比濁法快速測定硫酸多黏菌素E效價

比濁法快速測定硫酸多黏菌素E效價【摘要】研究比濁法測定硫酸多黏菌素E效價的影響因素和規(guī)律，建立了硫酸多黏菌素E的比濁法快速測定方法，檢測時間由杯碟法的20h縮短到4h。當(dāng)硫酸多黏菌素E的效價為30～100u/ml時，檢測菌液接種濃度為5%，培養(yǎng)時間為4h，吸光度對數(shù)值與抗生素效價具有良好的線性關(guān)系。本法重現(xiàn)性好，相對誤差小于5%。

【關(guān)鍵詞】硫酸多黏菌素E比濁法效價

FastdeterminationofthepotencyofpolymyxinEbyturbidimetryassay

ABSTRACTAturbidimetryassayforfastdeterminationofpolymyxinEpotencywasdevelopedbystudyingontheinfluencingfactors.ComparedwithOxfordassay,turbidimetryassaydecreasedthedeterminationtimefrom20hoursto4hours.TherewasalinearrelationshipbetweenthepotencyofpolymyxinEandthelogarithmofabsorbencyintherangeof30～100u/mlandinoculatingconcentrationwas5%,with4hourculturetime.Theturbidimetryassayhadagoodreproducibility,andtherelativeerrorwaslessthan5%.

KEYWORDSPolymyxinE;Turbidimetryassay;Potency

多黏菌素E(polymyxinE或colistin)是由多黏芽孢桿菌抗敵素變株(Bacilluspolymyxinnus)經(jīng)發(fā)酵培養(yǎng)生產(chǎn)的一種環(huán)狀多肽類抗生素，它對革蘭陰性桿菌有強(qiáng)烈的抑菌作用［1］。由于多黏菌素E具有高效、低毒、殘留少的特性，將其硫酸鹽制成獸藥用于防治由大腸埃希菌、銅綠假單胞菌、沙門菌等革蘭陰性菌［2］引起的肉雞、豬、牛等畜禽的腸道疾病。目前采用杯碟法［3，4］測定其生物效價。杯碟法操作步驟復(fù)雜，耗時長，測定時間需要大約20h，不能快速反饋工業(yè)生產(chǎn)中各個階段產(chǎn)品生物活性，必須開發(fā)一種快速測定硫酸多黏菌素E效價的方法。比濁法是抗生素效價微生物檢定的方法之一［5～8］，其原理是將一定量的抗生素加至接種有試驗(yàn)微生物的液體培養(yǎng)基內(nèi)，混勻后，經(jīng)短期培養(yǎng)，測量培養(yǎng)物的吸光度，在一定線性范圍內(nèi)細(xì)菌培養(yǎng)物吸光度的對數(shù)值logA與抗生素的濃度成正比，比濁法具有檢測快速的特點(diǎn)。本文深入研究了比濁法測定硫酸多黏菌素E效價的影響因素和規(guī)律，建立了硫酸多黏菌素E的比濁法快速檢測方法。

1材料與方法

材料

(1)檢定菌大腸埃希菌(CMCC(B)44102)購自微生物菌種保藏中心。

(2)硫酸黏桿菌E素(硫酸多黏菌素E)標(biāo)準(zhǔn)品中國獸醫(yī)藥品監(jiān)查所提供，批號K02700902，效價19536u/mg。

(3)主要儀器752紫外分光光度計；恒溫水浴振蕩器；牛津杯(不銹鋼，高100mm，外徑，內(nèi)徑)；PHS3C精密pH計。

方法

(1)檢定培養(yǎng)基的制備稱取蛋白胨8g，牛肉膏4g，酵母粉5g，磷酸氫二鉀，磷酸二氫鉀1g，氯化鈉，葡萄糖，加蒸餾水至1000ml加熱混勻，調(diào)節(jié)pH值為，過濾，115℃滅菌30min。

(2)檢測菌液的制備取大腸埃希菌的瓊脂斜面培養(yǎng)物一支，加%滅菌生理鹽水1ml洗下菌苔轉(zhuǎn)入茄瓶，37℃培養(yǎng)18～22h，用%滅菌生理鹽水15ml洗下菌苔，制成菌液，在分光光度計上波長為600nm處用%滅菌生理鹽水調(diào)節(jié)菌液吸光度值(A=2左右)，用此菌液分以%、5%和10%的接種量接種至檢定培養(yǎng)基作為檢測菌液。

(3)硫酸多黏菌素E標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制精確稱取硫酸多黏菌素E標(biāo)準(zhǔn)品，用的磷酸鹽緩沖液稀釋到600u/ml，再用水稀釋成濃度分別為30、40、50、60、70、80、90和100u/ml等8種濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液。

(4)比濁法吸光度測定精密吸取1ml硫酸多黏菌素E溶液，加9ml檢測菌液，放入恒溫水浴搖床以200r/min轉(zhuǎn)速37℃振蕩培養(yǎng)一定時間，取出，立即用冷水冷卻，搖勻，以9ml未接種檢定培養(yǎng)基和1ml水混合液作參比，用分光光度計在600nm波長處［9］分別測定吸光度。

(5)比濁法樣品檢測將樣品稀釋到適當(dāng)濃度后，按實(shí)驗(yàn)(4)中有關(guān)步驟操作測定吸光度，在吸光度對數(shù)效價標(biāo)準(zhǔn)曲線上查對應(yīng)的效價，乘以稀釋倍數(shù)，即得到樣品的效價。

2結(jié)果與討論

檢測條件的選擇

(1)大腸埃希菌生長曲線的測定將大腸埃希菌菌液分別以%、%和10%的接種量接入檢定培養(yǎng)基，37℃條件下以200r/min振蕩培養(yǎng)，在600nm處每小時檢測一次培養(yǎng)物的吸光度，結(jié)果如所示。大腸埃希菌在自然狀態(tài)下生長時延遲期一般為1h左右，這一時期菌體生長緩慢，菌量基本上維持在最低水平；然后進(jìn)入指數(shù)期，這一時期大約持續(xù)7～8h，這一時期菌體生長速率常數(shù)最大，生長最迅速；9h以后進(jìn)入穩(wěn)定期，菌體總量保持不變。當(dāng)菌體生長時間在2～4h，吸光度值達(dá)到～，處于最佳檢測時期。

Innoculatingconcentration:1:%;2:5%;3:10%

Cellgrowthcurveof(2)檢測菌液接種濃度的選擇將接種濃度分別為%、%和10%的檢測菌液按實(shí)驗(yàn)(4)培養(yǎng)2h，繪制吸光度效價曲線()。由可見，不同接種濃度的檢測菌液對培養(yǎng)物的吸光度影響較大。當(dāng)檢測菌液接種濃度為%時，由于初始接種量少，少量抗生素的存在能夠完全抑制菌體的生長，菌體幾乎不能生長；當(dāng)檢測菌液接種濃度為10%時，菌體生長很快，抗生素難以抑制菌體生長，不同濃度抗生素對菌體生長的抑制程度不明顯；當(dāng)檢測菌液接種濃度為5%時，不同濃度抗生素對菌體生長的抑制程度區(qū)別明顯，靈敏度高，因此5%接種濃度的檢測菌液適合本法測定硫酸多黏菌素E效價。

Innoculatingconcentration:1:%;2:5%;3:10%

Effectofdifferentinnoculatingconcentration

onabsorbency

(3)培養(yǎng)時間的選擇接種濃度%的檢測菌液，按實(shí)驗(yàn)(4)分別培養(yǎng)2、3和4h，繪制吸光度效價曲線()。由可見，在實(shí)驗(yàn)菌接種量固定在5%的條件下，增加培養(yǎng)時間，靈敏度提高顯著。培養(yǎng)時間為2h，吸光度效價曲線比較平坦，靈敏度低，當(dāng)培養(yǎng)時間增加為4h，不同濃度抗生素對菌體生長的抑制程度區(qū)別明顯，靈敏度高，因此選擇4h作為培養(yǎng)時間用于檢測。

標(biāo)準(zhǔn)曲線的確立

精密吸取30、40、50、60、70、80、90和100u/ml等8種硫酸多黏菌素E標(biāo)準(zhǔn)溶液各1ml，加9ml接種濃度為5%的檢測菌液，放入恒溫水浴搖床以轉(zhuǎn)速200r/min37℃培養(yǎng)4h，取出，立即用冷水冷卻，搖勻，以9ml未接種檢定培養(yǎng)基和1ml水混合液作參比，用分光光度計在600nm波長處分別測定吸光度，以硫酸多黏菌素E濃度為橫坐標(biāo)，吸光度對數(shù)值為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線()。

將吸光度對數(shù)值對相應(yīng)濃度進(jìn)行線性回歸，得到回歸方程

lgA=-+r=

可見硫酸多黏菌素E的濃度在30～100u/ml的范圍內(nèi)與吸光度對數(shù)值呈良好的線性關(guān)系。

重現(xiàn)性測定

用比濁法對3個不同規(guī)格的硫酸多黏菌素E樣品進(jìn)行重現(xiàn)性試驗(yàn)，檢測4次結(jié)果見，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差在3%以內(nèi)，重現(xiàn)性較好。

正確性測定

以杯碟法［10］測定效價數(shù)據(jù)為標(biāo)準(zhǔn)，得出本方法的準(zhǔn)確度()；比濁法測定的相對誤差在5%以內(nèi)，符合藥典規(guī)定要求，提示比濁法能夠準(zhǔn)確測定硫酸多黏菌素E效價。

3結(jié)論

(1)比濁法能夠快速、準(zhǔn)確地測定硫酸多黏菌素E效價，檢測時間由杯碟法的20h縮短到4h，方法重現(xiàn)性好，相對誤差小于5%。

(2)比濁法進(jìn)行硫酸多黏菌素E效價測定時應(yīng)注意培養(yǎng)基的質(zhì)量以及檢測儀器等。培養(yǎng)基配置后應(yīng)過濾后再滅菌，以免培養(yǎng)基中形成沉淀影響測量。試管應(yīng)選同一批、同一型號，管壁均勻一致，試管潔凈無污染，以免影響測量結(jié)果。培養(yǎng)結(jié)束后立即冷卻，測定前應(yīng)搖勻。

【參考文獻(xiàn)】

［1］StarkeyDD,AntoinetteI,RalphJW.Paradoxicalsynergismandantagonismbetweenserumandantibacterialactivityofcolistin［J］.JInfectDis,1971,23(4):392

［2］JianL,RogerLN,RobertWM,etal.EvaluationofcolistinasanagentagainstmultiresistantGramnegativebacteria［J］.IntJAntimicrobAgents,2005,(25):11

［3］吳佩玲.改進(jìn)硫酸粘桿菌素含量測定方法的介紹［J］.中國獸藥雜志，1990，3：22

［4］張純平，肖希龍.硫酸粘桿菌素微生物檢定法的改進(jìn)［J］.中國獸藥雜志，2002，36(4)：33

［5］楊亞莉,胡昌勤.中國藥典2005年版微生物檢定法的增修訂情況及要點(diǎn)［J］.中國抗生素雜志，2005，30(12)：707

［6］TheEuropeanPharmacopoeiaCommission.TheEuropeanPharmacopoeia［S］.:CouncilofEurope,20