光合作用基因工程

光合作用基因工程第一頁，共九十六頁，編輯于2023年，星期日光合作用

綠色植物或光合細菌借助光的作用將大氣中CO2轉(zhuǎn)化成動植物及人類賴以生存的碳水化合物，同時向周圍環(huán)境釋放O2的過程，也即光合細胞捕獲光能并將其轉(zhuǎn)化為化學能的過程，稱為光合作用。第二頁，共九十六頁，編輯于2023年，星期日CO2+H2O＊光葉綠體（CH2O）+O2＊可用一個簡單的方程式表示：第三頁，共九十六頁，編輯于2023年，星期日光合作用是一個極為錯綜復(fù)雜的過程。從宏觀角度看，它牽涉到細胞、個體乃至群體及外界環(huán)境等方方面面；從微觀角度看，它是核基因組、葉綠體基因組及多種細胞結(jié)構(gòu)協(xié)同作用的結(jié)果。正因為如此，通過光合作用基因工程來提高光合效率并非一朝一夕之事。首要問題之一便是解決與之密切相關(guān)的葉綠體基因工程的各種理論性和技術(shù)性問題。第四頁，共九十六頁，編輯于2023年，星期日光合作用的研究歷史實驗一：

1771年，英國科學家普利斯特利把一支點燃的蠟燭和一只小白鼠分別放到密閉的玻璃罩里，蠟燭不久就熄滅了，小白鼠很快也死去了。他把兩盆植物分別放到兩個密閉的玻璃罩里。他發(fā)現(xiàn)植物能夠長時間地活著，蠟燭沒有熄滅，小鼠活動正常。植物可以在光下凈化“壞了”的空氣光合作用第五頁，共九十六頁，編輯于2023年，星期日1782年，瑞士人有化學分析的方法弄清了光合的反應(yīng)物是CO2和H2O，產(chǎn)物是糖和O2。但認為糖是CO2的簡單聚合：實驗二：實驗三：1905年，Blackman研究光合效率與光強和溫度的關(guān)系時，對光合過程是否一直需要光產(chǎn)生了疑問。也使人們對CO2的同化方式有了全新的認識。n(CO2)CCCC第六頁，共九十六頁，編輯于2023年，星期日1低光時，溫度再高光合效率也不增加。說明光是必須的。2

強光下，溫度升高，光合加快，說明在高光強下，溫度是光合的限制因素，也說明光合作用涉及酶促反應(yīng)（暗反應(yīng)）；3溫度相同時，隨光照增強，光合加快，特別是在低溫時，光照增強，光合加快，說明光合作用中存在與溫度無關(guān)的反應(yīng)，也就是非酶促反應(yīng)。（光反應(yīng)）實驗四：溫度光合效率低光強光光合有兩個反應(yīng)階段：光反應(yīng)和暗反應(yīng)光能吸收CO2同化第七頁，共九十六頁，編輯于2023年，星期日1937年，希爾用體外的葉綠體和水反應(yīng)得到了O2，為光反應(yīng)的研究打開了大門。實驗五：4Fe33++2H2O4Fe22++4H++O2光葉綠體說明葉綠體在光下可分解H2O，產(chǎn)生電子，產(chǎn)生還原能力，使物質(zhì)還原，即光反應(yīng)可產(chǎn)生電子將物質(zhì)還原。第八頁，共九十六頁，編輯于2023年，星期日1951年，發(fā)現(xiàn)體內(nèi)物質(zhì)NADP＋可被光合作用還原為NADPH。實驗六：NADP++H2ONADPH+H++1/2O2光葉綠體

這是一個振奮人心的消息，因為科學家們早已知道，NADPH是生物體內(nèi)的重要的還原劑。第九頁，共九十六頁，編輯于2023年，星期日1954年，發(fā)現(xiàn)ADP在光合作用下可形成ATP。實驗七：ADP+PiATP光葉綠體

在光下葉綠體合成的NADPH和ATP，是用來同化CO2的。第十頁，共九十六頁，編輯于2023年，星期日在植物細胞中,兩種細胞器有自己的遺傳物質(zhì)DNA,分別為葉綠體和線粒體,這兩個細胞器都是植物中用來進行能量轉(zhuǎn)換的細胞器。葉綠體大小和人紅細胞大小相似,因此也是植物細胞器中的“巨人”。為了了解其奧妙所在，首先必須對葉綠體結(jié)構(gòu)及功能有一個大致的認識。

第十一頁，共九十六頁，編輯于2023年，星期日高等植物葉綠體多呈扁平橢球形，主要分布在葉片的柵欄組織和海綿組織中。第十二頁，共九十六頁，編輯于2023年，星期日在高等植物中葉綠體象雙凸或平凸透鏡，長徑5~10um，短徑2~4um，厚2~3um。高等植物的葉肉細胞一般含50～200個葉綠體，可占細胞質(zhì)的40%，葉綠體的數(shù)目因物種細胞類型，生態(tài)環(huán)境，生理狀態(tài)而有所不同。在藻類中葉綠體形狀多樣，有網(wǎng)狀、帶狀、裂片狀和星形等等，而且體積巨大，可達100um。葉綠體由葉綠體外被（chloroplastenvelope）、類囊體（thylakoid）和基質(zhì)（stroma）3部分組成，葉綠體含有3種不同的膜：外膜、內(nèi)膜、類囊體膜和3種彼此分開的腔：膜間隙、基質(zhì)和類囊體腔。一、形態(tài)與結(jié)構(gòu)第十三頁，共九十六頁，編輯于2023年，星期日葉綠體的形態(tài)與分布第十四頁，共九十六頁，編輯于2023年，星期日葉綠體被膜由兩層單位膜組成，兩膜間距5～10nm。被膜上無葉綠素，它的主要功能是控制物質(zhì)的進出，維持光合作用的微環(huán)境。外膜(outermembrane)為非選擇性膜，外層膜含有少量孔蛋白(porin),這些孔蛋白具有較大的通道,分子量小于10000的物質(zhì)如蔗糖、核酸、無機鹽等能自由通過。內(nèi)膜(innermembrane)為選擇透性膜，CO2、O2、H2O可自由通過；Pi、磷酸丙糖、雙羧酸、甘氨酸等需經(jīng)膜上的運轉(zhuǎn)器(translocator)才能通過；蔗糖、C5`C7糖的二磷酸酯、NADP+、PPi等物質(zhì)則不能通過。1.葉綠體被膜(chloroplastenvelope)第十五頁，共九十六頁，編輯于2023年，星期日被膜以內(nèi)的基礎(chǔ)物質(zhì)稱為基質(zhì)(stroma)，基質(zhì)以水為主體，內(nèi)含多種離子、低分子的有機物，以及多種可溶性蛋白質(zhì)等?；|(zhì)是進行碳同化的場所，它含有還原CO2與合成淀粉的全部酶系，其中1，5-二磷酸核酮糖羧化酶/加氧酶(Rubisco)占基質(zhì)總蛋白的一半以上。此外，基質(zhì)中含有氨基酸、蛋白質(zhì)、DNA、RNA、脂類(糖脂、磷脂、硫脂)、四吡咯(葉綠素類、細胞色素類)和萜類(類胡蘿卜素、葉醇)等物質(zhì)及其合成和降解的酶類，還含有還原亞硝酸鹽和硫酸鹽的酶類以及參與這些反應(yīng)的底物與產(chǎn)物，因而在基質(zhì)中能進行多種多樣復(fù)雜的生化反應(yīng)。2.基質(zhì)及內(nèi)含物第十六頁，共九十六頁，編輯于2023年，星期日基質(zhì)中有淀粉粒(starchgrain)與質(zhì)體小球(plastoglobulus)，它們分別是淀粉和脂類的貯藏庫。將照光的葉片研磨成勻漿離心，沉淀在離心管底部的白色顆粒就是葉綠體中的淀粉粒。質(zhì)體小球又稱脂質(zhì)球或親鋨顆粒，在葉片衰老時葉綠體中的膜系統(tǒng)會解體，此時葉綠體中的質(zhì)體小球也隨之增多增大。第十七頁，共九十六頁，編輯于2023年，星期日類囊體(thylakoid)是由單層膜圍起的扁平小囊，膜厚度5～7nm，囊腔(lumen)空間為10nm左右，片層伸展的方向為葉綠體的長軸方向。類囊體分為二類：一類是基質(zhì)類囊體(stromathylakoid),又稱基質(zhì)片層(stromalamella)，伸展在基質(zhì)中彼此不重疊；另一類是基粒類囊體(granathlylakoid)，或稱基粒片層(granalamella)，可自身或與基質(zhì)類囊體重疊(granum)。片層與片層互相接觸的部分稱為堆疊區(qū)(appessedregion)，其他部位則為非堆疊區(qū)(nonappessedregion)。3.類囊體第十八頁，共九十六頁，編輯于2023年，星期日葉綠體基因的基本結(jié)構(gòu)

葉綠體DNA是由細菌內(nèi)共生體的基因組演化而來的,是小的、雙鏈環(huán)狀DNA分子,通常以多拷貝形式存在。葉綠體DNA的一個顯著特點就是不含有5甲基胞嘧啶,用這個特點可以大致檢測葉綠體DNA的純度。葉綠體DNA結(jié)構(gòu)上大致可分為4個區(qū),分別為大單拷貝區(qū)(largesingle-copyregion)、小單拷貝區(qū)(single-copyregion)和兩個等同的反向重復(fù)區(qū)(IRA、IRB)。

第十九頁，共九十六頁，編輯于2023年，星期日葉綠體基因組結(jié)構(gòu)第二十頁，共九十六頁，編輯于2023年，星期日Abdallahetal.(2000)TrendsPlantSci.5141-142.第二十一頁，共九十六頁，編輯于2023年，星期日有一些植物如蠶豆、豌豆、苜蓿和松樹中沒有反向重復(fù)區(qū),而纖細裸藻中含有3個拷貝的同向重復(fù)DNA片段。從這個特點上,可將葉綠體基因組分為三類:一類是缺少重復(fù)序列的葉綠體基因組,二類是具有反向重復(fù)序列的葉綠體基因組,三類是具有同向重復(fù)序列的葉綠體基因組。第二十二頁，共九十六頁，編輯于2023年，星期日葉綠體基因組-cpDNA葉綠體基因組在很多方面與線粒體基因組的結(jié)構(gòu)是相似的。葉綠體DNA（cpDNA）是雙鏈環(huán)狀，缺乏組蛋白和超螺旋。cpDNA中的GC含量與核DNA及mtDNA有很大的不同。因此可用CsCl密度梯度離心來分離cpDNA第二十三頁，共九十六頁，編輯于2023年，星期日葉綠體基因組DNA分子大小在120kb到217kb之間，相當于噬菌體基因組的大小，例如，T4噬菌體的基因組約165kb。一個葉綠體中通常有一個到幾十個葉綠體基因組。葉綠體DNA不含5／—甲基胞嘧啶，這是鑒定ctDNA及其純度的特定指標。

第二十四頁，共九十六頁，編輯于2023年，星期日每個葉綠體中cpDNA的拷貝數(shù)隨著物種的不同而不同。但都是多拷貝的。這些拷貝位于類核區(qū)。例如甜菜的葉細胞中每個類核體有4~8個拷貝的cpDNA，而每個葉綠體有4~18個類核體，每個細胞中約有40個葉綠體。每個細胞總共有約6000cpDNA分子。在衣藻中（chlamydomonas）（單細胞生物）在細胞中一個葉綠體含有500~1500cpDNA分子。

第二十五頁，共九十六頁，編輯于2023年，星期日

煙草和水稻（Oryzasativa）葉綠體全序列分析表明cpDNA基因組成有以下特點：

1.基因組由兩個反向重復(fù)序列（IR）和一個短單拷貝序列（shortsinglecopyseguence,SSC）及一個長單拷貝序列（longsinglecopyseguence,LSC）組成；

2.IRA和IRB長各10-24Kb，編碼相同，方向相反。

3.cpDNA啟動子和原核生物的相似，有的基因產(chǎn)生單順反子的mRNA，有的為多順反子mRNA；

第二十六頁，共九十六頁，編輯于2023年，星期日4.盡管cpDNA大小各不相同，但基因組成是相似的，而且所有基因的數(shù)目幾乎是相同的，它們大部分產(chǎn)物是類囊體的成分或和氧化還原反應(yīng)有關(guān)；

5.其tRNA基因（IRA、IRB上各有7個，LSC上有23個，共37個）中有內(nèi)合子存在，最長者達2526bp，此和原核tRNA不同。有的內(nèi)合子位于D環(huán)上，此和原核tRNA不同。有的內(nèi)含子位于D環(huán)上，此和真核生物核tRNA內(nèi)含子常位于反密碼子環(huán)上也不相同；

6.所有葉綠體基因轉(zhuǎn)錄的mRNA都由葉綠體核糖體翻譯。

第二十七頁，共九十六頁，編輯于2023年，星期日并不是所有的葉綠體都含有IR，IR上含有4種rRNA基因，根據(jù)它們排列的情況葉綠體可分為3類：I類是IR序列，4種rRNA各有2個拷貝，對稱分布在IR上cpDNA也較大，如玉米、煙草、水稻、菠菜、地錢、衣藻（C.Yreinhardi），大部分葉綠體都屬此類。II類：無反向重復(fù)IR，而在cpDNA一側(cè)16S，23S以正向串聯(lián)重復(fù)的形式（各3個拷貝）排列。如少數(shù)低等植物，裸藻（Euglenagracilis）；III類：無IR和DR，rRNA只有一拷貝，如豌豆（Posumsatirum）等。這可能在進化的過程中DNA片段的重復(fù)和倒位而造成的。

第二十八頁，共九十六頁，編輯于2023年，星期日在煙草葉綠體已發(fā)現(xiàn)的基因中,除了4個rRNA基因即16s、23S、4.5S和5SrRNA基因外,還包括20個左右葉綠體核糖體蛋白基因,葉綠體RNA聚合酶亞基基因、參與光合系統(tǒng)I和光合系統(tǒng)Ⅱ反應(yīng)的基因、ATP合成酶的亞基基因、電子傳遞鏈上酶功能復(fù)合體的基因、Rubisco蛋白兩個亞基中的一個亞基基因和30個tRNA基因等。另外,從葉綠體DNA順序上看還有26~34個功能未知的基因。葉綠體基因的分子結(jié)構(gòu)特點第二十九頁，共九十六頁，編輯于2023年，星期日

葉綠體中的有些基因具有內(nèi)含子,帶有真核基因的顯著特點。葉綠體基因組的內(nèi)含子根據(jù)它的剪接邊界序列和二級結(jié)構(gòu)可分為I型、Ⅱ型、III型和Ⅳ型四種,I型和Ⅱ型內(nèi)含子與核基因組和真菌線粒體的I型和Ⅱ型內(nèi)含子二級結(jié)構(gòu)相似,IⅡ型內(nèi)含子邊界保守序列為GTGYGRY(5′端)和RYCNAYY(Y)YNAY(3′端),該類內(nèi)含子的二級結(jié)構(gòu)類似于Ⅱ型內(nèi)含子,IV型內(nèi)含子由于大小相似(95~109bp)而被單獨列為一類。高等植物葉綠體基因內(nèi)含子許多是Ⅱ型內(nèi)含子,葉綠體的內(nèi)含子主要存在于編碼蛋白的基因和tRNA基因上。第三十頁，共九十六頁，編輯于2023年，星期日

葉綠體DNA大約含有60到200個基因,從功能上說,葉綠體基因大致可分為3大類：第一類是葉綠體遺傳系統(tǒng)相關(guān)基因,如編碼rRNA、tRNA、核糖體蛋白、起始因子等基因;第二類是與光合作用相關(guān)基因;第三類是與氨基酸、脂類、電子傳遞功能和色素生物合成有關(guān)基因。第三十一頁，共九十六頁，編輯于2023年，星期日rrn基因

葉綠體的rrn基因即核糖體RNA(即rRNA)基因,高等植物rRNA基因主要編碼16S、23S、4.5s和5SrRNA。葉綠體核糖體的沉降系數(shù)大約是70S,其中50S亞基主要包括23S、4.5S和5SrRNA,30S亞基僅包括16SrRNA第三十二頁，共九十六頁，編輯于2023年，星期日在綠藻和衣藻中沒有4.5SrRNA,卻存在另外兩種獨特的rRNA即3S和7SrRNA。許多核糖體RNA基因與大腸桿菌同源,如玉米、煙草與大腸桿菌的16Srrn基因同源性都達到74%,煙草、玉米與大腸桿菌的23Srrn基因同源性分別達到69%和71%,它們之間較高的同源性有助于研究進化的分子機制。第三十三頁，共九十六頁，編輯于2023年，星期日

玉米的rrn基因位于IR區(qū),所以每個基因有兩個拷貝,而有些沒有IR序列的植物如蠶豆等只有一個拷貝的rrn基因。許多高等植物rrn基因之間存在明顯的間隔區(qū),例如玉米的葉綠體rrn基因的結(jié)構(gòu)是16Srrn(1490bp)間隔區(qū)(2100bp)-23srrn(2890bp)-4.5Srrn(95bp)-間隔區(qū)(231bp)-5Srrn(122bp),一些tRNA基因分布在這個基因簇的間隔區(qū)中,如玉米的trnI和trnA基因就存在于16S和23Srrn基因的間隔區(qū)。第三十四頁，共九十六頁，編輯于2023年，星期日trn基因葉綠體trn基因指的是轉(zhuǎn)錄成tRNA的基因。葉綠體大約有20-40個trn基因，煙草中有30個trn基因，和煙草相比，地錢中有一個煙草中沒有的trn基因，該基因轉(zhuǎn)錄為tRNAArg(CCG），葉綠體申蛋白質(zhì)合成所需要的tRNA都由葉綠體基因組編碼。葉綠體trn基因編碼的tRNA都沒有3′CCA端。葉綠體trn基因比較集中在IR區(qū)。一些trn基因具有內(nèi)含子,如玉米葉綠體中trnG-UCC基因在D環(huán)區(qū)內(nèi)有一個內(nèi)含子,這是葉綠體所特有的tRNA基因結(jié)構(gòu)特征。第三十五頁，共九十六頁，編輯于2023年，星期日

葉綠體23Srrn基因存在的保守區(qū)編碼它的功能區(qū),即核糖體蛋白的結(jié)合部位和30s-50S核糖體亞基相互作用的部位。4.5SrRNA與原核生物的23S亞基的3′端同源。從進化上說,4.5Srrn基因可能來源于23rRNA的3′端。而高等植物的5Srrn基因高度保守。第三十六頁，共九十六頁，編輯于2023年，星期日

trn基因葉綠體trn基因指的是轉(zhuǎn)錄成tRNA的基因。葉綠體大約有20~40個trn基因,煙草中有30個trn基因,和煙草相比,地錢中有一個煙草中沒有的trn基因,該基因轉(zhuǎn)錄為TrnaArg(CCG),葉綠體中蛋白質(zhì)合成所需要的tRNA都由葉綠體基因組編碼。葉綠體trn基因編碼的tRNA都沒有3′-CCA端。葉綠體trn基因比較集中在IR區(qū)。第三十七頁，共九十六頁，編輯于2023年，星期日

在陸地植物上,trn基因分散在整個葉綠體基因組上-在裸藻中大多數(shù)trn基因成簇存在。裸藻葉綠體基因組中在16Strn基因前導序列上存在一個tRNAIle假基因,這是首先在葉綠體基因組中發(fā)現(xiàn)的假基因。在單子葉植物中至少有5個假基因存在,這些假基因位于反向重復(fù)序列附近。第三十八頁，共九十六頁，編輯于2023年，星期日如果完全按照密碼子的擺動學說,現(xiàn)在植物中的tRNA還不夠識別所有的密碼子,研究者提出”三中讀二”(two-out亠0fthree)的假說,即當密碼子與反密碼子相互作用時,密碼子前兩個堿基被反密碼子配對就足以識別該密碼子,而第三個堿基只起一種隔開的作用，從而防止移碼錯讀,該假說初步在體外試驗中得到證實。第三十九頁，共九十六頁，編輯于2023年，星期日核糖體蛋白質(zhì)基因的分子結(jié)構(gòu)

葉綠體中約有60種不同的核糖體蛋白,但是只有約1/3的蛋白由葉綠體基因所編碼。葉綠體核糖體蛋白基因與大腸桿菌該類基因的同源性要低于rrn基因,分析一些核糖體蛋白基因的組成,大約與大腸桿菌的同源性在50%左右。其中,葉綠體rps23操縱子的順反子排列和大腸桿菌的S10、spc和a操縱子中的同源順反子相似,也說明葉綠體和大腸桿菌基因組可能起源于同一套祖先基因組。第四十頁，共九十六頁，編輯于2023年，星期日但是,葉綠體中有些核糖體蛋白和任何細菌的核糖體蛋白都沒有相似性,也展示了葉綠體核糖體蛋白獨特的一面。核糖體蛋白質(zhì)基因中也發(fā)現(xiàn)有內(nèi)含子的存在,如高等植物葉綠體中的核糖體蛋白基因rps16和rpl16各含有一個內(nèi)含子。第四十一頁，共九十六頁，編輯于2023年，星期日其他蛋白質(zhì)基因的分子結(jié)構(gòu)

現(xiàn)在,已經(jīng)有很多編碼蛋白質(zhì)的基因在葉綠體中被分離出來,如光合作用相關(guān)基因Rubisco大亞基rbcl基因、光合系統(tǒng)I和Ⅱ基因、細胞色素b/f復(fù)合體基因(pet或psb)、翻譯因子基因、NADH脫氫酶基因(ndh)、ATP合成酶亞基(atp)基因等。這些基因都是由葉綠體基因編碼的,有的含有內(nèi)含子。擬南芥葉綠體基因組可以編碼79種蛋白質(zhì)。第四十二頁，共九十六頁，編輯于2023年，星期日通過對葉綠體基因的分析表明葉綠體基因與細菌基因具有很大的相似性,主要表現(xiàn)在以下幾點,一是啟動子序列中有類似細菌基困的―10區(qū)和―35區(qū)的結(jié)構(gòu),但位置可能有所差異;二是轉(zhuǎn)錄終止序列的轉(zhuǎn)錄終止位點存在互補序列,可形成與細菌類似的轉(zhuǎn)錄終止莖環(huán)結(jié)構(gòu);三是轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物中含有類似細菌的SD序列,與翻譯起始有關(guān);四是有些相鄰基因之間共轉(zhuǎn)錄形成順反子(cistron),所以翻譯起始和終止密碼子有時重疊;五是葉綠體蛋白質(zhì)翻譯起始的氨基酸為甲酰蛋氨酸,這點與細菌相同;第四十三頁，共九十六頁，編輯于2023年，星期日

六是葉綠體中一些基因與細菌基因同源性較高,如RNA聚合酶α、β亞基的基因與大腸桿菌的核心酶基因同源,但是編碼β亞基的基因含有一個內(nèi)含子。葉綠體基因有一些也與原核基因不同的特征,具有自己的獨特性,如:16s-23s基因之間存在較大的間隔區(qū),tRNA基因不編碼3-CCA末端,有些基因具有內(nèi)含子等。第四十四頁，共九十六頁，編輯于2023年，星期日葉綠體DNA具有獨立進行復(fù)制、轉(zhuǎn)錄和翻譯的功能，因而是高等植物中遺傳信息的三種載體之一。它編碼了葉綠體本身使用的全部rRNA和tRNA，以及近90種多肽。不過，葉綠體和線粒體一樣，只是半自主性的遺傳體系，其絕大多數(shù)蛋白復(fù)合體是由核基因組和葉綠體基因組共同編碼的；第四十五頁，共九十六頁，編輯于2023年，星期日隨著分子遺傳學和分子生物學等實驗方法和技術(shù)的發(fā)展，葉綠體生物學的研究也進入了一個嶄新的階段。目前，已經(jīng)有109種植物完成了葉綠體基因組測序(截至2009年4月1日)，主要包括煙草、番茄、馬鈴薯、菠菜、擬南芥、小麥、玉米、水稻、高粱、大豆、棉花、胡蘿卜、葡萄、楊樹等等。目前已完成葉綠體基因組測序的植物第四十六頁，共九十六頁，編輯于2023年，星期日葉綠體基因組的一個有趣特征是，其參與光合作用的基因以若干小簇排列一起。這種結(jié)構(gòu)從地錢到高等植物都趨于一致，即為保守的。這些基因簇不僅代表了光誘導基因表達的轉(zhuǎn)錄單位，而且也是調(diào)控單位。第四十七頁，共九十六頁，編輯于2023年，星期日葉綠體轉(zhuǎn)錄水平的調(diào)節(jié)NEP和PEP相互關(guān)系及協(xié)同調(diào)控基因表達葉綠體DNA構(gòu)型的改變

葉綠體DNA的甲基化第四十八頁，共九十六頁，編輯于2023年，星期日葉綠體基因由兩種RNA聚合酶催化轉(zhuǎn)錄，一種RNA聚合酶由葉綠體基因組編碼，稱為PEP聚合酶；另一種RNA聚合酶由核基因編碼，稱為NEP聚合酶；PEP聚合酶與細菌中的RNA聚合酶很相似，具有原核生物的特性。含有核心酶α、β和β’亞基，并由核基因編碼的σ因子，識別原核型啟動子，NEP聚合酶與T3/T7噬菌體RNA聚合酶相似。第四十九頁，共九十六頁，編輯于2023年，星期日大多數(shù)情況下，PEP聚合酶主要負責與光合作用有關(guān)的基因的轉(zhuǎn)錄，如psbA,psbD

和rbcL，而NEP主要轉(zhuǎn)錄那些葉綠體轉(zhuǎn)錄和翻譯的功能元件，如rpoA和rpoB，而那些看家基因常常既具有PEP啟動子，又具有NEP啟動子，他們被PEP和NEP共同轉(zhuǎn)錄，如clP等。NEP由核基因編碼，并轉(zhuǎn)運到質(zhì)體（plastid）和線粒體（mitochondrion）中發(fā)揮作用。定位到質(zhì)體中的NEP負責轉(zhuǎn)錄編碼PEP中心亞基的基因。第五十頁，共九十六頁，編輯于2023年，星期日葉綠體的發(fā)育過程由葉片根部到葉片頂部。隨著葉綠體的發(fā)育，NEP控制的轉(zhuǎn)錄本可能RNA的穩(wěn)定性（RNAstability）逐漸降低，轉(zhuǎn)錄活性逐步提高，從而NEP控制的轉(zhuǎn)錄本的積累幾乎沒有改變；而PEP控制的轉(zhuǎn)錄本RNA的穩(wěn)定性不變或者增強，轉(zhuǎn)錄活性提高，從而PEP控制的轉(zhuǎn)錄本的表達量增加。葉綠體基因組還可以通過葉綠體DNA構(gòu)型的改變和葉綠體DNA的甲基化在轉(zhuǎn)錄水平上進行調(diào)控。第五十一頁，共九十六頁，編輯于2023年，星期日葉綠體基因的轉(zhuǎn)錄后加工

葉綠體mRNA的剪切葉綠體RNA的編輯

葉綠體mRNA的穩(wěn)定I，II，III類內(nèi)含子剪切機制

第五十二頁，共九十六頁，編輯于2023年，星期日mRNA的穩(wěn)定性可以調(diào)節(jié)基因的轉(zhuǎn)錄水平。如果mRNA穩(wěn)定,存在時間長,就會由于積累效應(yīng)從而提高基因的轉(zhuǎn)錄?，F(xiàn)在已經(jīng)發(fā)現(xiàn)許多葉綠體的基因mRNA穩(wěn)定性與其3′端非翻澤區(qū)的短反向重復(fù)序列(IR)有關(guān),如果去除這些IR序列,mRNA就會降解。葉綠體基因組的轉(zhuǎn)錄后調(diào)控，主要分為葉綠體mRNA的剪切，葉綠體mRNA的編輯，葉綠體mRNA的穩(wěn)定。第五十三頁，共九十六頁，編輯于2023年，星期日PDM1蛋白的PPR結(jié)構(gòu)域模型第五十四頁，共九十六頁，編輯于2023年，星期日PPR蛋白（PPRRepeat）和RNA形成復(fù)合物，但需要一個催化因子或催化座位（catalyticcofactorordomain）來實現(xiàn)對RNA的加工。第五十五頁，共九十六頁，編輯于2023年，星期日Pdm1-1和pdm1-2呈白化表型Pdm1-1生長量遠小于野生型植株P(guān)dm1突變體的生理生化特征第五十六頁，共九十六頁，編輯于2023年，星期日對幾種光誘導表達的基因的表達調(diào)控機理關(guān)于光對葉綠體基因轉(zhuǎn)錄過程的調(diào)控，目前研究得最多的是rbcL和psbA兩種基因。人們相繼在芥菜、豌豆、綠豆、煙草和菠菜等材料中發(fā)現(xiàn)，它們的轉(zhuǎn)錄水平因光誘導而明顯上升。個中機理十分復(fù)雜，目前在此方面的認識還相當貧乏，只大致知道：植物對于光刺激的效應(yīng)有多種類型，并與光質(zhì)和光量有關(guān)：光誘導的光基因轉(zhuǎn)錄水平的提高，是由光受體介導的。在已知的三種光受體中，對介導紅光的光敏色素性質(zhì)相對明了，其余兩種分別介導藍光和紫光的隱性色素和UV-B，尚知之甚少。至于感受光調(diào)控的DNA元件，則至少包括基因5′末端上游的啟動子區(qū)域。第五十七頁，共九十六頁，編輯于2023年，星期日光合作用基因工程的主要目標

長久以來，人類一直在想方設(shè)法提高作物的生產(chǎn)力，而提高作物光合效率便是實現(xiàn)這一目標的主要措施之一。然而，植物利用太陽能的效率相當?shù)?，通常不?％。即便是我國南方畝產(chǎn)高達1500千克的水稻，對光能的利用率也只近乎4％。若能在原有基礎(chǔ)上將作物光能利用率提高1—2％，農(nóng)作物產(chǎn)量將成倍增長。因此，許多科學工作者都把進一步提高糧食作物產(chǎn)量的希望寄托在提高光合效率的途徑上。特別是如何設(shè)法提高占全世界糧食總產(chǎn)量50％左右的水稻、小麥、玉米、高粱等8種重要糧食作物的光合效率，已成為植物基因工程研究中活躍紛繁的領(lǐng)域之一。第五十八頁，共九十六頁，編輯于2023年，星期日提高作物光合效率，一方面是通過遺傳改良提高作物自身的光合能力，即提高光合強度（通常以每小時每平方分米葉面積吸收的CO2毫克數(shù)表示，它一般已減去了光呼吸作用所釋放的CO2量）；另一方面則是通過合理的栽培管理（如提高復(fù)種指數(shù)、合理密植、適當延長生育期等）以提高光能利用率。對于前者，除通過改良植株形態(tài)結(jié)構(gòu)（株型），在確保不破壞群體內(nèi)生態(tài)環(huán)境前提下適當增大光合面積外，重點寄希望于提高植株機體內(nèi)部碳固定的效率及光能的吸收和轉(zhuǎn)化效率?；趯夂献饔脵C理的透徹了解，目前光合作用基因工程的主要目標有兩方面。第五十九頁，共九十六頁，編輯于2023年，星期日1，5-二磷酸核酮糖羧化酶在光合作用中無可替代的作用，決定了它勢必成為旨在提高作物光合效率的基因工程之主攻目標。因此，深入了解1，5-二磷酸核酮糖羧化酶的一些分子生物學特性無疑是必要的。第六十頁，共九十六頁，編輯于2023年，星期日1．1，5-二磷酸核酮糖羧化酶1．5-二磷酸核酮糖羧化酶除了具有上述催化活性之外，其本身還是一種量豐質(zhì)優(yōu)的蛋白質(zhì)。盡管1，5-二磷酸核酮糖羧化酶只存在于葉綠體中，但它占植物葉子中可溶性蛋白的一半以上，并因此被認為是地球上含量最豐富的蛋白質(zhì)。并且，它是植物體內(nèi)一種重要的貯存蛋白。有關(guān)學者研究了大豆籽粒在蛋白質(zhì)合成過程中其氮的來源，發(fā)現(xiàn)其50％是從儲存于葉片中的1．5-二磷酸核酮糖羧化酶降解轉(zhuǎn)移而來的。就蛋白質(zhì)質(zhì)量而言，1，5-二磷酸核酮糖羧化酶含有豐富的必需氨基酸，因而不失為一種具有潛在開發(fā)價值的優(yōu)質(zhì)蛋白。第六十一頁，共九十六頁，編輯于2023年，星期日高等植物的1，5-二磷酸核酮糖羧化酶是非常大的酶，大多數(shù)真核和原核1，5-二磷酸核酮糖羧化酶的分子量為560KD，由8個小亞基（rbcS，12—18KD）和8個大亞基（rbcL，52—60KD）組成。rbcS是由核基因編碼，rbcL則是由葉綠體基因編碼的，其結(jié)構(gòu)見圖10-5。大亞基一般由475個氨基酸組成。各種生物來源的大亞基氨基酸序列除了煙草和大麥是直接由蛋白質(zhì)測定氨基酸序列外，其余均是從相應(yīng)基因的核苷酸序列推測所得。不同生物來源的大亞基之間同源性達80％以上。（1）1，5-二磷酸核酮糖羧化酶的基本結(jié)構(gòu)第六十二頁，共九十六頁，編輯于2023年，星期日例如，玉米和菠菜的大亞基核苷酸序列同源性為84％，而相應(yīng)的氨基酸序列同源性卻達97％。小亞基由123個（小麥為128個）氨基酸組成，不同植物來源的小亞基氨基酸序列已測定，它們之間的同源性要比大亞基之間的同源性相對低得多。也就是說，小亞基之間有明顯的種間差別，而大亞基之間無種的差別。第六十三頁，共九十六頁，編輯于2023年，星期日1，5-二磷酸核酮糖羧化酶的活性部位由大亞基負責RuDP羧化作用：第一，1，5-二磷酸核酮糖羧化酶可被誘導分離成亞基，且這些亞基還能重新結(jié)合成原來的酶。如果該酶以大亞基的八聚體形式存在而完全不含小亞基，它仍保留部分羧化酶的活性（比活約20％）；第二，在某些細菌（深紅紅螺菌、中間硫桿菌）中，這種酶僅含有大亞基，其活性并不依賴于小亞基的存在；第三，分別制備了從菠菜1，5-二磷酸核酮糖羧化酶中純化的大亞基的抗血清。加入對大亞基特異的抗血清，就會抑制全酶的羧化酶活性；反之，加入對小亞基特異的抗血清卻無影響；第六十四頁，共九十六頁，編輯于2023年，星期日第四，菠菜和色素菌的1，5-二磷酸核酮糖羧化酶功能所必需的某些—SH基團和賴氨酸殘基都在大亞基上；第五，由于對1，5-二磷酸核酮糖羧化酶的羧化酶活性的選擇壓力極大，含有活性部位的亞基在進化方式上要比另一種亞基保守得多。對大范圍被子植物研究的結(jié)果揭示，大亞基中含有40個氨基酸的N-末端序列的改變遠比小亞基少得多。從而間接證明了1，5-二磷酸核酮糖羧化酶行使催化功能的活性部位在大亞基上，并有人推測羧化作用和加氧作用是在大亞基的同一部位進行的。第六十五頁，共九十六頁，編輯于2023年，星期日小亞基之間盡管有明顯的種間差別，但其氨基酸序列中也有一些區(qū)域具有較高的同源性，這暗示在這些部位可能也有某種功能。不過，小亞基的實際功能至今仍不明了。也許它起著某種穩(wěn)定作用，導致大亞基的構(gòu)象變化，或者由于小亞基的存在，促使1，5-二磷酸核酮糖羧化酶更為有效地分辨對O2和CO2的反應(yīng)。第六十六頁，共九十六頁，編輯于2023年，星期日1，5-二磷酸核酮糖羧化酶的活性表達

有實驗表明，小亞基的存在是維持該酶的活性所必不可少的。但僅有大、小亞基還不夠，在大、小亞基組裝為有活性的全酶過程中需要有第三種蛋白質(zhì)的幫助，即亞基結(jié)合蛋白。另外，酶的活化也受到許多因素的影響，光便是其中之一。實驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)，苜蓿葉子粗提液中1，5-二磷酸核酮糖羧化酶的初活性隨光強增加而增加，并和光合作用強度的增加相伴隨，煙草光下生長的葉子的1，5-二磷酸核酮糖羧化酶初活性比黑暗處理的葉子約高1倍。不過，這種有可能被光照解除的暗抑制作用，并非普遍存在于所有植物中。大豆、煙草、馬鈴薯及扁豆中存在這種現(xiàn)象，而在玉米、小麥、菠菜等作物中卻未發(fā)現(xiàn)。第六十七頁，共九十六頁，編輯于2023年，星期日1，5-二磷酸核酮糖羧化酶基因及其表達每個葉綠體DNA分子中，大亞基以單拷貝形式存在。由于每個葉綠體有10—200個DNA分子，每個細胞又有10—200個葉綠體，因而每個細胞可能存在幾千個拷貝的大亞基基因。如今，玉米、大麥、煙草、菠菜等植物及某些藍細菌的大亞基已被克隆并進行了序列分析，而對更多的物種來說，已獲得其全部或部分的氨基酸序列。到目前為止，所有已被測序的高等植物rbcL基因都是連續(xù)的，即無內(nèi)含子，長約1.4kb。rbcS卻不同，它由核基因組中的多基因家族編碼。大豆的rbcS多基因族至少有10個成員，豌豆中5個，番茄中也有5個，矮牽牛中8個，浮萍中13個。另外，rbcS基因中常有內(nèi)含子存在。rbcL和rbcS基因的表達均受光的促進及發(fā)育過程的調(diào)節(jié)。也就是說，光能誘導它們進行表達；植株在生長發(fā)育的不同階段，它們表達與否以及表達效率高低都有所差別。第六十八頁，共九十六頁，編輯于2023年，星期日高等植物中rbcL基因和rbcS基因之所以令學者們興趣盎然，原因在于：其一對rbcL和rbcL基因表達特征（包括光的調(diào)控）的研究具有普遍意義。因為rbcL的表達對葉綠體基因的表達有代表性，rbcS基因族的表達對核基因尤其是多基因家族的表達有代表性；其二，由于rbcL和rbcS分別由葉綠體基因組和核基因組編碼，并且兩者以相同的分子數(shù)共同組配成1，5-二磷酸核酮糖羧化酶，因此，這是一個了解核和葉綠體如何協(xié)同表達某一基因的完美模型。第六十九頁，共九十六頁，編輯于2023年，星期日基于上述對1，5-二磷酸核酮糖羧化酶的了解，通過基因工程技術(shù)改變1，5-二磷酸核酮糖羧化酶羧化作用和加氧作用的相對比率，主要從以下幾個方面進行嘗試：第七十頁，共九十六頁，編輯于2023年，星期日（1）通過交換1，5-二磷酸核酮糖羧化酶亞基的基因，將不同來源的基因通過優(yōu)化組合導入同一種植物，形成具有異源亞基的1，5-二磷酸核酮糖羧化酶。（2）采用定點突變技術(shù)，改變1，5-二磷酸核酮糖羧化酶的活性，增加其同CO2的親和力。（3）用更為有效的突變基因，取代正常的1，5-二磷酸核酮糖羧化酶基因。（4）增加1，5-二磷酸核酮糖羧化酶大亞基拷貝數(shù)或提高轉(zhuǎn)錄效率，從而增加RuDP羧化酶的量。第七十一頁，共九十六頁，編輯于2023年，星期日在植物的光合作用中，光能的吸收、傳遞和轉(zhuǎn)化等過程，幾乎都是在鑲嵌于葉綠體類囊體膜上的反應(yīng)中心色素蛋白復(fù)合體的有關(guān)電子傳遞鏈中進行的，即由PSⅠ和PSⅡ協(xié)同完成。每一光系統(tǒng)都各有獨特的色素蛋白復(fù)合物及另一些物質(zhì)。PSⅠ的顆粒較小，在類囊體膜的外側(cè)，其葉綠素a與葉綠素b比值高；PSⅡ顆粒較大，在類囊體膜外側(cè)，其葉綠素b含量相對較高。2．類囊體膜上的蛋白復(fù)合體第七十二頁，共九十六頁，編輯于2023年，星期日類囊體膜上含有由多種亞基、多種成分組成的蛋白復(fù)合體，主要有四類，即光系統(tǒng)Ⅰ（PSI）、光系統(tǒng)Ⅱ（PSⅡ）、Cytb6/f復(fù)合體和ATP酶復(fù)合體（ATPase），它們參與了光能吸收、傳遞與轉(zhuǎn)化、電子傳遞、H+輸送以及ATP合成等反應(yīng)。由于光合作用的光反應(yīng)是在類囊體膜上進行的，所以稱類囊體膜為光合膜第七十三頁，共九十六頁，編輯于2023年，星期日類囊體膜上的蛋白復(fù)合體及電子傳遞示意圖第七十四頁，共九十六頁，編輯于2023年，星期日這四類蛋白復(fù)合體在類囊體膜上的分布大致是：PSⅡ主要存在于基粒片層的堆疊區(qū)，PSⅠ與ATPase存在于基質(zhì)片層與基粒片層的非堆疊區(qū)，Cytb6/f復(fù)合體分布較均勻。PSⅡ中放氧復(fù)合體(oxygen-evolvingcomplex,OEC)在膜的內(nèi)表面，PSⅡ的原初供體位于膜內(nèi)側(cè)，原初受體靠近膜外側(cè)。質(zhì)體醌(plastoquinone,PQ)可以在膜的疏水區(qū)內(nèi)移動。Cytb6/f復(fù)合體在膜的疏水區(qū)。PSⅠ的電子供體PC在膜的內(nèi)腔側(cè)，而PSⅠ還原端的Fd、FNR在膜的外側(cè)。蛋白復(fù)合體及其亞基的這種分布，有利于電子傳遞、H+的轉(zhuǎn)移和ATP合成。第七十五頁，共九十六頁，編輯于2023年，星期日PsbRD1D2ZTyrQAQB25-28kDaLHCIIChla/bCP29CP26CP24CP43CP47PsbHPsbKPsbCPsbBPsbDPsbAChlP680DTyrPheophytinMnMnMnMnPsbOPsbPPsb

QPsbFPsbEcytb559Psb

LPsbIPsbSPsbNPsbMPPPPPPPSTROMATHYLAKOID

LUMENOrganizationofphotosystemIIsubunits第七十六頁，共九十六頁，編輯于2023年，星期日OrganizationofphotosystemIsubunitsPSI-OPSI-GPSI-BPSI-OPSI-LPSI-JPSI-HPSI-IPSI-KPSI-FPSI-ALhca3Lhca2/3Lhca4Lhca1Lhca2Lhca2/3Lhca4Lhca15nmSTROMALAMELLASTROMATHYLAKOIDLUMENPSI-NPcFNRPSI-EPSI-CPSI-DFDA0A1P700FxFBFA第七十七頁，共九十六頁，編輯于2023年，星期日在各種植物中已確定了41個編碼光合固碳和電子傳遞裝置組分的基因

包括rbcL、PSⅠ的5個亞基（psa基因）、PSⅡ的14個亞基（psb基因）、H+-ATP合成酶的6個亞基（atp基因）、細胞色素b/f復(fù)合物的5個亞基（pet基因）以及NADH脫氫酶的10個亞基（ndh基因）第七十八頁，共九十六頁，編輯于2023年，星期日在擬南芥葉綠體中存在五類蛋白酶：第七十九頁，共九十六頁，編輯于2023年，星期日FtsH蛋白酶

功能：特異性的降解未組裝的和發(fā)生錯誤折疊的蛋白從而對蛋白進行質(zhì)量控制。第八十頁，共九十六頁，編輯于2023年，星期日DegP蛋白酶

第八十一頁，共九十六頁，編輯于2023年，星期日擬南芥中的Deg蛋白酶Deg1Deg5Deg8Deg2葉綠體囊腔側(cè)葉綠體的蛋白酶葉綠體基質(zhì)側(cè)降解光破壞的D1蛋白參與PSII的修復(fù)與D2相互作用參與光系統(tǒng)組裝體外降解光破壞的D1蛋白依賴于GTP的蛋白酶Deg7降解損傷的光系統(tǒng)蛋白D1、D2、CP47、CP43與Deg5、Deg8協(xié)同作用參與PSII的修復(fù)循環(huán)形成復(fù)合物，降解光破壞的D1蛋白，從而參與PSII的循環(huán)修復(fù)與類囊體膜結(jié)合第八十二頁，共九十六頁，編輯于2023年，星期日Lon蛋白酶分布：原核生物與真核生物的絲氨酸蛋白酶功能：控制蛋白的命運；控制基因的表達；蛋白酶功能、分子伴侶功能。Lon1蛋白酶參與萌發(fā)后的生長調(diào)控以及具有調(diào)節(jié)線粒體的穩(wěn)定性的功能。第八十三頁，共九十六頁，編輯于2023年，星期日葉綠體基因組轉(zhuǎn)化的原理葉綠體基因組轉(zhuǎn)化技術(shù)之所以能夠?qū)崿F(xiàn)，主要是基于以下原理和方法:(1)利用了同源重組(homulogousrecombination)機制，將外源基因定點整合到葉綠體基因組。在構(gòu)建葉綠體表達載體時，一般都在外源基因的兩側(cè)各連接一段葉綠體的DNA序列，這兩個片段稱為同源重組片段或定位片段(targetingfragment)。當載體導入葉綠體后，通過這兩個片段與葉綠體基因組上的同源片段發(fā)生重組，外源基因就可以整合到葉綠體基因組的特定位點。第八十四頁，共九十六頁，編輯于2023年，星期日(2)采用篩選標記基因?qū)崿F(xiàn)葉綠體基因組的同質(zhì)化(homoplasmy)。由于葉綠體基因組通常以高拷貝數(shù)存在，一般每個細胞有成千上萬個葉綠體基因組，因而同時轉(zhuǎn)化這么多基因組幾乎是不可能的，極易出現(xiàn)轉(zhuǎn)化的和未轉(zhuǎn)化的葉綠體組成的異質(zhì)體(heteroplasmy)，無法保證獲得的性狀穩(wěn)定遺傳下去。因此葉綠體基因組轉(zhuǎn)化所面臨的一個關(guān)鍵問題就是去除未轉(zhuǎn)化的基因組和未轉(zhuǎn)化的葉綠體。這個問題的解決是通過向葉綠體表達載體中加入篩選標記基因，轉(zhuǎn)化后進行抗性篩選，淘汰未轉(zhuǎn)化的葉綠體，以實現(xiàn)轉(zhuǎn)化葉綠體基因組的同質(zhì)化。第八十五頁，共九十六頁，編輯于2023年，星期日(3)采用葉綠體特異的啟動子和終止子實現(xiàn)外源基因的高效表達。為了使外源基因整合進葉綠體基因組后能夠高效表達，在構(gòu)建轉(zhuǎn)化載體時，一般選用葉綠體來源的啟動子和終止子。例如常用的啟動子為葉綠體的16srRNA基因的啟動子Prrn和光系統(tǒng)Ⅱ作用中心的啟動子PpsbA;常用的終止子為葉綠體的psaA基因的終止子TPsbA和rps16基因的終止子Trpsl6由于使用了葉綠體來源的啟動子和終止子，從而可以保證外源基因在葉綠體中的正常表達。第八十六頁，共九十六頁，編輯于2023年，星期日目前外源基因?qū)肴~綠體的方法主要有基因槍轉(zhuǎn)化法、PEG介導轉(zhuǎn)化法、花粉管導入法、農(nóng)桿菌介導轉(zhuǎn)化法、顯微注射及激光注射法和轉(zhuǎn)運膚介導的葉綠體間接轉(zhuǎn)化法等，其中最常用并且能夠獲得穩(wěn)定質(zhì)體轉(zhuǎn)化體的方法是基因槍法和PEG法。葉綠體基因組轉(zhuǎn)化的方法第八十七頁，共九十六頁，編輯于2023年，星期