電壓鉗制和膜片鉗制技術(shù)演示文稿

電壓鉗制和膜片鉗制技術(shù)演示文稿當(dāng)前第1頁\共有72頁\編于星期六\8點(diǎn)優(yōu)選電壓鉗制和膜片鉗制技術(shù)當(dāng)前第2頁\共有72頁\編于星期六\8點(diǎn)一、細(xì)胞膜的生物物理特性(Biophysicalpropertiesofcellmembrane)

細(xì)胞膜上以脂質(zhì)雙分子層為支架，鑲嵌著不同特性的蛋白質(zhì)。細(xì)胞膜的電緊張及其擴(kuò)布規(guī)律，膜的極化狀態(tài)及其形成過程中等都是細(xì)胞膜電纜性質(zhì)(cableproperties)的反映。(軸漿電阻與膜電阻、膜電容的組合，使電流對膜電位的影響起著依距離而衰減以及在時(shí)間上的延緩作用――神經(jīng)的“電纜”性質(zhì))。細(xì)胞膜的電纜特性從它的等效電路及其時(shí)間常數(shù)和空間常數(shù)得到證實(shí)。當(dāng)前第3頁\共有72頁\編于星期六\8點(diǎn)當(dāng)前第4頁\共有72頁\編于星期六\8點(diǎn)(一)細(xì)胞膜的等效電路

從電學(xué)特點(diǎn)上分析，細(xì)胞膜可等效地模擬為電阻－電容器。它具備細(xì)胞漿電阻（縱向電阻，Ro），膜電阻（橫向電阻，Rm），膜電容（Cm）和膜電位（Em）四方面的電學(xué)特性，根據(jù)這四方面特性即可構(gòu)成其等效電路（EquivalentCircuit）。當(dāng)前第5頁\共有72頁\編于星期六\8點(diǎn)outsideinside膜電位等效電路的簡化圖Cm膜電容Rm膜電阻Em離子平衡電位Ro細(xì)胞外液的縱向電阻（Ω/cm）Ri軸漿的縱向電阻（Ω/cm）RoCmRmEm+-當(dāng)前第6頁\共有72頁\編于星期六\8點(diǎn)離子通道等效電路當(dāng)前第7頁\共有72頁\編于星期六\8點(diǎn)

細(xì)胞膜的等效電路是一個(gè)并聯(lián)的阻容電路，膜活動(dòng)時(shí)既有電壓的改變，同時(shí)又有電流的改變。電位的改變可引起電容器的充、放電，也可用于電阻器上的電流流動(dòng)。通過電容器的電流為Ic，通過電阻的電流為Ir。當(dāng)前第8頁\共有72頁\編于星期六\8點(diǎn)1縱向電阻（Ro、Ri）

由胞漿的性質(zhì)所決定，具有較高的電阻率，它與直徑呈反比關(guān)系（直徑大、電阻小，直徑小，電阻大）。由于它的存在，使生物電的傳導(dǎo)主要沿細(xì)胞膜所包圍的容積導(dǎo)體進(jìn)行。它是單位長度的電阻，單位是Ω/cm，細(xì)胞外間質(zhì)的容積很大，其單位長度電阻（Ro）較Ri小。當(dāng)前第9頁\共有72頁\編于星期六\8點(diǎn)2.橫向電阻（redialresistance）

即細(xì)胞膜本身具有的膜電阻。細(xì)胞膜由雙層脂質(zhì)構(gòu)成，厚度很薄，但具有很高的電阻，即絕緣性。膜電阻表示離子通過膜的有限能力。膜電阻反映了離子是否容易通透膜的情況。膜電阻（Rm）的大小反映了膜結(jié)構(gòu)電學(xué)方面的差異。當(dāng)前第10頁\共有72頁\編于星期六\8點(diǎn)2.橫向電阻（redialresistance）

膜電位、膜電流和膜電阻的關(guān)系遵循歐姆定律：

Em=Im.RmI=V/R膜電阻越大，對電流的導(dǎo)通能力越小。膜電阻反映了離子是否容易通透膜的情況。膜電阻（Rm）的倒數(shù)膜電導(dǎo)（G，g）。I=gV（膜電位恒定的情況下，膜電導(dǎo)越大，膜電流也越大。

不同的離子有不同的電導(dǎo)。電導(dǎo)的單位是Siemens(S).當(dāng)前第11頁\共有72頁\編于星期六\8點(diǎn)3.膜電容（capacity）

表示膜的絕緣及儲存電荷的性質(zhì)。任何一種裝置使兩個(gè)導(dǎo)體中間插入一個(gè)絕緣體并安排在一起，稱為電容器。細(xì)胞外液及細(xì)胞內(nèi)液均為含電解質(zhì)的溶液，可看作為兩個(gè)導(dǎo)體；細(xì)胞膜是含脂質(zhì)的膜，可視作為絕緣體。細(xì)胞外液-細(xì)胞膜-細(xì)胞內(nèi)液三者組成了電容。當(dāng)前第12頁\共有72頁\編于星期六\8點(diǎn)3.膜電容（capacity）

電容大小與細(xì)胞體積和細(xì)胞膜表面積有關(guān)。膜電容和膜面積呈正比，與膜的厚度呈反比。電容的單位是法拉第（F）。膜電容的測量可用于細(xì)胞膜表面積的測定，對推算某種離子通道在單位膜面積上的密度有一定幫助。當(dāng)前第13頁\共有72頁\編于星期六\8點(diǎn)4膜電位（membranepotential）

當(dāng)膜上離子通道開放而引起帶電離子跨膜流動(dòng)時(shí)，就相當(dāng)于在電容器上充電或放電而產(chǎn)生電位差，即跨膜電位。膜電位的高低決定于跨膜電化學(xué)梯度；膜電位的高低與膜兩側(cè)的電荷成正比。

在膜兩側(cè)離子濃度不變的情況下，膜電位則取決于膜電導(dǎo)的改變（離子通透性的改變）。反過來，膜電導(dǎo)的大小又受到膜電位的控制（離子通透性的電壓依賴性）。當(dāng)前第14頁\共有72頁\編于星期六\8點(diǎn)5膜電流（membranecurrent）

任何電流都是電容電流（Ic）和電阻電流（Ir）兩種形式通過細(xì)胞膜，前者導(dǎo)致膜電荷的改變，后者實(shí)際上是由離子攜帶流經(jīng)細(xì)胞膜的。

Im=Ic+Ir當(dāng)前第15頁\共有72頁\編于星期六\8點(diǎn)5膜電流（membranecurrent）

電位的變化引起膜電容的充電或放電，而電流的變化則表現(xiàn)在膜電阻上的電流流動(dòng)。Ic只在膜電位發(fā)生變化的一瞬間出現(xiàn)，若將膜電位固定在一定水平，記錄到的僅為Ii（Ir），這是電壓鉗制技術(shù)的電學(xué)基礎(chǔ)之一。當(dāng)前第16頁\共有72頁\編于星期六\8點(diǎn)(二)細(xì)胞膜的時(shí)間常數(shù)（timeconstant）

時(shí)間常數(shù)是指膜電壓隨時(shí)間而改變的過程，用一常數(shù)表示之。它反映膜電位在細(xì)胞膜上隨時(shí)間而改變的（緩慢）程度。也就是膜電位通過膜電阻和膜電容充電到63%或放電到37%所需的時(shí)間。

τ=Rm×Cmτ=膜的時(shí)間常數(shù)(ms）;Rm=膜電阻（kΩ）

Cm=膜電容（μF）Τ的大小與膜的電學(xué)性質(zhì)有關(guān)，與膜的形狀無關(guān)。當(dāng)前第17頁\共有72頁\編于星期六\8點(diǎn)(三)細(xì)胞膜的空間常數(shù)（spaceconstant）空間常數(shù)，是度量電壓的空間衰減，即標(biāo)志電壓依距離而衰減的程度的一個(gè)常數(shù)。即:膜電位通過膜電阻和縱向電阻所組成的分流電路隨距離的增大而按指數(shù)曲線規(guī)律衰減的速度.或表示膜電位按指數(shù)曲線規(guī)律衰減到37%所需要的距離。細(xì)胞直徑越大，空間常數(shù)越大。當(dāng)前第18頁\共有72頁\編于星期六\8點(diǎn)

(一)、定義

利用負(fù)反饋原理將膜電位在空間和時(shí)間上固定于某一恒定的測定值，以研究動(dòng)作電位產(chǎn)生過程中的離子通透性與膜電位之間的依從關(guān)系的技術(shù)。二、電壓鉗制技術(shù)的方法原理當(dāng)前第19頁\共有72頁\編于星期六\8點(diǎn)

電壓鉗制術(shù)是利用負(fù)反饋電路，在一定時(shí)間內(nèi)將跨膜電位（TransmembranePotential，Vm），保持在某個(gè)選定的電位水平，此電位稱為保持電位（Holdingpotential，Vh），或者使保持電位突然變到某個(gè)特定的幅值的方波電位，稱為鉗制電位（Clampingpotential）或指令電位（Commandpotential，Vc）。當(dāng)前第20頁\共有72頁\編于星期六\8點(diǎn)

(二)電壓鉗方法

電容器電流

Ic=d（CmV）/dt電阻器上電流

IR流過膜的電流總量Idv/dt=0

所有的電流將都是流過膜電阻的，這種電流將能反映離子的流動(dòng)。當(dāng)前第21頁\共有72頁\編于星期六\8點(diǎn)

電壓鉗技術(shù)的基本原理

電壓源（SG）使膜電位固定在特定的水平，并以放大器（AV）記錄，該放大器與一個(gè)反饋放大器（AFB）連接，這一反饋電流通過膜，正好抵消因加電壓而引起的離子電流，通過電流監(jiān)視器測量電流。當(dāng)前第22頁\共有72頁\編于星期六\8點(diǎn)（三）電壓鉗技術(shù)的優(yōu)缺點(diǎn)：

很容易將膜電容電流與離子電流分開；可將膜電流分成不同的成分一INa、IK、Ica等（在灌流液中加入或去除某種離子）能精確反映由離子通道的開放和關(guān)閉，引起的膜電導(dǎo)的改變，能把離子通透性變化的時(shí)間關(guān)系加以描述。能分析離子通透性變化與膜電位的關(guān)系，在研究電壓調(diào)節(jié)通道的行為方面有很大價(jià)值。

1．

優(yōu)點(diǎn)當(dāng)前第23頁\共有72頁\編于星期六\8點(diǎn)

必須在細(xì)胞內(nèi)插入兩個(gè)電極，對細(xì)胞損傷很大；對體積小的細(xì)胞，實(shí)驗(yàn)難以實(shí)現(xiàn)；對形態(tài)復(fù)雜的細(xì)胞，很維保持細(xì)胞膜各處電位一致；只研究一個(gè)細(xì)胞上眾多通道的綜合活動(dòng)規(guī)律，無法反映單個(gè)通道活動(dòng)的特點(diǎn)。

2缺點(diǎn):當(dāng)前第24頁\共有72頁\編于星期六\8點(diǎn)蛙坐骨神經(jīng)元單個(gè)Ranvier結(jié)的電壓鉗記錄當(dāng)前第25頁\共有72頁\編于星期六\8點(diǎn)（四）幾種電壓鉗方法

雙微電極法單蔗糖間隙（SingeSucroseGap）法雙蔗糖間隙（DoubleSucroseGap）法當(dāng)前第26頁\共有72頁\編于星期六\8點(diǎn)雙微電極法單蔗糖間隙（SingeSucroseGap）法雙蔗糖間隙（DoubleSucroseGap）法圖1-2心肌雙微電極電壓鉗法示意圖Em：膜電位；Ec：控制電位；Vo：鉗制電位；I：輸出電流當(dāng)前第27頁\共有72頁\編于星期六\8點(diǎn)雙微電極法單蔗糖間隙（SingeSucroseGap）法雙蔗糖間隙（DoubleSucroseGap）法圖1-3單蔗糖間隙法原理圖圖1-4雙蔗糖間隙法原理圖

Em：膜電位；Ec：控制電位；Em：膜電位；Ec：控制電位；

Vc：鉗制電位；I：輸出電流

Vc：鉗制電位；I：輸出電流當(dāng)前第28頁\共有72頁\編于星期六\8點(diǎn)電極接觸細(xì)胞負(fù)壓吸引形成Ω形膜囊泡提起電極，囊泡與細(xì)胞脫離ABCD第三節(jié)膜片鉗制技術(shù)當(dāng)前第29頁\共有72頁\編于星期六\8點(diǎn)

膜片鉗制技術(shù)（patchclamptechnique)是對一塊單獨(dú)的細(xì)胞膜片（或整個(gè)細(xì)胞）的電位進(jìn)行鉗制的一項(xiàng)電生理技術(shù)。通過對膜電位的鉗制可以觀察通過離子通道的電流，膜片鉗放大器正是通過維持電壓的恒定而測出這種電流。運(yùn)用膜片鉗技術(shù)記到的最小電流可達(dá)到pA級(10-12A)。當(dāng)前第30頁\共有72頁\編于星期六\8點(diǎn)一基本原理

膜片鉗的本質(zhì)屬于電壓鉗范疇，其基本工作原理是：采用經(jīng)典的負(fù)反饋放大技術(shù)作電壓固定，但改用細(xì)胞外微吸管作電極，將微電極管尖端與細(xì)胞膜表面接觸，經(jīng)負(fù)壓抽吸，形成具極高阻抗的緊密封接，其電阻值高達(dá)10-100千歐（即GΩ=109Ω）。只有在這種封接存在時(shí)，通過膜電極引導(dǎo)記錄的電流才是通過該膜的離子通道電流。當(dāng)前第31頁\共有72頁\編于星期六\8點(diǎn)

膜片鉗技術(shù)原理示意圖

Rs是膜片阻抗相串聯(lián)的局部串聯(lián)電阻（輸入阻抗），Rseal是封接阻抗。Rs通常為1～5MΩ，如果Rseal高達(dá)10GΩ（1010Ω）以上時(shí)，IP/I=Rseal/(Rs+Rseal)-1。此Ip可為在I－V轉(zhuǎn)換器（點(diǎn)線）內(nèi)的高阻抗負(fù)反饋電阻(Rf)的電壓降而被檢測出。當(dāng)前第32頁\共有72頁\編于星期六\8點(diǎn)

膜片鉗與電壓鉗的區(qū)別

膜電位鉗制的方法不同；電位固定的細(xì)胞面積不同；研究的離子通道數(shù)目不同；

當(dāng)前第33頁\共有72頁\編于星期六\8點(diǎn)

(1)測量部分：

(2)串聯(lián)電阻補(bǔ)償部分：

(3)電容補(bǔ)償部分：

(4)指令信號控制部分：

(5)電源部分：膜片鉗放大器主要組成:電極電流監(jiān)視器、靈敏度開關(guān)、濾波器開關(guān)、方式選擇開關(guān)。用于校正全細(xì)胞記錄時(shí)，由于電極和細(xì)胞內(nèi)之間的通路電阻所造成的膜電位誤差。用來補(bǔ)償電壓突然改變時(shí)引起的電容電流。將一定的電壓加入到刺激信號中，形成一指令信號的保持電壓。進(jìn)行電壓鉗制時(shí)，它決定膜電位值，作電流鉗制時(shí)，則決定電流值。提供放大器各部分的電源。當(dāng)前第34頁\共有72頁\編于星期六\8點(diǎn)貼附式全細(xì)胞記錄模式負(fù)壓吸內(nèi)面向外式外面向外式拉細(xì)胞細(xì)胞細(xì)胞細(xì)胞拉并暴露于空氣中四種經(jīng)典記錄模式(Cell-attachedorOncellmode)當(dāng)前第35頁\共有72頁\編于星期六\8點(diǎn)

當(dāng)前第36頁\共有72頁\編于星期六\8點(diǎn)

細(xì)胞貼附式膜片（cell-attachedpatch）

優(yōu)點(diǎn)：不破壞細(xì)胞的完整性，不需要胞內(nèi)灌流，不影響細(xì)胞質(zhì)且調(diào)制系統(tǒng)完整?？裳芯客ㄟ^細(xì)胞對單通道的調(diào)制，也可在正常離子環(huán)境中研究遞質(zhì)和電壓激活的單通道活動(dòng)。

缺點(diǎn)：

不能改變細(xì)胞內(nèi)成分，也不能精確測定膜電位。同時(shí)由于許多細(xì)胞膜上存在有牽張激活的離子通道，細(xì)胞膜與電極間輕微的張力變化往往會(huì)增加記錄的背景噪聲。

于細(xì)胞牢固貼附于微管電極的尖由端而得名。它可用于記錄各種細(xì)胞的單通道電流，而且是在細(xì)胞完整無損的狀態(tài)下研究通道的活動(dòng)。當(dāng)前第37頁\共有72頁\編于星期六\8點(diǎn)貼附式記錄（Cell-attachedrecording）細(xì)胞電極細(xì)胞膜胞外液胞內(nèi)液當(dāng)前第38頁\共有72頁\編于星期六\8點(diǎn)內(nèi)面向外式膜片(inside-outpatch)

細(xì)胞貼附式膜片形后，提起電極時(shí)，與電極尖端相接的細(xì)胞膜被撕脫下來開成小泡，將電極尖端在空氣中暴露幾秒鐘后小泡很快破裂，形成胞漿側(cè)向外的內(nèi)面向外式膜片。

特點(diǎn)：較易改變細(xì)胞內(nèi)的離子或物質(zhì)濃度，也能把酶等直接加入膜的內(nèi)側(cè)面，適宜研究胞內(nèi)物質(zhì)對通道活動(dòng)的影響。但實(shí)驗(yàn)中改變膜外側(cè)物質(zhì)困難，且需侵入低鈣液中，以免小泡形成。應(yīng)用：可研究胞內(nèi)信使物質(zhì)cAMP、cGMP、Ca2+，三磷酸肌醇（IP3）等對受體型通道的調(diào)節(jié)，以及胞內(nèi)激素對通道的調(diào)節(jié)。這種方式可使通道與細(xì)胞的調(diào)節(jié)機(jī)制脫耦聯(lián)，使第二信使直接作用于膜內(nèi)，引起通道開閉。

當(dāng)前第39頁\共有72頁\編于星期六\8點(diǎn)內(nèi)面向外記錄（Inside-outrecording）電極脂質(zhì)雙分子層的內(nèi)面面向浴液當(dāng)前第40頁\共有72頁\編于星期六\8點(diǎn)

外面向外式膜片(outsideoutpatch)

細(xì)胞貼附式膜片形成后，向微管電極內(nèi)給予較強(qiáng)的負(fù)壓將膜片吸破，再將電極從細(xì)胞膜上拔起，但不暴露于空氣中，被撕脫下來的膜便形成外面向外式膜片。優(yōu)點(diǎn)：缺點(diǎn)：應(yīng)用：

可以任意改變胞外物質(zhì)的濃度，有利于研究遞質(zhì)對膜離子通道外側(cè)面的作用。

實(shí)驗(yàn)中難以改變胞內(nèi)成分，電極管必須充以低鈣溶液以防小泡形成。

可研究腺苷酸環(huán)化酶、蛋白激酶C等活性變化，以及細(xì)胞膜上信使物質(zhì)二酰甘油、花生四稀酸、GABA、Ach等對受體型的離子通道研究。當(dāng)前第41頁\共有72頁\編于星期六\8點(diǎn)外面向外記錄（Outside-outrecording）Patch-pipette脂質(zhì)雙分子層的外面面向浴液當(dāng)前第42頁\共有72頁\編于星期六\8點(diǎn)全細(xì)胞記錄構(gòu)型(wholecellrecording)

記錄的電流屬于宏觀電流（macroscopicalcurrent），是整個(gè)細(xì)胞離子通道活動(dòng)形成的總和電流。若采用膜片鉗放大器內(nèi)的電流鉗模式，還可以記錄細(xì)胞的靜息電位和動(dòng)作電位。

特點(diǎn)：

①電極管內(nèi)與細(xì)胞之間彌散交換與平衡快，因而容易控制細(xì)胞內(nèi)液的成分；②記錄的是許多通道的綜合電流，需改變內(nèi)部介質(zhì)以分離電流；③適合于對小細(xì)胞的電壓鉗位，對直徑大于30μm的細(xì)胞很難實(shí)現(xiàn)鉗制；④該方法使電生理研究的重點(diǎn)從無脊椎動(dòng)物大細(xì)胞中解脫出來，而向人類和哺乳類細(xì)胞發(fā)展。當(dāng)前第43頁\共有72頁\編于星期六\8點(diǎn)全細(xì)胞記錄（Whole-cellrecording）細(xì)胞電極細(xì)胞膜當(dāng)前第44頁\共有72頁\編于星期六\8點(diǎn)

膜片鉗制技術(shù)記錄方式

當(dāng)前第45頁\共有72頁\編于星期六\8點(diǎn)穿孔膜片記錄技術(shù)（perforatedpatchrecordingtechnique）

Hom和Marty于1988年首次建立了一種對傳統(tǒng)全細(xì)胞記錄法改進(jìn)的方法，該方法是基于某些抗生素如制霉菌素（Nystatin），兩性霉素B（AmphotericinB）等具有在生物膜上形成通透性孔道的特性，將這類抗生素充灌在電極液中，在形成高阻封接后，可使電極液與細(xì)胞內(nèi)液在電學(xué)上相通，因而稱作穿孔膜片記錄技術(shù)。當(dāng)前第46頁\共有72頁\編于星期六\8點(diǎn)穿孔膜片及穿孔囊泡記錄模式（Perforatedpatchandperforatedvesiclemode）制霉菌素形成的孔道電極受體離子通道提起電極胞漿穿孔囊泡(外面向外式)

穿孔膜片(緩慢全細(xì)胞式)當(dāng)前第47頁\共有72頁\編于星期六\8點(diǎn)技術(shù)點(diǎn)的優(yōu)缺點(diǎn)優(yōu)點(diǎn)：與全細(xì)胞記錄相比，該技術(shù)相比有如下優(yōu)點(diǎn)

①由抗生素形成的孔道對于等于或大于葡萄糖的分子均不能通過。因此，在全細(xì)胞記錄時(shí)可避免對胞內(nèi)重要物質(zhì)的滲析影響，通道電流衰減現(xiàn)象顯著減慢，那些對細(xì)胞內(nèi)通訊及通道調(diào)控具有重要作用的第二信使物質(zhì)仍可正常運(yùn)行。

②因抗生素形成的孔道對多價(jià)離子不通透，故胞內(nèi)的這些離子的濃度就不受電極液的影響。因此可在全細(xì)胞電流記錄的同時(shí)用Ca2+染料測定胞內(nèi)游離的Ca2+水平

③對細(xì)胞的損傷作用明顯小于微電極細(xì)胞內(nèi)記錄及膜片鉗全細(xì)胞記錄，記錄時(shí)間可持續(xù)3小時(shí)。④高阻封接不易被破壞，而全細(xì)胞記錄的負(fù)壓脈動(dòng)式抽吸和電壓脈沖易致高阻封接破壞。⑤電極串聯(lián)電阻較低，膜電容更易補(bǔ)償。當(dāng)前第48頁\共有72頁\編于星期六\8點(diǎn)缺點(diǎn)：

①無法使電極液中的大分子與胞內(nèi)物質(zhì)交換。因此研究大分子物質(zhì)對胞內(nèi)機(jī)制的作用就不能進(jìn)行。②由于電極液與胞內(nèi)液之間存在Donnan平衡，因此電極液內(nèi)必須有與細(xì)胞內(nèi)相同濃度的不通透陰離子和Cl-，否則將導(dǎo)致Cl-流出或流入細(xì)胞，使陰離子和水重新平衡，最終導(dǎo)致細(xì)胞體液變化。③穿孔所需時(shí)間較全細(xì)胞法長。當(dāng)前第49頁\共有72頁\編于星期六\8點(diǎn)濃度鉗（concentrationclamp）

用改變灌流液的方法來改變細(xì)胞內(nèi)液或外液中某種化學(xué)成分和濃度。人工地控制膜內(nèi)或膜外的溶液成分，并在瞬間階梯式地改變某種化學(xué)物質(zhì)的濃度，這種技術(shù)就是濃度鉗，也稱為化學(xué)鉗（chemicalclamip）,或稱濃度跳變(concentrationjump)。當(dāng)前第50頁\共有72頁\編于星期六\8點(diǎn)人工脂膜的膜電流記錄

把構(gòu)成細(xì)胞膜的脂質(zhì)分子散布于水表面時(shí)，很容易形成親水端向下脂質(zhì)單分子層，將單分子層背靠背地折疊起來，就形成類似細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)的人工脂質(zhì)雙層。純的脂質(zhì)雙層幾乎是絕緣的，但是將含有通道蛋白的脂質(zhì)小泡融入人工脂膜或?qū)⑺苄酝ǖ赖鞍字苯硬迦肴斯ぶ|(zhì)雙層，便可利用膜片鉗技術(shù)記錄到單通道電流。當(dāng)前第51頁\共有72頁\編于星期六\8點(diǎn)三膜片鉗記錄的基本步驟

（一）、液體配制

主要根據(jù)研究通道的不同，所用細(xì)胞的不同，配制相應(yīng)的液體，基本原則是保持2個(gè)平衡，滲透壓平衡和酸堿平衡。另外，所有液體在使用前必須過濾，以保持液體潔凈。當(dāng)前第52頁\共有72頁\編于星期六\8點(diǎn)（二）、標(biāo)本制備

膜片鉗實(shí)驗(yàn)一般是在單個(gè)細(xì)胞上進(jìn)行。實(shí)驗(yàn)用單細(xì)胞主要來自培養(yǎng)細(xì)胞或急性酶分離的細(xì)胞，也可來自腦片細(xì)胞中的原位細(xì)胞。常用的酶是膠原酶和蛋白酶，單獨(dú)或聯(lián)合使用，有些組織還要加用其它酶，如彈性纖維酶等。

豚鼠心室肌細(xì)胞急性酶分離方法

腸系膜動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞分離

當(dāng)前第53頁\共有72頁\編于星期六\8點(diǎn)（三）、微管電極的制備

一般采用常規(guī)二步法完成，電極尖端直徑在1~2m之間，拋光與涂布液體硅酮樹酯后，充灌電極液。1、微管電極拉制2、電極熱拋光3、緣樹脂涂抹4、電極液充灌

當(dāng)前第54頁\共有72頁\編于星期六\8點(diǎn)（四）、高阻抗封接形成

1．在恒溫條件下，將細(xì)胞貼壁良好的載玻片移入有浴液的浴槽中。浴槽不能太深，以盡量減少電極進(jìn)入浴液的深度，從而減少浮游電容；2．倒置相差顯微鏡下選擇立體感強(qiáng)、活性好的細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)；3．使用新拉制的微管電極，用細(xì)塑料管以反充灌方式灌電極液入電極尖端，若含有氣泡，可手持微電極使其尖端朝下，用手指敲彈幾下管壁即可排除，然后再將微電極安裝在探頭上。當(dāng)前第55頁\共有72頁\編于星期六\8點(diǎn)4．當(dāng)微管電極在微推進(jìn)器幫助下進(jìn)入浴液時(shí)，用注射器向電極施加一正壓（1~2cm—H2O），以防液氣表面顆粒堵塞微管電極尖端；調(diào)節(jié)放大器上pipetteoffset旋鈕，將電極電壓補(bǔ)償?shù)搅?。同時(shí)由膜片鉗放大器向微管電極發(fā)放—電壓為5mV、波寬40ms的方波脈沖信號，用于觀察封接過程；當(dāng)前第56頁\共有72頁\編于星期六\8點(diǎn)5．微推進(jìn)器將微管電極送入到即將接觸細(xì)胞時(shí)，撤去正壓，并繼續(xù)向選定的細(xì)胞表面推進(jìn)，當(dāng)電極尖端輕觸到細(xì)胞表面時(shí)其應(yīng)答電流變小，這時(shí)只要給微管電極尖端管腔內(nèi)施加一負(fù)壓（10~20cmH2O），若在計(jì)算機(jī)屏幕上看到應(yīng)變電流突然下降至零，電流噪聲隨之減少，則提示微管電極尖端與細(xì)胞形成近似電絕緣，其阻抗約10~100GΩ，說明高阻抗封接（gigaseal）形成，這時(shí)的膜片為細(xì)胞貼附式膜片。在此基礎(chǔ)上，根據(jù)不同的實(shí)驗(yàn)要求，再制成不同類型的膜片構(gòu)型。當(dāng)前第57頁\共有72頁\編于星期六\8點(diǎn)保證高阻封接要點(diǎn)：電極電阻適當(dāng)；電極尖端清潔；負(fù)壓抽吸系統(tǒng)密閉；電極與細(xì)胞相貼適度；細(xì)胞膜清潔，活性好。當(dāng)前第58頁\共有72頁\編于星期六\8點(diǎn)膜片鉗記錄系統(tǒng)示意圖灌流槽當(dāng)前第59頁\共有72頁\編于星期六\8點(diǎn)InbathPushedagainstcellMorepressureagainstcellSealGowholecell當(dāng)前第60頁\共有72頁\編于星期六\8點(diǎn)（五）、數(shù)據(jù)采集與分析

實(shí)驗(yàn)中通道電流信號經(jīng)膜片鉗放大器放大后再經(jīng)12位A/D、D/A轉(zhuǎn)換器輸入計(jì)算機(jī)用于電流信號采集，系統(tǒng)連接如下圖所示：

當(dāng)前第61頁\共有72頁\編于星期六\8點(diǎn)分析的內(nèi)容

1、宏觀電流的分析

宏觀電流（macroscopicalcurrent）是指膜上許多通道同時(shí)開放形成的離子電流，是由許多單通道電流總和形成的。應(yīng)用電壓鉗技術(shù)在單細(xì)胞或多細(xì)胞標(biāo)本上記錄的電流和膜片鉗全細(xì)胞模式記錄的電流都屬宏觀電流。當(dāng)前第62頁\共有72頁\編于星期六\8點(diǎn)（1）、通道的藥理學(xué)特性

通道的藥理學(xué)特性是通道分類的重要依據(jù)，許多通道具有特異性阻滯劑和激動(dòng)劑（或開放劑）。TTX——鈉通道特異性阻滯劑，TEA——鉀通道特異性阻滯劑，Cromakilin——ATP敏感鉀通道特異性開放劑利用它們可以區(qū)分膜電流的成分，有助于確認(rèn)通道的種類。當(dāng)前第63頁\共有72頁\編于星期六\8點(diǎn)（2）、通道的門控特性

通道的門控性主要是指電壓門控通道的激活與失活對電壓和時(shí)間的依賴性。典型的電壓門控通道的活動(dòng)包括激活過程和失活過程。鈉通道門控的H-H模型

當(dāng)前第64頁\共有72頁\編于星期六\8點(diǎn)（3）、通道的電流—電壓關(guān)系

通道的電流—電壓關(guān)系（current-voltagerelationship,簡稱I-V曲線）是反映離子通道動(dòng)力學(xué)性質(zhì)的重要參數(shù),可分析通道的激活過程、反轉(zhuǎn)電位、整流特性和離子選擇性等。要獲得I-V曲線，需要給予連續(xù)變化的階躍式脈沖電壓。當(dāng)前第65頁\共有72頁\編于