豬主要病毒性腹瀉防控技術(shù)規(guī)范

豬主要病毒性腹瀉防控技術(shù)規(guī)范范圍本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了豬主要病毒性腹瀉綜合防控技術(shù)的術(shù)語和定義、診斷和處置、綜合性防控措施、生物安全措施、免疫預(yù)防、定期監(jiān)測。本標(biāo)準(zhǔn)適用于廣西境內(nèi)規(guī)模豬場豬主要病毒性腹瀉的綜合防控。規(guī)范性引用文件下列文件對于本文件的應(yīng)用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，僅所注日期的版本適用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本文件。GB7959糞便無害化衛(wèi)生要求GB13078飼料衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)GB17823集約化豬場防疫基本要求GB/T17824.1-2008規(guī)模豬場建設(shè)GB/T17824.2-2008規(guī)模豬場生產(chǎn)技術(shù)規(guī)程GB/T17824.3-2008規(guī)模豬場環(huán)境參數(shù)及環(huán)境管理NY/T1168-2006畜禽糞便無害化處理技術(shù)規(guī)范NY/T5027-2008無公害食品畜禽飲用水水質(zhì)病死及病害動物無害化處理技術(shù)規(guī)范：農(nóng)醫(yī)發(fā)[2017]?25?號生豬產(chǎn)地檢疫規(guī)程：農(nóng)牧發(fā)[2019]?2?號跨省調(diào)運乳用種用動物產(chǎn)地檢疫規(guī)程：農(nóng)牧發(fā)[2019]?2?號術(shù)語和定義下列術(shù)語和定義適用于本文件。規(guī)?；i場intensivepigfar采用現(xiàn)代養(yǎng)豬技術(shù)和設(shè)施設(shè)備，實行自繁自養(yǎng)、全年均衡生產(chǎn)工藝，存欄基礎(chǔ)母豬100頭以上的養(yǎng)豬場。豬主要病毒性腹瀉majorporcineviraldiarrhea由病毒引起的急性消化道傳染病，以厭食、嘔吐、腹瀉、脫水為主要特征，其主要病原有豬流行性腹瀉病毒（Porcineepidemicdiarrheavirus，PEDV）、豬傳染性胃腸炎病毒（Porcine?transmissible?gastroenteritisvirus，TGEV）、豬輪狀病毒（Porcinerotavirus，PoRV）、豬德爾塔冠狀病毒（Porcinedeltacoronavirus，PDCoV），發(fā)病率和死亡率都非常高。診斷和處置總則根據(jù)疫病的流行特點、臨床癥狀和病理變化等做出初步診斷，確診需要依靠實驗室診斷。實驗室診斷方法包括病原學(xué)和血清學(xué)診斷。流行特點概述具有典型的季節(jié)性，常發(fā)生于每年的冬春季節(jié)，對哺乳仔豬造成的危害最為嚴(yán)重，呈現(xiàn)暴發(fā)流行或地方性流行。豬流行性腹瀉（PED）只有一個血清型，不同日齡、品種和性別的豬只均可染病感染、發(fā)病，感染率與病死率隨著日齡的增長而下降，以哺乳仔豬感染率與死亡率最高，死亡率可高達(dá)?50?%?以上。豬傳染性胃腸炎（TGE）只有一個血清型，對?7?日齡以內(nèi)的仔豬危害較大，病死率較高，一般可達(dá)?70?%?以上。日齡較大的病豬通常不會致死，經(jīng)治療后，多可快速恢復(fù)正常。豬輪狀病毒?。≒oR）多個血清型，侵害?1～4?周齡仔豬群，多發(fā)于?10?日齡以內(nèi)的仔豬，發(fā)病率可達(dá)?70?%?以上，病死率在?7?%～20?%。豬德爾塔冠狀病毒?。≒DCo）可引起?5?～15?日齡哺乳仔豬發(fā)病，發(fā)病率和死亡率可高達(dá)?50?%～100?%。臨床癥狀豬流行性腹瀉（PED）育肥豬、成年豬的臨床癥狀較輕。新生仔豬多發(fā)，表現(xiàn)為厭食、嘔吐、腹瀉、脫水等癥狀。發(fā)病仔豬顫抖、打堆，出現(xiàn)腥臭味的水樣腹瀉。隨著腹瀉的發(fā)展，仔豬會因脫水而眼窩下陷、被毛粗亂。部分仔豬腹瀉?3?d～4?d?后死亡，死前側(cè)臥、四肢劃動、口吐白沫。豬傳染性胃腸炎（TGE）小于?10?日齡的仔豬主要癥狀為沉郁、厭食、嘔吐、水樣腹瀉，糞便呈淡綠色或黃綠色，惡臭；患病豬消瘦，運動共濟失調(diào)。斷奶豬、育肥豬及成年豬臨床表現(xiàn)較輕，主要為食欲下降或消失，個別豬出現(xiàn)水樣腹瀉、嘔吐等。豬輪狀病毒?。≒oR）發(fā)病初期，豬只多表現(xiàn)為沉郁、厭食、不愛走動等癥狀，部分仔豬吃奶后出現(xiàn)吐奶、腹瀉，持續(xù)一周以后，脫水嚴(yán)重，體重減輕。成年豬和育肥豬一般不發(fā)病。豬德爾塔冠狀病毒?。≒DCo）發(fā)病豬主要表現(xiàn)為嚴(yán)重厭食、腹瀉、嘔吐、脫水，仔豬致死率高。病理變化豬流行性腹瀉（PED）消瘦、脫水，胃內(nèi)有多量黃白色的凝乳塊。小腸病變具有特征性，腸管膨滿擴張、充滿黃色和灰黃色液體，腸壁變薄、腸系膜充血，個別有小腸黏膜出血點，腸系膜淋巴結(jié)水腫。豬傳染性胃腸炎（TGE）3?～10?日齡的仔豬小腸黏膜腫脹、潮紅，局部附有粘液，部分還有糜爛和潰瘍。膀胱黏膜腫脹，散在出血點。腦膜充血。腦質(zhì)有時較軟、多汁并有小出血點。豬輪狀病毒病（PoR）胃壁膨大、擴張，胃黏膜、漿膜呈暗黑色，胃部含有大量的乳汁和凝乳塊。腸道明顯鼓氣，有時小腸會出現(xiàn)彌漫性充血。豬德爾塔冠狀病毒?。≒DCo）胃腸道上皮損傷，胃小凹和小腸上皮細(xì)胞變性、壞死，繼而導(dǎo)致絨毛嚴(yán)重萎縮。腸壁變薄、松弛，盲腸、結(jié)腸擴張。病程嚴(yán)重者腹腔、胸腔積水。實驗室診斷病毒分離與鑒定——PEDV、PoRV：用含5?μg/mL胰酶的DMEM培養(yǎng)基作為維持液培養(yǎng)接毒的非洲綠猴腎細(xì)胞（Vero細(xì)胞），經(jīng)過3～8代盲傳后，細(xì)胞出現(xiàn)明顯病變。通過RT-PCR、間接免疫熒光（IFA）等方法對傳代細(xì)胞毒進(jìn)行鑒定?！猅GEV、PDCoV：將TGEV、PDCoV?陽性樣品接種豬腎細(xì)胞并對其培養(yǎng)物進(jìn)行細(xì)胞傳代培養(yǎng)，通過細(xì)胞病變、RT-PCR、IFA?等方法對傳代細(xì)胞毒進(jìn)行鑒定。病原檢測按“PEDV、TGEV、PDCoV、PoRV?多重?TaqMan?熒光定量?RT-PCR?檢測方法”（見附錄?A）或“PEDV、TGEV、PDCoV、PoRV?多重?RT-PCR?檢測方法”（見附錄?B?）進(jìn)行檢測?？贵w檢測采集發(fā)病初期和發(fā)病后?3?周的血清，使用商品化酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA）試劑盒進(jìn)行檢測，根據(jù)實驗結(jié)果進(jìn)行判定。結(jié)果判定初步診斷符合4.2、4.3、4.4?的描述，診斷為疑似相應(yīng)的病毒性腹瀉發(fā)病豬。確診符合下列之一者，即可確診：——按、實驗室診斷PEDV、TGEV、PDCoV或PoRV檢測結(jié)果陽性者，確診為相應(yīng)疫病。——非免疫豬只PEDV、TGEV、PDCoV或PoRV特異性抗體檢測結(jié)果陽性者，確診為相應(yīng)疫病。處置對確診的病豬，采取如下處置措施：——加強飼養(yǎng)管理，注意防寒保暖、防暑降溫，減少應(yīng)激因素。——適當(dāng)補充口服鹽水，預(yù)防脫水?！褂每咕幬铮A(yù)防繼發(fā)感染和混合感染?！D(zhuǎn)移病豬至隔離舍，觀察治療?！蕴踟i、僵豬、無飼養(yǎng)價值病豬?！獙μ蕴i、病死豬進(jìn)行無害化處理。綜合性防控措施豬場應(yīng)堅持貫徹“預(yù)防為主，防治結(jié)合，防重于治，養(yǎng)防并重”的原則，做好疫病的綜合防控。豬場實行獸醫(yī)防疫、衛(wèi)生管理場長負(fù)責(zé)制。應(yīng)配備與飼養(yǎng)規(guī)模相適應(yīng)的具有從業(yè)資格的獸醫(yī)技術(shù)人員。定期對豬場員工進(jìn)行生產(chǎn)技術(shù)、疫病防控、生物安全、管理制度等培訓(xùn)。堅持自繁自養(yǎng)，實行封閉式飼養(yǎng)和管理。如需引種，按農(nóng)牧發(fā)[2019]?2?號的規(guī)定進(jìn)行檢疫，引進(jìn)種豬應(yīng)隔離觀察45?d后再次進(jìn)行檢測，確認(rèn)PEDV、TGEV、PDCoV、PoRV為陰性的豬只方可混群飼養(yǎng)。實行全進(jìn)全出管理模式，避免哺乳仔豬寄養(yǎng)和不同階段豬的混養(yǎng)。豬舍的溫度和濕度適宜、飼養(yǎng)密度合理、通風(fēng)良好，應(yīng)符合GB/T17824.2的要求。應(yīng)做好季節(jié)性降溫及保暖措施。豬場環(huán)境質(zhì)量控制參照GB/T17824.3-2008的規(guī)定執(zhí)行。豬場衛(wèi)生防疫按照GB17823的規(guī)定執(zhí)行。及時清理糞污，按照NY/T1168-2006的規(guī)定執(zhí)行。飲水水質(zhì)應(yīng)符合NY/T5027-2008的要求。提高母豬飼料中維生素的比例，?添加免疫增強劑；防止仔豬發(fā)生消化不良或飼料霉變引起腹瀉；飼料應(yīng)符合GB13078的要求。建立種豬引種、配種、分娩、防疫、免疫、檢測、監(jiān)測、用藥、消毒等制度及記錄檔案。規(guī)范記錄豬場投入品采購使用、免疫、消毒、檢測監(jiān)測、疫病診療、無害化處理、產(chǎn)品銷售等，并整理歸檔，做到可追溯。加強投入品管理，不得使用違禁品，嚴(yán)禁超劑量、超范圍使用抗生素、抗菌素等，嚴(yán)格執(zhí)行休藥期。生物安全措施豬場實施封閉隔離飼養(yǎng)，出入口配置消毒設(shè)施，對進(jìn)出豬場的豬只、車輛、物品、人員等實施嚴(yán)格規(guī)范消毒。非生產(chǎn)區(qū)工作人員及車輛不得進(jìn)入生產(chǎn)區(qū)，生活區(qū)大門應(yīng)設(shè)消毒門崗，全場員工及外來人員入場時，均應(yīng)通過消毒門崗，按照規(guī)定的方式實施消毒或沐浴更衣后方可入場。豬場的銷售展示廳和裝豬臺應(yīng)與生產(chǎn)區(qū)隔離，設(shè)立有人員、車輛獨立通道，并對裝豬臺、人員出入口、飼料出入口、污水排出口等關(guān)鍵區(qū)域加強管理和消毒。定期滅鼠、滅蚊、滅蠅，有條件豬場應(yīng)安裝防鳥、防鼠、防蚊、防蠅網(wǎng)等防護設(shè)施。設(shè)立專用病豬隔離舍，對病豬進(jìn)行隔離觀察。設(shè)立獨立的獸醫(yī)室，開展疫病診斷及剖檢采樣。建立專門的病死豬無害化處理區(qū)，地點設(shè)在遠(yuǎn)離生產(chǎn)區(qū)、下風(fēng)處，防止病原擴散。豬場每年全場應(yīng)進(jìn)行3～4次全面徹底的消毒。每批豬出欄后均應(yīng)對豬舍進(jìn)行嚴(yán)格徹底清掃、沖洗和消毒，并空欄7?d以上方可再次進(jìn)豬。豬場廢棄物處理執(zhí)行無害化、環(huán)保性、資源化循環(huán)利用原則。對病死豬及淘汰豬、糞便、污水等養(yǎng)殖廢棄物進(jìn)行無害化處理，按農(nóng)醫(yī)發(fā)[2017]25號和GB7959的規(guī)定執(zhí)行。豬場內(nèi)產(chǎn)生的受污染的飼料、墊料、過期或殘余疫苗和獸藥、一次性豬場用品（如注射器、輸液針、輸精管等）及包裝物等廢棄物應(yīng)集中堆放，采取無害化處理方式。飼養(yǎng)員不得互串豬舍。人員進(jìn)入豬舍前應(yīng)腳踏消毒池，手洗消毒盆進(jìn)行消毒。飼槽應(yīng)定期清潔、消毒，并注意防止被糞尿污染。豬場內(nèi)不得飼養(yǎng)其他動物，不得攜帶其它動物和動物肉類及其副產(chǎn)品入場，內(nèi)部員工不得外購豬肉等畜禽產(chǎn)品。飼養(yǎng)員應(yīng)在場內(nèi)宿舍居住，不得隨便外出；場內(nèi)技術(shù)人員不得到場外出診；不得去屠宰場、其它豬場或屠宰戶、養(yǎng)豬場（戶）或農(nóng)貿(mào)市場逗留。免疫預(yù)防制定和實施科學(xué)合理的免疫程序。PEDV、TGEV、PoRV使用豬流行性腹瀉、豬傳染性胃腸炎、豬輪狀病毒（G5型）三聯(lián)活疫苗實行免疫，PDCoV目前暫無商品化疫苗。后備母豬配種前免疫2次，每次間隔3周。妊娠母豬預(yù)產(chǎn)期前40?d和15?d于后海穴接種2頭份/頭。仔豬的免疫：免疫母豬所生仔豬于斷奶后7?d～10?d?于后海穴接種??1頭份/頭；未免疫母豬所生仔豬產(chǎn)后3?d?于后海穴接種1頭份/頭。疫苗應(yīng)按說明書規(guī)定溫度保存。疫苗稀釋后搖勻并在1?h內(nèi)使用完畢。疫苗瓶不得亂扔，應(yīng)集中無害化處理。疫苗保管、使用實行專人管理。不得使用無批準(zhǔn)文號、過期、變質(zhì)、失效的疫苗。定期監(jiān)測加強豬群生產(chǎn)和防疫管理，定期進(jìn)行PEDV、TGEV、PDCoV、PoRV病原和抗體的監(jiān)測。加強豬群日常臨床觀察和監(jiān)測，及時發(fā)現(xiàn)異常情況，如精神不振、采食減少、體溫升高、消瘦體弱等。對出現(xiàn)厭食、嘔吐、腹瀉、脫水等嚴(yán)重腹瀉癥狀的豬群，選取部分豬只，采集肛拭子、糞便拭子，嚴(yán)重病例則剖檢采集組織樣品，按檢測PEDV、TGEV、PDCoV、PoRV病原；非疫苗免疫豬群，可采集血清，按檢測PEDV、TGEV、PDCoV、PoRV抗體。按或方法檢測，PEDV、TGEV、PDCoV、PoRV病原或抗體檢測結(jié)果陽性者，需立即隔離治療或淘汰，病死豬按照農(nóng)醫(yī)發(fā)[2017]?25?號進(jìn)行無害化處理。

（規(guī)范性附錄）

PEDV、TGEV、PDCoV、PoRV多重TaqMan熒光定量RT-PCR檢測方法引物及探針序列所用引物和探針序列見表A.1。表A.1PEDV、TGEV、PDCoV、PoRV引物及探針序列引物序列（5′→3′）目的基因產(chǎn)物大小/bpPEDV-N-FCTGGAATGAGCAAATTCGCTGPEDV-N140PEDV-N-RCAACCCAGAAAACACCCTCAGPEDV-N-PJOE-AGCGAATTGAACAACCTTCCAATTGGCA-BHQ1TGEV-M-FGCAATTCTTTGCGTTAGTGCATTGEV-M102TGEV-M-RAGCGTACAAATTCCCTGAAAGCTGEV-M-PTexasRed-CTTCCTCTCGAAGGTGTGCCAACTGG-BHQ2PDCoV-M-FATCGACCACATGGCTCCAAPDCoV-M72PDCoV-M-RCAGCTCTTGCCCATGTAGCTTPDCoV-M-P6-FAM-CACACCAGTCGTTAAGCATGGCAAGCT-BHQ1PoRV-VP6-FAATATGACACCAGCAGTTGCAAAPoRV-VP6107PoRV-VP6-RACAGATTCACAAACTGCAGATTCAAPoRV-VP6-PCy5-CAAGCACCACCATTTATATTTCATGCTACA-BHQ3A.2重組質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品的構(gòu)建重組質(zhì)粒構(gòu)建提取PEDV、TGEV、PDCoV、PoRV病毒液總RNA，反轉(zhuǎn)錄成cDNA后作為模板，應(yīng)用特異性引物進(jìn)行PCR擴增，獲得PEDVN基因（140?bp）、TGEVM基因（102?bp）、PDCoVM基因（72?bp）、PoRVVP6基因（107bp）片段。經(jīng)回收、連接pMD-18T、轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細(xì)胞，陽性克隆提取質(zhì)粒，進(jìn)行PCR鑒定和測序鑒定，構(gòu)建4種重組質(zhì)粒作為陽性標(biāo)準(zhǔn)品，分別命名為p-PEDV-N、p-TGEV-M、p-PDCoV-M、p-PoRV-VP6。擴增的目的基因片段擴增的?PEDV?目的片段擴增?PEDVN?基因140?bp片段。擴增代表毒株CV777株（GenBank登錄號：AF353511）N?基因目的片段的核苷酸序列如下：ctggaatgagcaaattcgctggcgcatgcgccgtggtgagcgaattgaacaaccttccaattggcatttctactacctcggaacaggacctcacggcgacctccgttataggactcgtactgagggtgttttctgggttg擴增?TGEV?目的片段擴增?TGEVM?基因102?bp片段。擴增代表毒株P(guān)urdue株（GenBank登錄號：DQ811789）M?基因目的片段的核苷酸序列如下：gcaattctttgcgttagtgcattaggaagaagctatgtgcttcctctcgaaggtgtgccaactggtgtcactctaactttgctttcagggaatttgtacgct擴增?PoRV?目的片段擴增?PoRVVP6?基因107bp片段。擴增代表毒株?HJ-2016?株（GenBank登錄號：MH423866）VP6?基因目的片段的核苷酸序列如下：aacatgacaccagcggtcgcaaacctatttccgcaagcaccaccatttatatttcatgctacagttggacttacgctacgaattgaatctgcagtttgtgaatctgt擴增PDCoV目的片段擴增PDCoVM基因72?bp片段。擴增代表毒株HKU15株（GenBank登錄號：FJ617209）M基因目的片段的核苷酸序列如下：atcgaccacatggctccaattctcacaccagtcgttaagcatggcaagctcaagctacatgggcaagagctg。A.3待檢樣品處理待檢樣品處理如下：——組織樣品：采取病豬的小腸組織約?1g，置于?2.0mL?離心管中，加入滅菌的?1mol/LPBS（pH7.2）1mL，用組織勻漿機或研缽充分研磨后，反復(fù)凍融3次；以10000×g離心?5min，收集上清，用于總RNA?抽提，或置-20?℃保存?zhèn)溆?。——肛拭子、糞便拭子樣品：置于?2.0mL離心管中，加入滅菌的?1mol/LPBS（pH7.2）1mL，在振蕩器上振蕩?30s，以10000×g離心?5min，收集上清，用于總?RNA?抽提，或置-20?℃?保存?zhèn)溆??！?200?μL待檢樣品上清于無?RNA?酶的1.5mL離心管中，按照商品化的?RNA?提取試劑盒操作說明書抽提總?RNA。A.4反轉(zhuǎn)錄建立總體積?20?μL的反應(yīng)體系，包括：5×RT緩沖液?4μL、AMV反轉(zhuǎn)錄酶（5U/μL）0.5μL、dNTP混合物（各10mM/L）1μL、RNA?酶抑制劑（40U/μL）0.5μL、隨機引物6聚體（50pmol/μL）1.5μL、待檢總?RNA?模板?5μL、滅菌雙蒸水7.5μL。加完試劑后瞬時離心混勻。將PCR反應(yīng)管置于普通?PCR?儀內(nèi)進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄。反應(yīng)程序為：30℃，10min；48℃，45min；95℃，5min。獲得的cDNA直接用于多重?zé)晒?PCR?擴增，或置-20℃保存?zhèn)溆?。A.5多重TaqMan熒光PCR反應(yīng)以獲得的cDNA為模板，建立25μL多重TaqMan熒光PCR反應(yīng)體系。包括：PremixExTaqTM（ProbeqPCR）12.5μL，PEDV-N和PoRV-VP6上、下游引物（25pmol/μL）及探針（25pmol/μL）各0.5μL（終濃度均為0.50pmol/μL），TGEV-M和PDCoV-M上、下游引物（25pmol/μL）及探針（25pmol/μL）各0.3μL（終濃度均為0.30pmol/μL），cDNA模板2μL，滅菌雙蒸水5.7μL。擴增程序為：95?℃20s；95?℃1s，58?℃45s，40個循環(huán)，同時收集熒光信號。A.6結(jié)果判定以滅菌雙蒸水為陰性對照，以p-PEDV-N、p-TGEV-M、p-PDCoV-M、p-PoRV-VP6質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品混合物（使用濃度均為107拷貝/μL）為陽性對照，進(jìn)行擴增反應(yīng)。XX性對照反應(yīng)出現(xiàn)典型S形擴增曲線且Ct值≤36個循環(huán)，陰性對照無擴增曲線或Ct值>36個循環(huán)，實驗結(jié)果成立。反之，此次檢測無效。實驗結(jié)果成立時的具體判XX果如下：——若被檢樣品出現(xiàn)PEDV的特異性擴增曲線，且Ct值≤36個循環(huán)，判定為PEDV陽性，記為PEDV（+）；反之，判定為PEDV陰性，記為PEDV（-）；——若被檢樣品出現(xiàn)TGEV的特異性擴增曲線，且Ct值≤36個循環(huán)，判定為TGEV陽性，記為TGEV（+）；反之，判定為TGEV陰性，記為TGEV（-）；——若被檢樣品出現(xiàn)PDCoV的特異性擴增曲線，且Ct值≤36個循環(huán)，判定為PDCoV陽性，記為PDCoV（+）；反之，判定為PDCoV陰性，記為PDCoV（-）；——若被檢樣品出現(xiàn)PRoV的特異性擴增曲線，且Ct值≤36個循環(huán)，判定為PoRV陽性，記為PoRV（+）；反之，判定為PoRV陰性，記為PoRV（-）。A.7多重?zé)晒舛?RT-PCR?產(chǎn)物擴增曲線圖PEDV、TGEV、PDCoV?和?PoRV?多重?zé)晒舛?RT-PCR?產(chǎn)物擴增曲線圖見圖?A.1。說明：1—p-TGEV-M；2—p-PEDV-N；3?—p-PDCoV-M；4—p-PoRV-VP6；1′—TGEV（+）；2′—PEDV（+）；3′—PDCoV（+）；4′—PoRV（+）；58—陰性對照。圖A.1多重TaqMan熒光定量RT-PCR產(chǎn)物擴增曲線圖

（規(guī)范性附錄）

PEDV、TGEV、PDCoV、PoRV多重RT-PCR檢測方法B.1引物序列所用引物序列見表B.1。表B.1PEDV、TGEV、PDCoV、PoRV引物序列引物序列（5′→3′）目的基因片段大小/bpPEDV-NF:GCATTTCTACTACCTCGGAAPEDV-N750R:GCGATCTGAGCATAGCCTGATGEV-MF:GCGTCTGATTGTGAGTCATGTGEV-M544R:GAATAGTCCTGCTGGGTAATGPDCoV-NF:GTCCCAGAGGAAATCTTAAGTATGPDCoV-N183R:CTGGGCCATCTCCGGTTGGGAATCPoRV-VP6F:CTTCGACATGGAGGTTCTGTACTCPoRV-VP6329R:CGTTTCGTCGCGACTCTCTAGB.2重組質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品的制備B.2.1重組質(zhì)粒構(gòu)建使用商品化試劑盒提取PEDVCV777株、TGEVH株、PDCoVGX1701株、PoRVNX株病毒液總RNA，反轉(zhuǎn)錄成cDNA后作為模板，應(yīng)用特異性引物進(jìn)行PCR擴增，獲得PEDVN基因750bp、TGEVM基因544bp、PDCoVN基因183?bp、PoRVVP6基因329?bp?；厥?、純化PCR產(chǎn)物，連接至pMD18-T載體、轉(zhuǎn)化E.coliDH5α感受態(tài)細(xì)胞，陽性克隆增菌培養(yǎng)后提取質(zhì)粒。經(jīng)PCR鑒定、酶切鑒定和測序鑒定正確后，所獲得重組質(zhì)粒作為陽性標(biāo)準(zhǔn)品，分別命名為pPEDV-N、pTGEV-M、pPDCoV-N、pPoRV-VP6。B.2.2擴增的目的基因片段B.擴增的?PEDV?目的片段擴增?PEDVN?基因?750?bp片段。擴增代表毒株?CV777?株（GenBank登錄號：AF353511）N?基因目的片段的核苷酸序列如下：gcatttctactacctcggaacaggacctcacggcgacctccgttataggactcgtactgagggtgttttctgggttgctaaagaaggcgcaaagactgaacccactaatttgggtgtcagaaaggcgtctgaaaagccaatcattccaaaattctctcaacagctccccagtgtagttgagattgttgaacctaacacacctcctgcttcacgtgcaaattcgcgtagcaggagtcgtggcaatggcaacaataggtctagatctccaagtaacaacagaggcaataaccagtcccgtggtaattcacagaatcgtggaaataaccagggtcgtggagcttctcagaacagaggaggcaataataataacaataacaagtctcgtaaccagtccaataacaggaaccagtcaaatgaccgtggtggtgtaacatcacgcgatgatctggtggctgctgtcaaggatgcacttaaatctttgggtattggagaaaatcctgacaggcataagcaacagcagaagcctaagcaggaaaagtctgacaacagcggcaaaaatacacctaagaagaacaaatccagggccacttcgaaggaacgtgacctcaaagacatcccagagtggaggagaattcccaagggcgaaaatagcgtagcagcttgcttcggacccagagggggcttcaaaaactttggagatgcggaatttgtcgaaaaaggtgttgatgcgtcaggctatgctcagatcgc。B.擴增的?TGEV?目的片段擴增?TGEVM?基因?544?bp片段。擴增代表毒株?Purdue?株（GenBank登錄號：DQ811789）M?基因目的片段的核苷酸序列如下：gcgtctgattgtgagtcatgcttcaacggaggcgatcttatttggcatcttgcaaactggaacttcagctggtctataatattgatcgtttttataactgtgctacaatatggaagacctcaattcagctggttcgtgtatggcattaaaatgcttataatgtggctattatggcccgttgttttggctcttacgatttttaatgcatactcggaataccaagtgtccagatatgtaatgttcggctttagtattgcaggtgcaattgttacatttgtactctggattatgtattttgtaagatccattcagttgtacagaaggactaagtcttggtggtctttcaaccctgaaactaacgcaattctttgcgttagtgcattaggaagaagctatgtgcttcctctcgaaggtgtgccaactggtgtcactctaactttgctttcagggaatttgtacgctgaagggttcaaaattgcaggtggtatgaacatcgacaatttaccaaaatacgtaatggttgcattacctagcaggactattg。B.擴增的?PoRV?目的片段擴增?TGEVM?基因?329?bp片段。擴增代表毒株?HJ-2016?株（GenBank登錄號：MH423866）M?基因目的片段的核苷酸序列如下：cttcgacatggaggttctgtactcattgtcaaaaaccttaaaagatgctagagataaaattgttgaaggtacattatactcaaatataagtgatttaattcaacagttcaatcaaatgatagttaccatgaatggaaatgattttcaaatgggaggaataggaaatttgccaatcagaaactggaattttgatttcggattacttggcactactttacttaatatagatgcaaattatgttgaaaatgctagaactaccattgaatatttcattgattttatagataatgtgtgtatggatgaaatggctagagagtcgcgacgaaacg。B.擴增的?PDCoV?目的片段擴增PDCoVM基因183?bp片段。擴增代表毒株HKU15株（GenBank登錄號：FJ617209）M基因目的片段的核苷酸序列如下：gtcccagaggaaatcttaagtatggtgaactccctcctaatgataccccagcaaccactcgtgttacttgggttaagggttcgggagctgacacttctattaaacctcatgttgccaaacgcaaccccaacaatcctaaacatcagctgctacctctccgatttccaaccggagatggcccag。B.3待檢樣品處理待檢樣品處理如下：——組織樣品：采取病豬的小腸組織約?1g，置于?2.0mL?離心管中，加入滅菌的?1mol/LPBS（pH7.2）1mL，用組織勻漿機或研缽充分研磨后，反復(fù)凍融?3?次；以10000×g離心?5min，收集上清，用于總RNA抽提，或置-20℃保存?zhèn)溆??！厥米?、糞便拭子樣品：置于?2.0mL?離心管中，加入滅菌的?1mol/LPBS（pH7.2）1?mL，在振蕩器上振蕩?30?s，以10000×g離心?5min，收集上清，用于總?RNA?抽提，或置?-20?℃?保存?zhèn)溆?。——?200?μL待檢樣品于無?RNA?酶的1.5mL離心管中，按照??RNA?提取試劑盒說明書操作抽提總?RNA。B.4反轉(zhuǎn)錄RT-PCR反應(yīng)B.4.1反轉(zhuǎn)錄建立總體積?20μL?的反應(yīng)體系，包括：5×RT緩沖液?4μL、AMV反轉(zhuǎn)錄酶（5U/μL）0.5μL、dNTP混合物（各10mM/L）1μL、RNA酶