在外界存活時間與一些主要腸道致病菌接近，它的出現(xiàn)預示著某些腸道病原菌的存在，因此該菌是國際上公認的衛(wèi)生監(jiān)測指示菌。近年來，有些國家在執(zhí)行HACCP管理中，將大腸桿菌檢測作為微生物污染狀況的監(jiān)測指標和HACCP實施效果的評估指標。第四頁，共三十八頁，編輯于2023年，星期二大腸桿菌的生物學特性基本形態(tài)：

此菌為兩端鈍圓的短小桿菌，一般約0.5-0.8μm*1.0-3.0μm，多單獨存在或成雙，但不呈長鏈排列。約50%的菌株有周生鞭毛，但多數(shù)只有1-4根，一般不超過10根，故菌體動力弱。多數(shù)菌株有菌毛，有的有莢膜或微莢膜，不形成芽孢，對普通堿性染料著色良好，革蘭氏染色陰性。第五頁，共三十八頁，編輯于2023年，星期二大腸桿菌的生物學特性培養(yǎng)特性：大腸桿菌合成代謝能力強，在含無機鹽、銨鹽、葡萄糖的普通培養(yǎng)基上生長良好。最適生長溫度為37℃，在42-44℃條件下仍能生長，生長溫度范圍15-46℃。在普通營養(yǎng)瓊脂上有3種菌落形態(tài)：1）光滑型：菌落邊緣整齊，表面有光澤、濕潤、光滑、呈灰色，在生理鹽水中易分散；2）粗糙型：菌落扁平、干澀、邊緣不整齊，易在生理鹽水中自凝；3）黏液型：常為含有莢膜的菌株。第六頁，共三十八頁，編輯于2023年，星期二大腸菌群及大腸桿菌測定

——MPN法檢驗流程（FDABAM）檢樣50g+450ml稀釋液適當十倍稀釋樣品選擇3個適宜的連續(xù)稀釋度的樣品稀釋液，每個稀釋度接種三管LST肉湯（每管9mlLST肉湯并加有導管），每管接種1mL35℃，24±2h~48±2h沒有產氣管有產氣管報告陰性接種BGLB肉湯管接種EC肉湯

35±℃，48±2h44.5±0.5℃（水浴培養(yǎng)）24±2h~48±2h查MPN表報告結果產氣管接種EMB平板（35℃、18~24h）

（大腸菌群）從EMB平板上挑取5個可疑菌轉接到PCA斜面，進行革蘭氏染色、IMVC生化鑒定、接種LST復檢產氣查MPN表報告結果（大腸桿菌）

第七頁，共三十八頁，編輯于2023年，星期二大腸菌群測定——MPN法檢驗幾點說明MPN檢索表：MPN為最大可能數(shù)(MostProbableNumber)的簡稱。這種方法，對樣品進行連續(xù)系列稀釋，加入培養(yǎng)基進行培養(yǎng)，從規(guī)定的反應呈陽性管數(shù)的出現(xiàn)率，用概率論來推算樣品中菌數(shù)最近似的數(shù)值。MPN檢索表只給了三個稀釋度，如改用不同的稀釋度，則表內數(shù)字應相應降低或增加10倍。初發(fā)酵和證實試驗：1）兩步法進行了兩次乳糖發(fā)酵試驗。初發(fā)酵和證實實驗所用培養(yǎng)基不同，但都是為了證實培養(yǎng)物是否符合大腸菌群的定義，即“在37℃分解乳糖產酸產氣”。LST中提供了磷酸鹽緩沖體系，氯化鈉可維持滲透壓，月桂基硫酸鈉可抑制非大腸菌群的生長，這個緩沖蛋白胨乳糖肉湯允許“緩慢乳糖發(fā)酵（Slowlactosefermentations）”來促進菌體產氣。BGLB中膽鹽和煌綠可以抑制革蘭氏陽性細菌和除了大腸菌群的很多革蘭氏陰性細菌。2）初發(fā)酵陽性管，不能肯定就是大腸菌群細菌，經過證實試驗后，有時可能成為陰性。有數(shù)據表明，食品中大腸菌群檢驗步驟的符合率，初發(fā)酵與證實試驗相差較大。因此，在實際檢測工作中，證實試驗是必需的。產氣量與倒管：在乳糖發(fā)酵試驗工作中，經常可以看到在發(fā)酵倒管內極微少的氣泡（有時比小米粒還?。?，有時可以遇到在初發(fā)酵時產酸或沿管壁有緩緩上浮的小氣泡。實驗表明，大腸菌群的產氣量，多者可以使發(fā)酵倒管全部充滿氣體，少者可以產生比小米粒還小的氣泡。如果對產酸但未產氣的乳糖發(fā)酵如有疑問時，可以用手輕輕打動試管，如有氣泡沿管壁上浮，即應考慮可能有氣體產生，而應作進一步試驗。

第八頁，共三十八頁，編輯于2023年，星期二大腸桿菌測定——EMB選擇性分離鑒別EMB平板典型大腸桿菌菌落特征：中心黑色或紫紅色，有或無綠色金屬光澤第九頁，共三十八頁，編輯于2023年，星期二大腸桿菌測定——EMB選擇性分離鑒別EMB是一種弱選擇性培養(yǎng)基，一些球菌也可在該培養(yǎng)基上生長；高壓滅菌可使得美藍還原從而使培養(yǎng)基的顏色呈不均一橘黃色，輕輕搖動培養(yǎng)基可以恢復原有的正常紫色，傾注平板前應先搖勻；大腸桿菌在該培養(yǎng)基上并不一定總是呈現(xiàn)綠色的金屬光澤；該培養(yǎng)基受可見光易使其中的成分氧化，儲存及培養(yǎng)細菌時都應在避光條件。菌名菌落形態(tài)大腸埃希氏菌紫黑色，有綠色金屬光澤肺炎克雷伯氏菌粉色，中心色深陰溝腸桿菌粉色，中心色深弗氏志賀氏菌無色鼠傷寒沙門氏菌無色糞鏈球菌無色第十頁，共三十八頁，編輯于2023年，星期二大腸桿菌測定——革蘭氏染色基本原理：革蘭氏染色法是細菌學中廣泛使用的一種重要的鑒別染色法。1884年由丹麥醫(yī)師Gram創(chuàng)立。此法可將細菌分為革蘭氏陰性菌和革蘭氏陽性菌兩大類。革蘭氏染色的機理主要是利用兩類細菌的細胞壁成分和結構的不同。革蘭氏陰性菌的細胞壁中含有較多的類脂質，而肽聚糖的含量較少。當用酒精或丙酮酸脫色時，類脂質被溶解，增加了細胞壁的通透性，使初染后的結晶紫和碘的復合物易于滲出，結果細胞被脫色，經復染后，又染上復染液的顏色。而革蘭氏陽性菌細胞壁中肽聚糖的含量多而且交聯(lián)度大，類脂質含量少，經乙醇或丙酮洗脫后，肽聚糖層的孔徑變小，通透性降低，因此細胞仍保留初染時的顏色。第十一頁，共三十八頁，編輯于2023年，星期二大腸桿菌測定——革蘭氏染色基本步驟：將涂片在火焰上固定，滴加結晶紫染液，染1min，水洗；滴加革蘭氏碘液，作用1min，水洗；滴加95%乙醇脫色約15～30s,直至染色液被洗掉，不要過分脫色，水洗；滴加番紅復染液，復染1min，水洗、待干、鏡檢。結果：革蘭氏陽性菌呈紫色，革蘭氏陰性菌呈紅色。第十二頁，共三十八頁，編輯于2023年，星期二大腸桿菌測定——生化鑒定Testpositivenegativebiotype1biotype2reagentIndole紅色環(huán)不變色+-Kovacs’MR紅色不變色++甲基紅V-P玫瑰紅色環(huán)不變色--V-P甲、乙液Citrate生長不生長---第十三頁，共三十八頁，編輯于2023年，星期二實驗二飲料中大腸菌群的測定一、實驗目的1、學習飲料中大腸菌群檢測程序、方法；2、掌握飲料中大腸菌群檢測結果的報告方式。二、實驗材料1、設備和材料溫箱、水浴鍋、天平、顯微鏡、均質器或乳缽、溫度計、平皿、試管、發(fā)酵管、吸管、載玻片、接種針2、培養(yǎng)基及試劑乳糖—膽鹽發(fā)酵管、乳糖發(fā)酵管、蛋白胨水、靛基質試劑、麥康凱、伊紅美藍瓊脂（EMB）、革蘭氏染色液第十四頁，共三十八頁，編輯于2023年，星期二GB4789.3-2010大腸菌群計數(shù)第十五頁，共三十八頁，編輯于2023年，星期二GB4789.3-2010大腸菌群計數(shù)第十六頁，共三十八頁，編輯于2023年，星期二第十七頁，共三十八頁，編輯于2023年，星期二（一）最先準備的器材規(guī)格名稱 數(shù)量 用途1、500ml三角瓶 1個 稀釋樣品2、250ml三角瓶 1個 制EMB瓊脂3、18×180mm試管9支單料乳糖膽鹽發(fā)酵管4、18×180mm試管 3支 稀釋樣品（9ml）5、1ml移液管 5支6、10ml移液管 3支7、直徑為90mm平皿 2套 制EMB平板8、250ml量筒 1支9、玻璃珠：直徑約5mm（二）應滅菌消毒的器材剪刀1把不銹鋼藥匙1把滴管膠頭5只稱量紙適量第十八頁，共三十八頁，編輯于2023年，星期二（三）應制備的培養(yǎng)基培養(yǎng)基總量所用容器蒸餾水225ml500ml三角瓶蒸餾水9ml/3支27ml18×180mm試管（稀釋樣品）乳糖膽鹽發(fā)酵管（單料）：10ml/9支100ml 18×180mm試管(裝杜氏小管)EMB瓊脂：1瓶150ml250ml三角瓶（每組配一瓶） 第十九頁，共三十八頁，編輯于2023年，星期二蛋白胨20g、膽鹽5g、乳糖10g、0.4%溴甲酚紫乙醇溶液25ml、蒸餾水1000ml（將蛋白胨、膽鹽及乳糖溶于水中，校正PH值至7.4，加入指示劑）；或購買制好的乳糖膽鹽發(fā)酵培養(yǎng)基、按說明配置。分裝試管，每管10ml，并放入一個到氣管（杜氏小管），高壓滅菌115℃、15分鐘。雙料乳糖膽鹽發(fā)酵培養(yǎng)基除蒸餾水外，其它成分加倍。乳糖膽鹽發(fā)酵培養(yǎng)基：P99第二十頁，共三十八頁，編輯于2023年，星期二

蛋白胨10.0g

乳糖10.0g

磷酸氫二鉀2.0g

瓊脂15.0g

伊紅γ0.4g

美藍0.065g

或20ml伊紅γ(20g/L)和10ml美藍(6.5g/L)

蒸餾水1000.0mL

最終pH7.1±0.2(25℃)

先將蒸餾水中加入磷酸氫二鉀及蛋白胨、乳糖使之溶解，后加瓊脂加熱溶解，再調pH=7.2-7.4,再加入伊紅,美藍水溶液,

高壓滅菌115℃、15分鐘。

蛋白胨提供細菌生長發(fā)育所需的氮源、維生素和氨基酸，乳糖提供發(fā)酵所需的碳源，磷酸氫二鉀維持緩沖體系，伊紅Y和美藍抑制絕大部分革蘭氏陽性菌的生長。瓊脂是凝固劑。大腸桿菌在EMB上發(fā)酵乳糖，形成黑色菌落，大部分有金屬光澤。沙門氏菌形成無色菌落。金黃色葡萄球菌基本上不生長。

EMB（伊紅美藍瓊脂）第二十一頁，共三十八頁，編輯于2023年，星期二質控：此培養(yǎng)基呈紫色，可有細微沉淀。質控菌株接種后，35℃培養(yǎng)18～24小時，觀察結果應如下表所示：菌株菌號生長情況菌落產氣腸桿菌ATCC13048好粉紅，無光澤大腸埃希氏菌ATCC25922好，極好有紫綠金屬光澤中心肺炎克雷伯氏菌ATCC13883好綠金屬光澤，有黑心奇異變形桿菌ATCC25933好，極好無色鼠傷寒沙門氏菌ATCC14028好，極好無色金黃色葡萄球菌ATCC25923被抑制－第二十二頁，共三十八頁，編輯于2023年，星期二說明：（1）伊紅又稱署紅或四溴熒光素，為酸性染料。美藍又稱亞甲藍，為堿性染料。當大腸桿菌分解乳糖產酸時，細菌帶正電荷，染上紅色，再與美藍結合而形成紫黑色菌落，并有綠色金屬光澤。二者除了作為指示劑外，還有抑制格蘭氏陽性菌的作用。（2）在堿性環(huán)境中，不分解乳糖產酸的細菌不著色。伊紅、美藍不能結合，故沙門氏菌和志賀氏菌等為無色或琥珀色半透明菌落。（3）此培養(yǎng)基用于鑒別大腸桿菌及產氣桿菌，并可快速鑒定白色念珠菌及鑒定凝固酶陽性葡萄球菌。美國公共衛(wèi)生協(xié)會和美國細菌協(xié)會推薦，用于增殖或鑒別大腸桿菌的檢查。但某些沙門氏菌、志賀氏菌可被抑制。培養(yǎng)基保存應注意避光防止氧化。

第二十三頁，共三十八頁，編輯于2023年，星期二樣品1.酸奶12.鮮奶3.水樣14.水樣25.水樣36.水樣47.水樣58.酸奶2第二十四頁，共三十八頁，編輯于2023年，星期二A1組酸奶1

A2組

水樣1

A3組水樣2

A4組水樣3

第二十五頁，共三十八頁，編輯于2023年，星期二B1組鮮奶

B2組水樣4

B3組水樣5

B4組酸奶2

第二十六頁，共三十八頁，編輯于2023年，星期二三、實驗方法與步驟1、采樣及稀釋①以無菌操作將檢樣25g（或25ml）放于含有225ml滅菌生理鹽水或其他稀釋液的滅菌玻璃瓶內（瓶內預置適當數(shù)量的玻璃珠）或滅菌乳缽內，經充分振搖或研磨做成1：10的均勻稀釋液。固體檢樣最好用無菌均質器，以800r/min～1000r/min的速度處理1min，做成1：10的稀釋液。②用1ml滅菌吸管吸取1：10稀釋液1ml，注入含有9ml滅菌生理鹽水或其他稀釋液的試管內，振搖混勻，做成1：100的稀釋液，換用1支1ml滅菌吸管，按上述操作依次作10倍遞增稀釋液第二十七頁，共三十八頁，編輯于2023年，星期二2.乳糖初發(fā)酵試驗即通常所說的假定試驗。其目的在于檢查樣品中有無發(fā)酵乳糖產生氣體的細菌。將待檢樣品接種于乳糖膽鹽發(fā)酵管內，接種量在1ml以上者，用雙料乳糖膽鹽發(fā)酵管；1ml及1ml以下者，用單料乳糖發(fā)酵管。每一個稀釋度接種3管，置（36±1）0C溫箱內，培養(yǎng)（24±2）h，如所有乳糖膽鹽發(fā)酵管都不產氣，則可報告為大腸菌群陰性，如有產生者，則按下列程續(xù)進行③根據食品衛(wèi)生要求或對檢驗樣品污染情況估計，選擇三個稀釋度，每個稀釋度接種3管。也可直接用樣品接種。10，100,1000倍稀釋（-1，-2，-3）第二十八頁，共三十八頁，編輯于2023年，星期二3.分離培養(yǎng)（10倍稀釋）將產氣的發(fā)酵管分別轉種在伊紅美藍瓊脂板或麥康凱瓊脂平板上，置（36±1）0C溫箱內，培養(yǎng)18h~24h，然后取出，觀察菌落形態(tài)并作革蘭氏染色鏡檢和復發(fā)酵試驗。4.乳糖復發(fā)酵試驗