學(xué)位論文--一株豬鏈球菌的分離與鑒定

畢業(yè)論文一株豬鏈球菌的分離與鑒定IsolationandidentificationofStreptococcussuis

目錄摘要： 一株豬鏈球菌的分離與鑒定摘要：2型豬鏈球菌(Streptococcussuistype2，SS2)是一個(gè)重要的人獸共患病原菌，可引起豬敗血癥、腦膜炎及急性死亡，并可導(dǎo)致人感染并死亡。豬鏈球菌2型感染已成為影響全世界養(yǎng)豬業(yè)的重要問(wèn)題之一，全面了解豬鏈球菌的毒力和感染機(jī)制，有效預(yù)防和治療2型豬鏈球菌感染已迫在眉睫。本研究主要采用病料分離、鏡檢、PCR鑒定、藥敏試驗(yàn)、生化試驗(yàn)、動(dòng)物攻毒試驗(yàn)等對(duì)一株豬源鏈球菌進(jìn)行分離鑒定，對(duì)其毒力、抗藥性進(jìn)行初步評(píng)估，為豬鏈球菌的深層研究提供參考依據(jù)。關(guān)鍵詞：2型豬鏈球菌；鑒定；毒力IsolationandidentificationofStreptococcussuisDONGYa-liAbstract:Streptococcussuistype2(SS2)isanimportantswinepathogenandazoonoticagent。Itcancausesepsis,meningitis,andacutedeathofpigs,andcanleadtohumaninfectionanddeath.Streptococcussuistype2infectionshavebeenoneoftheimportantquestionstothepigsindustryworldwide,ItisimminenttocomprehensivefingdingoutthevirulenceandinfectionmechanismsofStreptococcussuisandpreventionandtreatmentofSS2infectineffectively.Thisstudywithpurifiedmicroscopy,PCR,susceptibilitytesting,biochemicaltesting,drugtestingandotheranimalattackonthestreptococcusswinetype2toisolateandidentifieit.WeevaluatesomeofitsvirulenceandresistancetoprovidreferenceforthedeepresearchesofSS2.Keywords:Type2Streptococcussuis;Identification;Virulence

前言豬鏈球菌病是鏈球菌屬馬鏈球菌獸疫亞種、馬鏈球菌類馬亞種、Lancefield分群中D、E、L群鏈球菌以及豬鏈球菌引起豬的疫病的總稱,是一種常見(jiàn)的豬傳染病，世界各國(guó)均有發(fā)生．危害性嚴(yán)重，也是一直困擾我國(guó)養(yǎng)豬業(yè)的重要傳染病之一．豬鏈球菌(Streptococcussuis)是革蘭陽(yáng)性兼性厭氧球菌，是引起豬鏈球菌病最主要的病原,根據(jù)其莢膜多糖抗原性的差異分為35個(gè)血清型，其中豬鏈球菌2型（Streptococcussuistype2,SS2）是毒力最強(qiáng)、危害最嚴(yán)重、流行最廣泛的血清型之一[1]。可引起豬腦膜炎、心內(nèi)膜炎、關(guān)節(jié)炎、肺炎、敗血癥及急性死亡等，也可感染人并致死，是一種重要的人畜共患病病原[2]。豬鏈球菌病是對(duì)當(dāng)今養(yǎng)豬業(yè)造成危害的一個(gè)重要疾病。病豬的鼻液、尿液、血液、肌肉、內(nèi)臟和關(guān)節(jié)液均可檢出病原體。未經(jīng)過(guò)無(wú)害化處理的病死豬肉、內(nèi)臟和廢棄物是散播本病的重要傳染源。呼吸道是主要傳播途徑。本病一年四季均可發(fā)生，但以4-10月份發(fā)病較多，常為地方性流行，短期可波及全群，發(fā)病率、病死率很高[3,4]。1954年在英國(guó)從暴發(fā)敗血癥、腦膜炎和關(guān)節(jié)炎的乳豬中分離得到一株α2溶血豬鏈球菌。Elliot(1968)將此菌命名為莢膜2型豬鏈球菌。之后,該菌在澳大利亞、美國(guó)、丹麥、日本、泰國(guó)、新加坡及歐洲和北美洲的許多國(guó)家導(dǎo)致豬只發(fā)病。1990年初廣東省某豬場(chǎng)暴發(fā)疑似豬2型鏈球菌,1998-1999年江蘇省部分豬飼養(yǎng)集中地區(qū)的豬群中連續(xù)2年在盛夏季節(jié)突然暴發(fā)流行豬鏈球菌病,經(jīng)鑒定病原菌為豬鏈球菌2型,在該病流行期間有25人感染發(fā)病,死亡14人。據(jù)報(bào)道,死者都是處理過(guò)病豬的工人或是接觸過(guò)病豬肉的人群,呈散發(fā)型,表現(xiàn)為職業(yè)危險(xiǎn)。之后通過(guò)禁止宰殺、調(diào)運(yùn)等一系列綜合性防制措施使疫情得到了控制,這說(shuō)明人是通過(guò)與病豬接觸而感染上的,未發(fā)現(xiàn)人與人之間的傳播。2005年7月在四川省某地突然暴發(fā)該病,到目前為止已有38人死亡。臺(tái)灣、泰國(guó)等國(guó)家和地區(qū)也有關(guān)于人感染患腦膜炎、死亡或治療后導(dǎo)致永久性耳聾后遺癥的報(bào)道。在自然條件下,豬通過(guò)鼻咽黏膜和扁桃體感染,而人大多直接與豬或野豬有接觸史,通過(guò)皮膚傷口感染的[5]。本次試驗(yàn)所用病料來(lái)源的仔豬發(fā)生以關(guān)節(jié)腫脹、運(yùn)動(dòng)障礙為主要臨床表現(xiàn)，部分病例在耳部、腹部出現(xiàn)紫斑的病例。剖檢可見(jiàn)關(guān)節(jié)周圍水腫，心內(nèi)膜有針尖大小的出血點(diǎn)。從癥狀、病變上懷疑是豬鏈球菌引起的。由于豬鏈球菌病是多種不同群的鏈球菌引起的不同臨床癥狀類型的傳染病的總和。因此，本病的確診要先對(duì)其病原進(jìn)行鑒定。雖然理論上有很多藥物能治療豬鏈球菌病,但隨著抗菌藥物的廣泛使用以及臨床中不合理用藥,使得病原菌的耐藥現(xiàn)象日趨嚴(yán)重。本次實(shí)驗(yàn)，主要是從病死豬的臟器病料采集菌種，挑選并驗(yàn)證出豬鏈球菌，檢驗(yàn)其部分抗藥性及致病性以為進(jìn)一步防治豬病及深層科研提供基本信息和材料。1材料與方法1.1病原菌分離及鏡檢2011年4月采集病死豬的腦、肺、肝等組織,無(wú)菌接種于普通綿羊血平板。獲得細(xì)菌后染色、鏡檢、純化,獲得1株疑似菌株，命名為DYL-22。并進(jìn)行溶血試驗(yàn)[6]。其中，染色用的是革蘭氏染色，染色、鏡檢、純化步驟為：（1）涂片：①取載玻片一張，拭凈；②用滅菌的接種環(huán)取生理鹽水一滴，放于載玻片中的中央③挑取血平板上直徑0.1毫米--1.0毫米、灰白色、半透明、表面光滑、圓形、邊緣整齊的單個(gè)菌落。④將接種環(huán)上的細(xì)菌加到載玻片的水滴內(nèi)，磨勻，涂成直徑約1cm大小的薄薄菌層。（2）干燥：將玻片置于空氣中，使其自然干燥。（3）固定：手持玻片一端，讓菌膜的朝上，通過(guò)火焰2-3次固定（以不燙手為宜）。（4）染色：①初染：加草酸結(jié)晶紫染液于標(biāo)本上，使其覆滿標(biāo)本，染1-2分鐘，水洗；②媒染：滴加碘液沖去殘水，并保持碘液覆蓋1分鐘，水洗；③脫色：加95％酒精于玻片上來(lái)回流動(dòng)，傾去酒精。如此重復(fù)2-3次（約30秒），水洗。④復(fù)染：加番紅花紅，染色約1分鐘，水洗，干燥。（5）鏡檢：干燥后用顯微鏡觀察。革蘭染色陽(yáng)性、成對(duì)或有鏈狀排列的球形細(xì)菌為可疑菌落。（6）純化：37℃純培養(yǎng)可疑菌落,24h后再次進(jìn)行革蘭染色,對(duì)鏡檢為革蘭染色陽(yáng)性、成對(duì)、短鏈球菌,接種于無(wú)菌血平皿37℃培養(yǎng)24小時(shí)后,置于4℃冰箱保存?zhèn)溆谩?.2相關(guān)試劑及培養(yǎng)基 1.2.1相關(guān)試劑和儀器PremixTaq、DNADL-2000Marker（均購(gòu)自TaKaRa公司），DNA提取試劑盒（購(gòu)自北京百泰克生物技術(shù)有限公司），生化試驗(yàn)試劑盒（購(gòu)自杭州天和微生物試劑有限公司），藥敏紙片，超純水，超凈工作臺(tái)，PCR儀，瓊脂糖凝膠電泳儀及凝膠成像系統(tǒng)，顯微鏡，紫外分光光度計(jì)，高壓蒸汽滅菌器1.2.2培養(yǎng)基①液體馬丁培養(yǎng)基(以200ml為例)稱取10.7g改良馬丁液體培養(yǎng)基粉（53.5/L）溶于200ml超純水，高溫高壓滅菌后，涼至60℃左右分裝至試管中，每管3-5ml，4℃保存。②固體馬丁培養(yǎng)基（以300ml為例）稱取16.05g改良馬丁液體培養(yǎng)基粉（53.5/L）溶于300ml超純水，加入5.5g瓊脂粉，高溫高壓滅菌后，涼至60℃左右倒平皿，直徑9cm的平皿每皿15-20ml，4℃保存。③血平皿培養(yǎng)基（以300ml為例）稱取16.05g改良馬丁液體培養(yǎng)基粉（53.5/L）溶于300ml超純水，加入5.5g瓊脂粉，高溫高壓滅菌后，涼至60℃左右，加入4%血清和0.1%的裂解血，混勻倒平皿。4℃保存。1.2.3標(biāo)準(zhǔn)菌株及實(shí)驗(yàn)動(dòng)物豬鏈球菌2型標(biāo)準(zhǔn)菌株C55606（購(gòu)自中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察所），實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：家兔。1.3病原菌生化試驗(yàn)1.3.1糖發(fā)酵實(shí)驗(yàn)將實(shí)驗(yàn)菌株分別接入葡萄糖、麥芽糖、果糖、乳糖、β-半乳糖苷（ONPC）、菊糖、阿拉伯糖、鼠李糖、肌醇、衛(wèi)矛醇、甘露醇、山梨醇、木糖等生化試劑管中密封37℃培養(yǎng)24h，觀察實(shí)驗(yàn)結(jié)果[7,8]。1.4藥敏試驗(yàn)按標(biāo)準(zhǔn)紙片瓊脂擴(kuò)散法(K-B法)操作，將藥敏紙片貼在劃滿病原菌種的血平皿上，保持紙片間適度距離,37℃溫箱24小時(shí)。本次實(shí)驗(yàn)共用9種藥物：新霉素（N）、阿米卡星（AN）、慶大霉素（GM）、頭孢曲松（CRO）、阿莫西林（AMS）、左氧氟沙星（LVF）、磺胺甲惡唑（SMX）、氟苯尼考（F）、磷霉素（FOS）。（藥敏紙片購(gòu)于北京蘭伯瑞生物技術(shù)有限公司）。1.5病原菌PCR鑒定本實(shí)驗(yàn)所做的PCR鑒定內(nèi)容，主要目的在于檢驗(yàn)菌株DYL-22是否含有g(shù)dh基因。豬鏈球菌的谷氨酸脫氫酶屬于GDH蛋白家族，在細(xì)胞表面表達(dá)[9]。核酸序列分析表明，GDH基因包括一個(gè)開(kāi)放性閱讀框，編碼448個(gè)氨基酸殘基，在細(xì)胞表面表達(dá)，酶活性是NAD(P)H依賴型，作用底物為L(zhǎng)一谷氨酸，其編碼基因在SS2（2型豬鏈球菌）中保守存在。SS2的GDH有保守的抗原性，能與感染有毒豬鏈球菌的豬的血清反應(yīng)，可作為檢測(cè)豬鏈球菌的重要標(biāo)志性抗原[10,11]。若獲得gdh基因，則證明該菌株為豬鏈球菌，而且極有可能為2型豬鏈球菌。1.5.1引物根據(jù)參考文獻(xiàn)[12]合成豬鏈球菌2型特異性引物,分別為gdh688a：CCATGGACAGATAAAGATGG,gdh689b：GCAGCGTATTCTGTCAAACG.1.5.2PCR模板的制備①將菌株接入液體培養(yǎng)基，37℃搖床培養(yǎng)16小時(shí)后，按照百泰克的DNA提取試劑盒使用說(shuō)明書進(jìn)行DNA提?。孩谌?.5-2ml培養(yǎng)菌液，10000rpm，離心30s，棄上清，收集菌體，盡可能吸凈上清。③加入200ul緩沖液RB重懸洗滌細(xì)胞，10000rpm，離心30s,棄上清后將細(xì)胞吹打重懸于200ul緩沖液RB中。④加入50-100ullysozyme（溶菌酶）（10mg/mlin10mMTris-HCl,PH8.0）顛倒混勻，37℃溫浴1h。10000rpm離心2分鐘，棄上清后將細(xì)胞吹打重懸于200ul緩沖液RB中。⑤加入200ul結(jié)合液CB，立即劇烈顛倒充分混勻，再加入20ul蛋白酶K（20mg/ml）溶液，充分混勻，70℃放置10min。⑥冷卻后，加入100ul異丙醇，劇烈顛倒充分混勻，此時(shí)可能出現(xiàn)絮狀沉淀。⑦將上一步所得溶液和絮狀沉淀都加入一個(gè)吸附柱AC中，(吸附柱放入收集管中)10000rpm離心30s，倒掉收集管中的廢液。加入500ul抑制物去除液IR，12000rpm離心30s，棄廢液。⑧加入700ul漂洗液WB，12000rpm離心30s，棄廢液。加入500ul漂洗液WB，12000rpm離心30s，棄廢液。將吸附柱AC放回空收集管中，13000rpm離心2min，盡量出去漂洗液，一面漂洗液中殘留乙醇抑制下游反應(yīng)。⑨取出吸附柱AC，放入一個(gè)干凈的離心管中，在吸附膜的中間部位加100ul洗脫緩沖液EB（洗脫緩沖液事先在65-70℃水浴中預(yù)熱），室溫放置3-5min，12000rpm離心1min。將得到的溶液重新加入離心吸附柱中，室溫放置2min，12000rpm離心1min。DNA暫時(shí)存放在4℃中，長(zhǎng)期存放時(shí)放在-20℃環(huán)境。1.5.3PCR體系、條件及檢測(cè)PCR反應(yīng)體系（20ul體系）為：PremixTaq10ul，模板1ul，上、下游引物各1ul，超純水7ul，共20ul。PCR反應(yīng)條件為：94℃變性5min，然后進(jìn)入35個(gè)循環(huán)：94℃1min、51℃1min、72℃1min，最后72℃延伸7min，PCR產(chǎn)物在4℃短暫保存。瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。1.6病原菌毒力實(shí)驗(yàn)血平皿活化菌種，挑取單菌落，取鏈球菌接種于馬丁湯（加4%血紅素），37℃培養(yǎng)16-18h，進(jìn)行活菌計(jì)數(shù)。取馬丁湯培養(yǎng)基液0.2ml（含菌4000萬(wàn)左右）靜脈注射1.5～2.0kg家兔，接種2只家兔，同時(shí)進(jìn)行活菌計(jì)數(shù)；設(shè)置空白對(duì)照2只，注射等量生理鹽水。家兔死亡后，剖解家兔，取心血接種血斜，37℃培養(yǎng)24h。同時(shí)取家兔心血分裝小試管，置-20℃保存[13,14]。2結(jié)果與分析2.1鏡檢結(jié)果及分析將病料接種在鮮血培養(yǎng)基上，將各菌種純化分離，觀察可疑菌株生長(zhǎng)良好，菌落呈圓形，光滑隆起透明，灰色的露珠狀小菌落，并產(chǎn)生明顯的β型溶血（如圖1）。將在鮮血培養(yǎng)基上的可疑菌落接種在麥康凱瓊脂培養(yǎng)基上無(wú)細(xì)菌生長(zhǎng)。在普通培養(yǎng)基上有菌落生長(zhǎng)但生長(zhǎng)不良。挑取鮮血培養(yǎng)基上的典型菌落，進(jìn)行革蘭氏染色、鏡檢，可見(jiàn)革蘭氏陽(yáng)性、短鏈狀或單在的球菌，菌體直徑0.1-0.2um（如圖2）。圖1:溶血實(shí)驗(yàn)圖2:病原菌革蘭氏染色放大倍數(shù)10002.2生化試驗(yàn)結(jié)果及分析主要針對(duì)豬鏈球菌的糖發(fā)酵的生化試驗(yàn)，從圖3、圖4、圖5中可以看出，葡萄糖、果糖、麥芽糖、乳糖的生化試驗(yàn)管均由藍(lán)紫色變成黃色，菊糖由淺色變成粉色，且這些變色的生化試驗(yàn)管均未發(fā)現(xiàn)有氣體出現(xiàn)，由此可見(jiàn)，該病原菌可發(fā)酵以上5種糖類，但產(chǎn)酸不產(chǎn)氣。而ONPC、阿拉伯糖、鼠李糖、肌醇、衛(wèi)矛醇、甘露醇、山梨醇、木糖等的生化試驗(yàn)管均未變色也未產(chǎn)生氣體，說(shuō)明該病原菌不能酵解以上糖類。以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果與預(yù)期實(shí)驗(yàn)結(jié)果基本一致。圖3：病原菌接種0h圖4：病原菌接種24h圖5:病原菌接種24h2.3藥敏試驗(yàn)結(jié)果及分析如圖6：藥敏紙片從上順時(shí)針?lè)謩e是CRO（頭孢曲松）、AN（阿米卡星）、N（新霉素）、FOS（磷霉素）、AMX（阿莫西林）、F（氟苯尼考）、LVF(左氧氟沙星)、SMX（磺胺甲惡唑）、中間為：GM（慶大霉素）。其中新霉素（N）、阿米卡星（AN）、慶大霉素（GM）、磺胺甲惡唑（SMX）對(duì)該病原菌無(wú)抑菌性或效果很微弱，其他藥物抑菌環(huán)直徑分別為：頭孢曲松（CRO）3.040cm，氟苯尼考（F）2.460cm,磷霉素（FOS）2.360cm，阿莫西林（AMX）1.610cm，左氧氟沙星（LVF）1.734cm。說(shuō)明，該病原菌對(duì)新霉素、阿米卡星、慶大霉素、磺胺甲惡唑敏感度低、抗藥性強(qiáng)；對(duì)頭孢曲松、氟苯尼考、磷霉素、阿莫西林、左氧氟沙星等敏感度高、抗藥性弱，臨床用藥可供參考。圖6：病原菌藥敏試驗(yàn)2.4PCR電泳結(jié)果及分析PCR產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果顯示，標(biāo)準(zhǔn)豬鏈球菌和分離株DYL-22均在700bp左右出現(xiàn)目的條帶，與預(yù)期片段一致。M空白標(biāo)準(zhǔn)DYL-227501000200010025050075010002000100250500圖7：病原菌gdh基因PCR檢測(cè)結(jié)果2.5毒力實(shí)驗(yàn)結(jié)果及分析攻毒家兔在36h左右，出現(xiàn)呼吸困難癥狀，72h左右死亡。剖檢：典型的肺炎、腦膜炎、心肌出血、腸系膜出血、脾臟腫大壞死，腎臟出血壞死等；空白對(duì)照，觀察兩周后健活。圖8：左為肺臟病變出血，右為健康家兔的肺部圖9：腦部病變—主要病變現(xiàn)象為大腦出血水腫，腦部溝回不清圖10：左為心肌病變，右為健康家兔心肌圖11：左為腎臟病變，右為健康家兔腎臟3討論豬鏈球菌通常在豬的扁桃體定居,可分為35個(gè)血清型,在致病性血清型中2型的致病力最強(qiáng),發(fā)病率高,流行范圍廣,其次是1型和9型.鏡檢菌落形態(tài)和溶血現(xiàn)象與鏈球菌相符；生化試驗(yàn)結(jié)果中，除ONPC和菊糖外，其他試劑管的情況符合預(yù)期情況；通過(guò)PCR檢測(cè)該病原菌確帶有g(shù)dh基因，gdh基因?yàn)樨i鏈球菌特征性基因，因此，該病原菌為豬鏈球菌。經(jīng)過(guò)的動(dòng)物攻毒試驗(yàn)，家兔各器官出現(xiàn)明顯豬鏈球菌2型感染癥狀肺臟病變出血、腸系膜淋巴結(jié)出血、脾臟腫大、腦部出現(xiàn)出血水腫、心肌和腎臟病變。豬鏈球菌是革蘭氏陽(yáng)性菌,理論上很多藥物對(duì)其有療效。但近年來(lái)由于抗生素的濫用,如在動(dòng)物飼料中長(zhǎng)期添加抗生素用于促進(jìn)生長(zhǎng)及預(yù)防和治療疾病,發(fā)生疾病后未經(jīng)獸醫(yī)診斷就盲目大量使用多種抗生素等,不僅治療成本提高,而且產(chǎn)生了大量耐藥菌株,使得疾病難以控制。因此，對(duì)病豬或可疑豬采取藥物防治時(shí)，對(duì)于藥物的選用應(yīng)最好通過(guò)藥敏試驗(yàn)來(lái)確定，防止抗生素使用不當(dāng)或經(jīng)常使用而產(chǎn)生耐藥性。在對(duì)該鏈球菌進(jìn)行藥敏試驗(yàn)時(shí)，觀察結(jié)果可見(jiàn)，頭孢曲松（CRO）、氟苯尼考（F）、磷霉素（FOS）、阿莫西林（AMX）、左氧氟沙星（LVF）對(duì)該菌的抑制效果很明顯，如科學(xué)用藥將能起到很好的效果。其次，每年定期用鏈球菌弱毒活菌苗接種。豬鏈球菌病血清型較多,不同豬場(chǎng)發(fā)生豬鏈球菌病的血清型可能不一樣,對(duì)藥物的敏感性也不一樣。同一個(gè)血清型,即使在同一個(gè)豬場(chǎng)不同時(shí)期、豬只的不同生長(zhǎng)階段對(duì)藥物敏感性也可能不一樣。因此,定期對(duì)菌株進(jìn)行耐藥性監(jiān)測(cè)也是控制和治療豬鏈球菌病的必要措施。

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