藥物分析 總論第三章

第三章樣品前處理和藥物提取技術(shù)藥物分析學(xué)總論目錄第一節(jié)生物樣品的采集、制備、貯存1第二節(jié)生物樣品的預(yù)處理2第三節(jié)提取分離及相關(guān)技術(shù)34第四節(jié)化學(xué)衍生化體內(nèi)樣品的特點(diǎn)：1、采樣量少2、待測物濃度低3、干擾物質(zhì)多第五章體內(nèi)藥物分析體內(nèi)藥物分析的特點(diǎn)：1、體內(nèi)樣品需經(jīng)分離與濃集，或經(jīng)化學(xué)衍生化處理后才能進(jìn)行分析2、對分析方法的靈敏度及專屬性要求較高3、分析工作量大測定方法：色譜分析法，免疫分析法和生物學(xué)方法。生物樣品的采集、制備、貯存第一節(jié)一、體內(nèi)樣品的種類生物樣品器官、組織體液血液、尿液、唾液、乳汁、精液、腦脊液、淚液、膽汁、胃液、胰液、淋巴液、糞便等第一節(jié)常用體內(nèi)樣品的制備與貯藏二、體內(nèi)樣品的采集和制備（一）血樣——血漿、血清和全血——體現(xiàn)藥物濃度和治療作用之間的關(guān)系。

——最常用的生物樣本。

1.血樣的采集：注射器、毛細(xì)管眼眶采血、靜脈插管手術(shù)、滯留針股靜脈取血

動物實(shí)驗(yàn)時，采血量不宜超過動物總血量的十分之一。2.血樣的制備：

測定血中藥物的濃度，通常是指測定血漿或血清中的藥物濃度，尤其是血漿，并非指全血。①

血漿（plasma）的制備靜脈血2500~3000r/min離心5~10min血漿置含抗凝劑試管中抗凝劑：

肝素（最常用）、EDTA、枸櫞酸鹽、草酸、氟化鈉。二、體內(nèi)樣品的采集和制備2.血清（serum）的制備靜脈血2500~3000r/min離心5~10min置無抗凝劑試管中37oCor室溫放置30~60min撥去血餅血清

血漿比血清的分離快，而且制取的量約為全血的50%~60%，血清只為全血的20%~40%，多數(shù)研究者用血漿進(jìn)行分析測定。二、體內(nèi)樣品的采集和制備3.全血（wholeblood）的制備靜脈血置含抗凝劑試管中保持血漿和血細(xì)胞的勻相狀態(tài)全血

應(yīng)用：若需專門測定平均分布于血細(xì)胞內(nèi)、外的藥物濃度；血漿內(nèi)藥物濃度波動太大，且難以控制二、體內(nèi)樣品的采集和制備

血樣主要用于藥物動力學(xué)、生物利用度等研究及臨床治療藥物濃度監(jiān)測?！畛Ｓ玫纳飿颖?。二、體內(nèi)樣品的采集和制備（二）尿樣

體內(nèi)藥物清除主要是通過尿液排出，藥物可以原型、Ⅰ相及Ⅱ相代謝物等多種形式排出。尿液的采集——用于藥物劑量回收、尿清除率、生物利用度、內(nèi)源性活性物質(zhì)、藥物代謝分型及代謝物等的研究測定。尿液的采集1.尿樣的特點(diǎn)尿液中藥物濃度較高，收集量可以很大，但易受食物種類、飲水多少、排汗情況的影響。（二）尿樣一般以某一段時間或單位時間內(nèi)尿中藥物的總量（排泄量或排泄率）表示。尿液的采集2.尿樣的采集：測定方式——測定一定時間內(nèi)排入尿中的藥物總量樣本采集——時間尿（在規(guī)定時間區(qū)間內(nèi)采集）,

并測量每次收集的尿液體積。（二）尿樣采集的尿是自然排尿。尿包括隨時尿、晨尿、白天尿、夜間尿及時間尿幾種。（三）唾液（saliva）

一些藥物的唾液藥濃(S）與血漿游離藥濃（P）密切相關(guān)，因此：——TDM中利用對S的測定代替對P的監(jiān)測——藥代動力學(xué)的研究1.唾樣的采集：

在潄口后15min，安靜狀態(tài)下采集口腔內(nèi)自然流出的唾液；也可在刺激下快速采樣(需注意干擾)。物理法(口嚼石臘片、聚四氟乙烯塊或紗布球等)化學(xué)法(將檸檬酸或維生素C等置于舌尖)棄去初始部分后采集（三）唾液（saliva）2.唾樣的制備唾樣采集后，立即測量其除去泡沫部分的體積，以3000rpm離心10min，取上清液直接測定或冷凍保存。（三）唾液（saliva）用于在藥物的動物試驗(yàn)及臨床上由于過量服用藥物而引起的中毒死亡時，為藥物的體內(nèi)動力學(xué)過程提供重要信息。常用的組織：胃、肝、腎、肺、心、腦等1.組織樣品的制備：制成勻漿溶液2.組織樣品的處理：沉淀蛋白法；酸水解或堿水解；酶水解法（四）組織可用于體內(nèi)微量元素的含量測定；也可用于用藥史的估計、臨床用藥物和非法濫用藥物的甄別以及1.頭發(fā)樣品的采集：微量元素在前額部位的頭發(fā)中含量最低，枕部含量最高，應(yīng)從枕部取樣，采集時從發(fā)根部（靠近頭皮約1cm處)，剪取0.5-1g的頭發(fā)（五）頭發(fā)2.頭發(fā)樣品的洗滌：丙酮-水-丙酮3.頭發(fā)樣品的處理：直接甲醇提??；酸水解（0.1mol/L鹽酸）；堿水解（1mol/L氫氧化鈉）；酶水解（最常用）。（五）頭發(fā)三、體內(nèi)樣品的貯存與處理(一）最常用的方法——冷藏或冷凍冷藏—冰箱(4℃)中—短期保存(1~2d)

冷凍—冷柜(-20℃)或低溫冷柜(-80℃)中—長期保存

——冷藏或冷凍的時限：經(jīng)穩(wěn)定性考察后確定

1、血樣的貯藏

采集后及時分離血漿和血清（≤2h），分離后置硬質(zhì)玻璃試管中或EP管中完全密塞后再貯存。

三、體內(nèi)樣品的貯存與處理 2、唾液樣品的貯藏

——測定唾液pH時應(yīng)在取樣的當(dāng)時測定。

——為阻止酶催化生成粘蛋白，應(yīng)在4℃以下保存

——冷凍保存唾液時，解凍后應(yīng)用前搖勻。

三、體內(nèi)樣品的貯存與處理3、尿樣的貯藏

——采集后應(yīng)立即測定（≤24h），若不能立即測定，加入防腐劑后保存?！４鏁r間為24~36h(4℃)或長期(-20℃)三、體內(nèi)樣品的貯存與處理（二）去活性為防止含酶樣品在采樣后酶對待測組分進(jìn)一步代謝，采樣后必須立即終止酶的活性。常采用的方法：液氮中快速冷凍、微波照射、勻漿及沉淀、加入酶活性阻斷劑（如氟化鈉、四氫尿苷、三氯醋酸）或抗氧化劑（如維生素C等）、樣品煮沸。三、體內(nèi)樣品的貯存與處理生物樣品的預(yù)處理第二節(jié)生物樣品的預(yù)處理技術(shù)游離藥物濃度測定方法：平衡透析法：用半透膜只允許小分子藥物通過，而不允許蛋白質(zhì)等大分子物質(zhì)通過的原理而分離游離型藥物。缺點(diǎn)為所需血樣量較多，且耗時長。2.超濾法：超濾法是以多孔性半透膜---超濾膜作為分離介質(zhì)的一種膜分離技術(shù)。在超濾法中超濾膜是超濾技術(shù)的關(guān)鍵。超濾膜是一種具有不對稱結(jié)構(gòu)的多孔膜，膜的正面有一層起分離作用的較為緊密的薄層，稱為有效層，其厚度只占總厚度的幾百分之一，其余部分則是孔徑較大的多孔支撐層。3.超離心法4.凝膠過濾法第二節(jié)體內(nèi)樣品分析的前處理1.生物樣品分析前處理的目的

在測定體內(nèi)藥物及其代謝物時，首先需對復(fù)雜的生物樣品實(shí)施分離、凈化、濃集、化學(xué)衍生化等樣品預(yù)處理過程——為藥物的最終測定創(chuàng)造良好條件。(1)使待測藥物游離——測定藥物的總濃度(2)使樣品純化——消除生物基質(zhì)中內(nèi)源性物質(zhì)的干擾(3)提高檢測靈敏度——適應(yīng)和符合測定方法要求的靈敏度(4)防止分析儀器的污染和劣化——提高分析儀器的耐受程度、改善分析結(jié)果1.體內(nèi)樣品預(yù)處理的目的

樣品制備時應(yīng)考慮的影響因素1．藥物的理化性質(zhì)和存在形式藥物的酸堿性（pKa）、未電離分子的親脂性、揮發(fā)性等物理參數(shù)2.待測藥物的濃度范圍3．藥物測定目的4．選用的生物樣品類型5．樣品預(yù)處理與分析技術(shù)的關(guān)系生物樣品的預(yù)處理技術(shù)有機(jī)破壞除蛋白分離濕法破壞干法破壞氧瓶燃燒有機(jī)溶劑脫水加入中性鹽鹽析加入強(qiáng)酸生成不溶性鹽加入重金屬鹽類沉淀劑加熱法使熱蛋白變性純化與濃集結(jié)合物水解化學(xué)衍生化水解法酶水解溶劑解法（一）去除蛋白質(zhì)法

目的：結(jié)合型藥物釋放、減少乳化的產(chǎn)生、保護(hù)儀器

常用方法：1溶劑沉淀法——蛋白質(zhì)脫水沉淀2中性鹽析法——“鹽析”沉淀蛋白質(zhì)3強(qiáng)酸沉淀法——與蛋白質(zhì)陽離子(銨基)形成不溶性鹽沉淀4熱凝固法——蛋白質(zhì)受熱變性1.溶劑沉淀法

常用的有機(jī)溶劑——乙腈、甲醇、乙醇、丙醇、丙酮、四氫呋喃等

血樣與溶劑的體積比——1∶(1-3)——除去90%

以上蛋白質(zhì) 離心分離——高速(>15000×g)離心5min上清液pH——pH8.5~9.5

常用中性鹽——飽和(NH4)2SO4、Na2SO4、MgSO4、NaCl、Na3PO4等 試劑用量

——血樣與飽和(NH4)2SO4的比例為

1∶2時——除去90%以上的蛋白質(zhì) 離心分離 ——高速離心2min

上清液pH——pH7.0~7.72中性鹽析法3強(qiáng)酸沉淀法

常用的強(qiáng)酸——10%三氯醋酸、6%高氯酸、

5%偏磷酸等

試劑用量

——血清與強(qiáng)酸的比例為1∶0.6時

——除去90%以上的蛋白質(zhì) 離心分離 ——高速(>10000r/min)離心1~2min

上清液pH——pH0~4

當(dāng)待測物熱穩(wěn)定性好時可采用。通?？杉訜嶂?0℃，只能除去熱變性蛋白。

4熱凝固法提取分離及相關(guān)技術(shù)第三節(jié)目的：1、消除內(nèi)源性物質(zhì)、代謝物及其他共存物質(zhì)的干擾；2、提取濃縮待測物質(zhì)，使其易于檢測（二）分離與濃集

——液-液萃取法(傳統(tǒng)的方法)

——固相萃取法(液—固萃取法)

——自動化固相萃取

——固相微萃取

——超濾

——微透析技術(shù)

方法：（二）分離與濃集（1）溶劑的選擇——試驗(yàn)成功的主要條件 考慮：提取效率和選擇性；操作是否方便

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液—液萃取法(liquid-liquidextraction,LLE)（二）分離與濃集（1）溶劑的選擇——相似相溶原則

①對藥物的未電離分子可溶、電離形式分子不溶②沸點(diǎn)低、易揮發(fā)③與水部相混溶④無毒、不易燃燒⑤具有較高的化學(xué)穩(wěn)定性和惰性⑥不影響紫外檢測

1

液—液萃取法液-液萃取的溶劑溶劑紫外截止波長(nm)沸點(diǎn)（℃）極性增加正己烷21069環(huán)己烷21081乙醚22035三氯甲烷24561乙酸乙酯26077正丁醇215118

萃取次數(shù)——通常為1次(萃取R在70%以上) ——必要時2~3次(萃取R在50%以下)

每次用量——和水相的體積比通常為1:1或2~5:1

萃取方式——渦流混合

（2）溶劑的用量

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液—液萃取法（3）水相pH值水相pH值——藥物的pKa確定——90%以上的非電離形式堿性藥物最佳pH值：高于pKa值1~2個pH單位酸性藥物最佳pH值：低于pKa值1~2個pH單位一般規(guī)則：堿性藥物在堿性pH值、酸性藥物在酸性pH值介質(zhì)中提?。?/p>

生物樣品宜在堿性或近中性提取——生物基質(zhì)中內(nèi)源性物質(zhì)多為酸性，在堿性下不易萃取

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液—液萃取法（二）離子對提取法(被測藥物)(反離子)(離子對)提取常數(shù):分配系數(shù)：影響提取效率的因素測定堿性藥物時，一般用烷基磺酸類（RSO3H）作為反離子；如戊烷磺酸、己烷磺酸、庚烷磺酸、辛烷磺酸、月桂磺酸等；測定酸性藥物時，一般用烷基季銨類化合物（R4N+·X-）作為反離子，如四丁基銨、四乙基銨、四辛基銨等。欲提高藥物提取入有機(jī)相的量，應(yīng)選擇對離子對溶解度大的有機(jī)溶劑；常用的提取溶劑為氯仿、二氯甲烷等。2.固相萃取法（Solid-phaseextraction,SPE）①SPE原理——將不同填料作為固定相裝入微型小柱，當(dāng)含有藥物的生物樣品溶液通過時，由于受到吸附、分配、離子交換或其它親和力作用，藥物或雜質(zhì)被保留在固定相上，用適當(dāng)溶劑清洗雜質(zhì)，再用適當(dāng)溶劑洗脫藥物。②洗脫方式A:藥物與固定相的親和力比雜質(zhì)強(qiáng)而被保留，用一種對藥物親和力更強(qiáng)的溶劑洗脫B:雜質(zhì)與固定相親和力比藥物強(qiáng)，藥物被直接洗脫

通常為A模式③固相的選擇原則——固相與被測組分應(yīng)具有相似的極性SPE的填料種類繁多，可分成三類1）親脂型（大孔吸附樹脂、親脂性鍵合相硅膠）2）親水型（硅膠、硅藻土、棉纖維）3）離子交換型2.固相萃取法（Solid-phaseextraction,SPE）④試驗(yàn)步驟——五步1）用甲醇活化填料2）用水或適當(dāng)?shù)木彌_液沖洗小柱——除去殘留的甲醇3）加樣——使樣品經(jīng)過小柱，棄去廢液4）用水或適當(dāng)?shù)木彌_液沖洗小柱——除去殘留的干擾物5）選擇適當(dāng)?shù)南疵撊軇_洗小柱——洗脫被分析物，收集洗脫液，揮干溶劑，備用或直接進(jìn)行在線分析⑤方法特點(diǎn)

優(yōu)點(diǎn)：1）引入雜質(zhì)少

2）完全避免乳化的形成

3）較高萃取率、重現(xiàn)性較好

4）使用溶劑多數(shù)與水混溶，易于自動化 缺點(diǎn)：1）價格昂貴

2）技術(shù)要求高

2.固相萃取法（Solid-phaseextraction,SPE）（四）固相微萃取技術(shù)（五）湍流色譜由有孔的填料代替了無孔填料，當(dāng)使用內(nèi)徑為1.0mm的柱子時，流速可以達(dá)到3～5ml/min而柱回壓（columnback-pressure）較低；且溶劑前沿峰呈現(xiàn)塞子樣的輪廓而非拋物線的形狀，既非線性液流；這兩個特點(diǎn)提高了滲透速率，可以盡快達(dá)到吸附平衡。TFC是一種直接進(jìn)樣預(yù)處理技術(shù)，在對血漿和血清樣品的處理上實(shí)用性很強(qiáng)，利用分子排阻原理，使得大分子的生物基質(zhì)成分與小分子藥物得到很好分離。這樣，樣品的預(yù)處理過程簡化為離心后就可以直接進(jìn)樣處理。TFC一般用于蛋白結(jié)合率高的樣品，通常的樣品不需要特殊的處理其回收率就能達(dá)到70-100%，而與蛋白結(jié)合非常強(qiáng)的藥物在進(jìn)行TFC時要調(diào)低流速（0.5ml/min)或在萃取前進(jìn)行酸化。（六）膜萃取技術(shù)利用膜在兩相間的選擇性屏障作用進(jìn)行分離富集的方法。包括有孔膜萃取和無孔膜萃取兩大類。技

術(shù)膜類型原理驅(qū)動力主要聯(lián)用儀透

析有孔分子排阻濃度差異LC電透析有孔分子排阻和選擇離子傳輸電位差異CE過

濾有孔分子排阻壓力差異LC膜萃取無孔分配系數(shù)濃度差異LC,GC,CE2023/6/1360血漿透析液（pH7.4)藥物藥物C袋內(nèi)－C袋外C袋內(nèi)P%=×100%平衡透析法示意圖取適當(dāng)大小和一定截流分子量的管狀半透膜制成袋狀，照圖示方法操作2023/6/1361藥物水收集管樣品管3000-10000r/min離心5-15min游離藥物濃度藥物-蛋白蛋白質(zhì)具有一定截留分子量的超濾膜藥物血漿總濃度結(jié)合型游離型超濾法示意圖（七）微透析目前微透析技術(shù)廣泛應(yīng)用于色譜分析，特別是在用毛細(xì)管電泳分析生物樣品時。原理如下圖所示：微滲析管子檢測系統(tǒng)微注射器微注射泵（八）超臨界流體萃取藥物分析中廣泛采用SEF與其它多種分析儀器聯(lián)用技術(shù)。如：SFE-GC、SFE-HPLC、SFE-FTIR（fouriertransforminfra-redspectroscopy，傅立葉變換紅外光譜）、SFE-NMR（nuclearmagneticresonance，核磁共振）、SFE-MS（massspectrography，質(zhì)譜法）及SFE-SFC（supercriticalfluidchromatography，超臨界流體色譜法）聯(lián)用等。優(yōu)點(diǎn)如下：①回收率高，不易乳化②分析速度快，適于批量處理③適用范圍廣④易于聯(lián)用⑤減少了有毒性的有機(jī)溶劑的使用（九）柱切換技術(shù)原理如圖柱切換技術(shù)可用于：(1)樣品沉淀蛋白后進(jìn)樣(2)體液直接進(jìn)樣(在線去蛋白)(3)全血或組織勻漿直接進(jìn)樣(4)其他聯(lián)用：在線透析、在線衍生化等衍生化處理一些藥物或代謝物因極性大，揮發(fā)性低，對熱不穩(wěn)定，或不具紫外、熒光性能，或檢測靈敏度低，沒有合適檢測方法時，需衍生化處理GC中衍生化目的——增加組分的熱穩(wěn)定性和揮發(fā)性、減少被測組分在樣品處理中因吸附性強(qiáng)而導(dǎo)致的損失、改善被測組分的色譜行為、增加被測物的檢測靈敏度和選擇性HPLC中衍生化目的——增加組分的檢測靈敏度、改進(jìn)組分的層析行為

其他目的——手性拆分、增加樣品穩(wěn)定性2023/6/1367GC法常用的衍生化方法硅烷化法

（silylation）——用于含－OH，=NH，－COOH，－SH等基團(tuán)藥物的衍生化。常用試劑有：N,O-雙三甲基硅烷基三氟乙酰胺(BSTFA)、三甲基氯硅烷(TMCS)等R-OHR-COOHR-SH+R-NH2R1R2NH-O-Si(CH3)3-COO-Si(CH3)3-S-Si(CH3)3-NH-Si(CH3)3，-N[Si(CH3)3]2R1R2N-Si(CH3)3TMS衍生化試劑→2023/6/13682023/6/1369GC法常用的衍生化方法乙?；?/p>

(acylation)——適用于含－NH2，－OH，－SH的藥物，常用?；噭┯腥阴ｔ═FAA），五氟丙酰酐（PFPA），五氟苯甲酰氯（PFBC）等GC法常用的衍生化方法烷基化法（alkylation）——適用于含活潑氫原子的化合物，常用試劑有：三甲基苯基氫氧化銨（TMAH）,重氮甲烷（diazomethane）,碘甲烷（iodomethane）等酯化（esterification）反應(yīng)——主要用于含羧基化合物的衍生化處理，衍生化試劑為醇類鹵代衍生化——目標(biāo)化合物經(jīng)鹵化衍生后，成為適合于電子捕獲檢測器檢測的物質(zhì)，對該物質(zhì)的檢測限可達(dá)到更低數(shù)量級。常用鹵代衍生化法有：鹵素法、鹵化氫法、N-溴代琥珀酰亞胺（N-bromosuccinimide，NBS）法2023/6/1370HPLC法中的衍生化方法

常用衍生化試劑熒胺、鄰苯二醛——適用于氨基酸，肽類丹磺酰氯、異氰酸-萘酯等——適用于胺，酚，羧酸，巰基等化合物衍生化方法柱前衍生化柱后衍生化2023/6/1371泵流動相進(jìn)樣閥色譜柱混合檢測器閥流量計試劑儲存器氮壓柱后衍生化示意圖2023/6/1372注意問題在樣品預(yù)處理過程中應(yīng)注意兩個方面的問題：待測物損失

容器吸附——對玻璃儀器進(jìn)行硅烷化處理蛋白共沉淀藥物發(fā)生降解、絡(luò)合反應(yīng)衍生化反應(yīng)不完全濃縮中揮發(fā)損失等樣品污染內(nèi)源性雜質(zhì)外源性污染——容器、濾紙、溶劑、皮膚2023/6/13732023/6/1374玻璃儀器硅烷化處理干燥玻璃試管+1%三甲基氯硅烷的甲苯溶液，淌洗管內(nèi)壁，100℃干燥30min干燥玻璃試管充滿10%二甲基二氯硅烷的甲苯溶液，放置30min，傾出溶液。依次用甲苯、甲醇淌洗，烘干2023/6/1375應(yīng)用示例

示例1、肝臟組織中鹽酸克倫特羅的預(yù)處理方法采用堿性條件下提取鹽酸克倫特羅用稀鹽酸反萃取去除脂肪調(diào)整酸度后用陽離子交換固相小柱凈化洗脫液經(jīng)濃縮揮干后用BSTFA衍生化GC-MS選擇離子檢測法測定肝臟組織中鹽酸克倫特羅的殘留量

2023/6/1376鹽酸克倫特羅的液-液提取稱取動物肝組織于帶蓋聚四氟乙烯管中，加入10.0％碳酸鈉溶液2mL，乙酸乙酯和異丙醇混合溶劑(64)15mL，5000rpm離心2min，吸取上層有機(jī)溶劑置另一離心管中，重復(fù)提取一次合并有機(jī)相，加正丙醇10mL，于50C水浴濃縮至干,用10mL乙酸乙酯溶解,轉(zhuǎn)移至另一管中，加0.10mol/L鹽酸4mL，5000rpm離心2min分取下層溶液，上層重復(fù)萃取一次，合并下層酸液，用1mol/LNaOH溶液調(diào)節(jié)pH至5.2，用20mmol/L的乙酸銨溶液（pH5.2）定容至10mL

2023/6/1377鹽酸克倫特羅的固相萃取和衍生化固相萃取——SCX小柱依次用甲醇5mL、水5mL和30mmol/L鹽酸5mL活化。取上述液-液萃取液5mL上樣至固相小柱中，依次用5mL水和5mL甲醇淋洗柱子。抽干小柱，用4％氨化甲醇溶液5mL洗脫衍生化——于50℃水浴中用氮?dú)獯蹈缮鲜鱿疵撘?，?00L甲苯和100LBSTFA，加蓋震蕩，80℃烘箱中加熱衍生1h(蓋住蓋子)，待冷卻后轉(zhuǎn)入進(jìn)樣小瓶中，進(jìn)行氣相色譜-質(zhì)譜分析2023/6/1378示例2、唾液中可待因的預(yù)處理方法取唾液樣品0.5ml，置硅烷化玻璃試管中，加4mL蒸餾水和0.1mol/L磷酸鹽緩沖液(pH6.0)2ml，混勻，2000rpm離心10min，取上清液進(jìn)行固相提取固相提取柱(反相基團(tuán)與陽離子交換)，用3mL甲醇、3mL蒸餾水和1mL磷酸鹽緩沖液處理上樣與沖洗：將上清液加到固相小柱上,用2ml蒸餾水、2mL0.1mol/L醋酸鹽緩沖液（pH4.5）和3mL甲醇洗滌可待因的固相萃取洗脫：用二氯甲烷-異丙醇（80:20，含3%NH4OH）3mL洗脫可待因，洗脫液于氮?dú)饬飨抡舭l(fā)至干（<40C）重組：殘渣用100uL三氯甲烷重組，加100uL三氟乙酸酐（TFAA），于70C衍生30min，氮?dú)饬飨拢?lt;40C）蒸發(fā)至干分析：殘渣再用50L乙酸乙酯重組，取1L進(jìn)行GC-MS分析2023/6/13792023/6/1380示例3、頭發(fā)中mephedrone及其代謝物的預(yù)處理方法去污：室溫下用2mL二氯甲烷洗滌頭發(fā)樣品2min（洗2次），待自然干燥后，用剪刀剪切頭發(fā)成約1mm長，混勻消解：用酶消解法，取頭發(fā)樣品置含有Cleland’s試劑的玻璃小瓶中，加蛋白酶K15mg，加1mlTris緩沖液，在不斷攪拌下于37.5C孵育2h提取：用己烷3ml提取藥物，三氯甲烷-乙醇-乙醚（3:1:1）混合液提取代謝物，將消解后的內(nèi)容物與提取液旋渦混合，5C離心5min重組：取有機(jī)層，在氮?dú)饬飨赂稍铮瑲堅?00L乙腈重組，取3L進(jìn)行LC-MS/MS測定2023/6/1381在線預(yù)處理技術(shù)柱切換(columnswitching,CS)HPLC法CS是一種在線的固相分離技術(shù)選用一個3～5cm長的短柱，用低溶劑強(qiáng)度的預(yù)處理流動相使生物樣品凈化，富集切換閥后，分析流動相將組分帶入分析柱分離測定測定結(jié)束后儀器自動恢復(fù)開始狀態(tài)，準(zhǔn)備下次進(jìn)樣

CS-HPLC工作原理提取柱分析柱泵1泵2檢測器1檢測器2廢液廢液2023/6/1382待所有被測物進(jìn)入分析柱后，閥再切回到實(shí)線位置，此時分析柱進(jìn)行樣品分離、檢測；提取柱被再生，準(zhǔn)備下次進(jìn)樣第一步：閥處實(shí)線位置，開泵1提取、純化(保留被測物，除去水溶性雜質(zhì))，此時分析柱作好接受樣品分析的準(zhǔn)備第二步：閥處虛線位置，開泵2

從提取柱中洗脫被測物，進(jìn)入分析柱分析進(jìn)樣器本法優(yōu)點(diǎn)樣品處理簡單，自動化，生物樣品除去蛋白后可直接進(jìn)樣，全部過程在封閉狀態(tài)下進(jìn)行，對不穩(wěn)定樣品特別適用富集作用提高了方法靈敏度進(jìn)樣量大（0.2～1.0ml），樣品處理全過程由儀器控制，故分析結(jié)果精密度高，無需內(nèi)標(biāo)具有樣品制備和測定雙重功能，痕量組分經(jīng)提取柱得到濃縮和純化，并可利用峰前部、中心和末尾的切割，將提取柱內(nèi)組分有選擇性地轉(zhuǎn)入分析柱，提高了方法專屬性2023/6/13832023/6/1384示例4、順序注射-SPE-HPLC-柱后衍生化法測定尿中卡托普利

采用順序注射（SI）-在線固相萃?。⊿PE）-HPLC-柱后衍生化（PCD）測定方法固相柱處理：依次用1ml甲醇、1ml水洗SPE柱裝樣：取2ml樣品分4次上樣，流速0.5ml/min用5%甲醇1ml沖洗固相柱，流速0.5ml/min用500L甲醇洗脫卡托普利，流速0.25ml/min取300L洗脫液進(jìn)行HPLC-PCD分析自動進(jìn)樣器將20L樣品液注射入分析柱進(jìn)行分析，流出液與B-R緩沖液和衍生試劑EP匯合進(jìn)反應(yīng)管形成EP-CAP衍生物，于285nm檢測

衍生試劑2023/6/1385SI-SPE-HPLC-PCD裝置示意圖多通道選擇閥進(jìn)樣閥緩沖液載流(水)分析柱1623450987樣品甲醇5%甲醇收集瓶泵流動相檢測器反應(yīng)管蠕動泵廢SPE蠕動泵貯存管廢空氣方法健康志愿者24h尿樣，過0.45m濾膜，取2ml，按SI-SPE-HPLC-PCD操作步驟分析：固相柱處理：用1ml甲醇、1ml水洗滌柱(0.5ml/min)裝樣：取2ml樣品分4次上樣(500L/次，0.5ml/min)用5%甲醇1ml沖洗固相柱，0.5ml/min用500L甲醇洗脫卡托普利（0.25ml/min），收集至適宜小瓶內(nèi)