植物組織培養(yǎng)

“植物的組織培養(yǎng)”實(shí)驗(yàn)改進(jìn)

——選自《生物·選修一·生物技術(shù)實(shí)踐》目錄1實(shí)驗(yàn)原理

3優(yōu)化實(shí)驗(yàn)4討論反思

5試題分析

2教材實(shí)驗(yàn)分析

6參考文獻(xiàn)實(shí)驗(yàn)原理細(xì)胞全能性植物體的根莖葉細(xì)胞一般具有全能性。在一定的營(yíng)養(yǎng)和激素等條件下，可以脫分化形成愈傷組織。將愈傷組織轉(zhuǎn)接到含有不同激素成分的培養(yǎng)基上，就可以誘導(dǎo)其再分化生成胚狀體或從芽，進(jìn)而發(fā)育成完整的小植株。植物組織培養(yǎng)的全過(guò)程，證明了分化的植物細(xì)胞，仍具有形成完整植株所需要的全部基因。實(shí)驗(yàn)原理植物細(xì)胞表現(xiàn)出全能性的條件：1）有一定營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)、激素和其他外界條件(如無(wú)菌、溫度、pH）。2）離體狀態(tài)。影響植物組織培養(yǎng)成功的因素外植體的選擇（植株種類、部位選?。┡囵B(yǎng)基種類濃度激素種類和濃度培養(yǎng)基的pH培養(yǎng)條件(包括通氣狀況、光照強(qiáng)度、日照時(shí)長(zhǎng)、溫度)培養(yǎng)時(shí)間（移栽時(shí)間）材料處理（消毒方式、外植體大?。┙臃N方式實(shí)驗(yàn)原理1）根據(jù)培養(yǎng)材料不同分為：植株培養(yǎng)胚胎培養(yǎng)、器官培養(yǎng)、組織培養(yǎng)、細(xì)胞培養(yǎng)、原生質(zhì)體培養(yǎng)植物組織培養(yǎng)的類型矮牽牛莖尖離體培養(yǎng)培養(yǎng)

牡丹成熟胚的離體培養(yǎng)與快速繁殖Matureembryocultureandrapidpropagationoftreepeony微型月季莖段離體培養(yǎng)花燭葉片離體快速繁殖實(shí)驗(yàn)原理2）根據(jù)器官發(fā)生途徑分為：直接器官發(fā)生途徑：植物器官可以直接由外植體上誘導(dǎo)。間接器官發(fā)生途徑：成熟細(xì)胞經(jīng)過(guò)脫分化及再分化過(guò)程而形成新的組織和器官的過(guò)程。植物組織培養(yǎng)的類型直接器官發(fā)生間接器官發(fā)生體細(xì)胞胚胎發(fā)生教材實(shí)驗(yàn)分析直接器官發(fā)生：菊花組織培養(yǎng)（浙科版）間接器官發(fā)生：胡蘿卜的組織培養(yǎng)（人教版）教材實(shí)驗(yàn)分析（浙科版）實(shí)驗(yàn)?zāi)康模?、進(jìn)行菊花的組織培養(yǎng)

2、嘗試植物激素的應(yīng)用實(shí)驗(yàn)設(shè)備及用品：100ml三角瓶或大口培養(yǎng)瓶、鑷子、超凈臺(tái)、滅菌鍋、封口膜和橡皮圈、有棉球的廣口瓶、

酒精燈、三角漏斗、培養(yǎng)皿實(shí)驗(yàn)材料：1、MS培養(yǎng)基:由大量元素、微量元素和有機(jī)成分組成，配方如下表。也可將大量元素、微量元素和有機(jī)成分分別配成濃度為配方的5~10倍的母液，用時(shí)稀釋。大量元素mg/L微量元素mg/L微量元素mg/L有機(jī)成分mg/LNH4NO3KNO3CaCI2?2H2OMgSO4?7H2OKH2PO416501900440370170KIH3BO3MnSO4?4H2OZnSO4?7H2ONa2MoO4?2H2O0.836.222.38.60.025CuSO4?5H2OCoCI2?6H2ONa2ˉEDTAFeSO4?7H2O蔗糖（g/L）0.0250.02537.327.830肌醇煙酸鹽酸吡哆醇鹽酸硫胺素甘氨酸1000.50.50.12.0教材實(shí)驗(yàn)分析（浙科版）2、萘乙酸NAA（少量0.1mol/L氫氧化鈉溶解），芐基腺嘌呤BA（少量0.1mol/L鹽酸溶解）3、發(fā)芽培養(yǎng)基：4、生根培養(yǎng)基：3000mlMS培養(yǎng)基+含1.5mgBA的溶液+含0.02mgNAA的溶液+30g蔗糖+40g瓊脂，再加蒸餾水至4000ml，混合均勻，加熱至瓊脂融化后，通過(guò)三角漏斗分裝至100ml三角瓶中，每瓶40ml，共100瓶。三角瓶加上封口膜后1kpa壓力下在滅菌鍋中滅菌20min。1000mlMS培養(yǎng)基+含0.38mgNAA的溶液+30g蔗糖+20g瓊脂，再加蒸餾水至2000ml，混合均勻，加熱至瓊脂融化后，通過(guò)三角漏斗分裝至100ml三角瓶中，每瓶40ml，共50瓶。三角瓶加上封口膜后1kpa壓力下在滅菌鍋中滅菌20min。實(shí)驗(yàn)材料：助溶混勻分裝滅菌實(shí)驗(yàn)培養(yǎng)基配制激素母液6-BA1ml1MKOH溶解適量的6-BA，然后加水定容，配制成濃度為0.5mg/ml的母液制作培養(yǎng)基（每10個(gè)人制500ml）A法依照中學(xué)教科書B法加入大約400ml蒸餾水，依次加入蔗糖15g，MS鹽2.5g，6-BA2ml，充分溶解，調(diào)節(jié)pH到5.8-6.0；每個(gè)組培瓶中稱取0.4g瓊脂，然后加入50ml的MS培養(yǎng)液。封口滅菌。作業(yè)：比較2種方法的優(yōu)缺點(diǎn)觀察滅菌后未凝固前培養(yǎng)基的顏色；培養(yǎng)基凝固程度跟什么有關(guān)教材實(shí)驗(yàn)分析（浙科版）

6、再轉(zhuǎn)移至土中培養(yǎng)（定植），即可長(zhǎng)成植株并開花。離體植物組織的制備接種叢狀苗培養(yǎng)生根培養(yǎng)移栽定植實(shí)驗(yàn)步驟1、在超凈臺(tái)中，取出一瓶已進(jìn)行過(guò)無(wú)菌培養(yǎng)的菊花幼苗，在無(wú)菌培養(yǎng)皿上用無(wú)菌鑷子和無(wú)菌解剖刀切成幾片，每段至少有1張葉片。2、在酒精燈旁，將每段放入1瓶生芽培養(yǎng)基中，使莖的一部分插入培養(yǎng)基蓋上封口膜。每瓶也可放入2~3段幼莖切斷。3、在日光燈下保持18~25℃的溫度培養(yǎng)，每天的光照不少于14.5h。4、2~3周后將生長(zhǎng)健壯的叢壯苗在無(wú)菌條件下一個(gè)個(gè)轉(zhuǎn)入生根培養(yǎng)基中，在上述條件下繼續(xù)培養(yǎng)。5、待生根后，將苗移至草炭土或蛭石中，用玻璃罩或塑料布保持80%以上的濕度，2~3天后打開玻璃罩逐漸降低濕度鍛煉，直到將罩全部打開處于自然濕度下為止。教材實(shí)驗(yàn)分析（浙科版）1、實(shí)驗(yàn)選材：無(wú)菌培養(yǎng)的菊花幼苗帶葉莖段(或自然生長(zhǎng)的莖：70%乙醇+5%次氯酸鈉5min2次+超凈臺(tái)無(wú)菌水沖洗)優(yōu)點(diǎn)：無(wú)菌培養(yǎng)植株自身帶有病菌較少，省去消毒過(guò)程。

帶葉莖段，較葉根等部位更易在較短時(shí)間內(nèi)誘導(dǎo)芽的產(chǎn)生。

不足：學(xué)生實(shí)驗(yàn)植株需要量大，無(wú)菌苗獲取存在一定難度。

外植體消毒不在超凈工作臺(tái)中進(jìn)行，消毒效果有待驗(yàn)證,無(wú)菌水洗后未吸干水分。

未說(shuō)明菊花具體品種，不利于實(shí)驗(yàn)開展。

2、實(shí)驗(yàn)步驟：（1）培養(yǎng)基配置：

優(yōu)點(diǎn)：先分裝后滅菌，省去倒板步驟，避免倒板過(guò)程中培養(yǎng)基污染并減少實(shí)驗(yàn)前期準(zhǔn)備。不足：1）未調(diào)節(jié)培養(yǎng)基pH值。定容后，根據(jù)文獻(xiàn)調(diào)節(jié)pH。2）NAA高溫滅菌易失活。建議使用過(guò)濾滅菌配制母液，再將之加入高溫滅菌的培養(yǎng)基中3）MS母液配制繁雜，表述存在歧義。購(gòu)買市售MS粉末，根據(jù)說(shuō)明書配制。

實(shí)驗(yàn)分析及優(yōu)化教材實(shí)驗(yàn)分析（浙科版）2、實(shí)驗(yàn)步驟（2）接種操作:

不足：1）僅在酒精燈旁，無(wú)菌環(huán)境控制不嚴(yán)謹(jǐn)。建議在滅菌后的超凈工作臺(tái)中操作。2）在無(wú)菌培養(yǎng)皿上切取莖段，多次操作后，易造成交叉污染。建議滅菌濾紙片上進(jìn)行操作，一輪

操作后，更換濾紙。3）刀具使用前后，未灼燒滅菌，易造成污染。建議在處理一枝莖段后，火焰灼燒滅菌。（3）煉苗土培:優(yōu)點(diǎn)：濕度逐漸降低，有助于試管苗適應(yīng)環(huán)境。不足：根部培養(yǎng)基未除盡，草炭土或蛭石未經(jīng)消毒處理。建議自來(lái)水沖凈根部培養(yǎng)基，草炭土或蛭石高

壓滅菌或烘烤滅菌。組培苗特點(diǎn)：生長(zhǎng)細(xì)弱，角質(zhì)層不發(fā)達(dá)根系不發(fā)達(dá)，吸收功能弱葉片通常沒有表皮毛，甚至葉片上出現(xiàn)大量的水孔葉綠體光合性差氣孔數(shù)量、大小超過(guò)普通苗對(duì)環(huán)境的適應(yīng)性和抵抗能力差教材實(shí)驗(yàn)分析（浙科版）3.思考題1)不同植物、不同組織的生根和生芽是否都可使用與本實(shí)驗(yàn)相同的生長(zhǎng)素和細(xì)胞分裂素？2)本實(shí)驗(yàn)用人工合成的激素，而不用植物中存在的天然激素，為什么？3)如果在自然界取植物樣本進(jìn)行組織培養(yǎng)，你認(rèn)為應(yīng)采取什么措施保護(hù)樣本不被污染？不可以，不同植物、不同組織的生根和生芽對(duì)生長(zhǎng)素和細(xì)胞分裂素濃度的需求是不一樣的。理論上每個(gè)細(xì)胞都具有全能性，實(shí)際表達(dá)難易程度卻隨植物種類、組織和細(xì)胞的不同而異。因此，不可貿(mào)然使用與本實(shí)驗(yàn)相同的生長(zhǎng)素和細(xì)胞分裂素濃度。創(chuàng)造無(wú)菌操作環(huán)境;設(shè)計(jì)合理的外植體消毒方式;操作快速，減少外植體接觸。人工合成的激素，在植物體內(nèi)沒有相應(yīng)的分解酶，所以作用和存在時(shí)間長(zhǎng)，效果更明顯。植物中存在的天然激素，植物體內(nèi)有相應(yīng)使之分解酶，因此其在植物體內(nèi)作用和存在時(shí)間較短。教材實(shí)驗(yàn)分析（人教版）實(shí)驗(yàn)步驟：選材（胡蘿卜根）消毒取樣接種愈傷組織誘導(dǎo)試管苗誘導(dǎo)移栽教材實(shí)驗(yàn)分析（人教版）1、實(shí)驗(yàn)選材：胡蘿卜塊根形成層

優(yōu)點(diǎn)：實(shí)驗(yàn)材料易獲取。

不足：以塊根為外植體，污染率較高。2、實(shí)驗(yàn)步驟：（1）培養(yǎng)基配制：該步驟被省略，培養(yǎng)基濃度未做說(shuō)明，不利于實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備工作開展。（2）接種操作：

優(yōu)點(diǎn)：強(qiáng)調(diào)無(wú)菌操作。

不足：外植體消毒方案耗時(shí)過(guò)長(zhǎng)。建議消毒方式：70%酒精30s+20%NaClO15min+灼燒12s（3）煉苗土培：煉苗被省略，移栽過(guò)程過(guò)于簡(jiǎn)化，不利于教師參考實(shí)施。實(shí)驗(yàn)分析及優(yōu)化外植體消毒：在超凈工作臺(tái)（或接種箱）上將胡蘿卜段用酒精溶液消毒30s后，立即用無(wú)菌水清洗2~3次，再用次氯酸鈉溶液處理30min后，立即用無(wú)菌水清洗2~3次。煉苗土培：培養(yǎng)一段時(shí)間后，生長(zhǎng)良好的愈傷組織轉(zhuǎn)接到分化培養(yǎng)基上，培養(yǎng)一段時(shí)間后，胡蘿卜的愈傷組織就可以誘導(dǎo)出試管苗。然后將試管苗移栽到大田，培養(yǎng)成正常植株。優(yōu)化實(shí)驗(yàn)——技術(shù)路線查閱文獻(xiàn)，確定選材（植株種類及部位：本氏煙葉片）明確實(shí)驗(yàn)步驟用具購(gòu)買清洗儀器高壓滅菌，烘干備用試劑配制（消毒劑、植物激素等）培養(yǎng)基配制（長(zhǎng)芽培養(yǎng)基：MS+1mg/L6-BA、生根培養(yǎng)基：MS）外植體取材及預(yù)處理外植體消毒，無(wú)菌接種移栽，誘導(dǎo)生根煉苗，移栽土培觀察植記錄株變化情況，討論出現(xiàn)的問(wèn)題撰寫實(shí)驗(yàn)報(bào)告組培間環(huán)境：溫度（25±1）℃，光照時(shí)常：12h/d，光照強(qiáng)度:20001Lx大約6周后，愈傷組織分化形成幼芽。10-12d，幼芽基部形成白色幼根，25d后形成完整煙草植株。優(yōu)化實(shí)驗(yàn)——實(shí)驗(yàn)步驟1.材料與器材1）植物材料：本氏煙煙草葉片。（組培技術(shù)成熟、生長(zhǎng)周期短，離體再生頻率高）2）實(shí)驗(yàn)藥品：MS培養(yǎng)基、蔗糖、植物凝膠、6-BA、NaOH固體粉末、12mol/LHCl（分析純）、分析純NaClO

（10.5%，密度1.07g/mL）、多菌靈、75%酒精、去離子水、無(wú)菌水、蒸餾水。3）儀器設(shè)備：高壓滅菌鍋、光照培養(yǎng)箱、天平、PH計(jì)、超凈工作臺(tái)、烘箱。4）器械及用具：移液槍、移液槍槍頭、鑷子、剪刀、刀、濾紙、藥匙、濾紙、報(bào)紙、記號(hào)筆、酒精燈、打火機(jī)、

小鐵架、標(biāo)簽紙、塑料薄膜袋、盆土（碧糠灰、泥炭土和蛙石1：1：1混合）、6*6cm塑料缽。5）玻璃器皿：細(xì)口瓶、培養(yǎng)瓶、三角燒瓶、培養(yǎng)皿、量筒、容量瓶、玻璃棒、燒杯、膠頭滴管。優(yōu)化實(shí)驗(yàn)——實(shí)驗(yàn)步驟2.器皿洗滌1)新購(gòu)置的玻璃器皿：1%HCl浸泡12h+洗潔精洗滌+清水沖洗+去離子水洗滌+晾干備用。2)已用過(guò)的玻璃器皿：洗潔精洗滌（培養(yǎng)瓶需浸泡24h）+清水沖洗+去離子水洗滌+晾干備用。3)新購(gòu)置的塑料器皿：打開即用。4)已用過(guò)的塑料器皿：2%NaOH浸泡12h+清水沖洗+2%-5%鹽酸浸泡30min+清水沖洗+去離子水洗+晾干備用。5)金屬器皿：75%酒精擦洗+晾干備用。3.器皿滅菌處理晾干后的器具高壓滅菌箱121℃，20min滅菌處理，冷卻，烘箱烘干備用。需滅菌器皿：刀具（透明塑料袋分裝：鑷子、剪刀、刀）、濾紙（置于培養(yǎng)皿中，報(bào)紙包好）、培養(yǎng)瓶、

槍頭、50ml離心管、細(xì)口瓶?jī)?yōu)化實(shí)驗(yàn)——實(shí)驗(yàn)步驟4.試劑配制：氫氧化鈉溶液的配制以0.1mol/LNaOH500ml為例1）計(jì)算：NaOH物質(zhì)的量＝0.1mol/L×0.5L＝0.05mol，NaOH摩爾質(zhì)量40g/mol，NaOH質(zhì)量=0.05mol×40g/mol=2g

（物質(zhì)的濃度=物質(zhì)的量/容量體積=物質(zhì)的質(zhì)量/摩爾質(zhì)量/容量體積）2）稱量：天平稱量2g。3）溶解：在燒杯中用100ml蒸餾水使之完全溶解，并用玻璃棒攪拌（不可在容量瓶中溶解）。4）轉(zhuǎn)移，洗滌：溶液移入500ml容量瓶，蒸餾水洗滌燒杯、玻璃棒二、三次，洗滌液注入容量瓶。輕輕振蕩容量瓶，

使溶液充分混合。（轉(zhuǎn)移時(shí)玻璃棒引流）。5）定容：加水到接近刻度2-3厘米時(shí)，改用膠頭滴管加蒸餾水到刻度。溶液凹液面的最低處和刻度線相切，眼睛

視線與刻度線呈水平，不能俯視或仰視。6）搖勻：定容后的溶液濃度不均勻，要把容量瓶瓶塞塞緊，用食指頂住瓶塞，用另一只手的手指托住瓶底，把

容量瓶倒轉(zhuǎn)和搖動(dòng)多次，使溶液混合均勻。7）把定容后的NaOH溶液搖勻。把配制好的溶液倒入試劑瓶中，蓋上瓶塞，貼上標(biāo)簽。優(yōu)化實(shí)驗(yàn)——實(shí)驗(yàn)步驟4.試劑配制：鹽酸溶液配制以250ml0.1mol/LHCl鹽酸為例1）計(jì)算：分析純鹽酸體積=0.1mol/L*0.25L/12mol/L=2.1ml。計(jì)算公式：稀釋前濃度×稀釋前體積=稀釋后濃

度×稀釋后體積。即:C1×V1=C2×V2。2）量取100ml蒸餾水，分析純鹽酸（12mol/L，密度1.19g/ml）2.1mL轉(zhuǎn)移至250ml容量瓶中。3）洗滌量筒（3次及以上），洗滌液移入容量瓶中，轉(zhuǎn)移液體時(shí)需用玻璃棒引流。4）定容，搖勻。把配制好的溶液倒入試劑瓶中，蓋上瓶塞，貼上標(biāo)簽。注：完整組培實(shí)驗(yàn)中需用到不同濃度NaOH及鹽酸溶液。實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備時(shí)可根據(jù)需要濃度及用量帶入步驟1計(jì)算公式得到藥品用量，依據(jù)上述步驟進(jìn)行配置。氫氧化鈉及鹽酸溶液用做器皿洗滌劑時(shí)為方便操作可用燒杯定容。優(yōu)化實(shí)驗(yàn)——實(shí)驗(yàn)步驟4.試劑配制：5%NaClO(密度1.07g/mL)配制：250ml為例1）計(jì)算：稀釋前后溶質(zhì)質(zhì)量不變，根據(jù)公式ρ1*v1*c1=ρ2*v2*c2可得分析純NaClO體積=250mL*1.0g/mL*5%/10.5%/1.17g/mL=120.16ml2）移液，定容：用移液槍移取120.16ml分析純NaClO溶液于滅菌細(xì)口瓶中，將無(wú)菌水倒入細(xì)口瓶中，液面最低

處與細(xì)口瓶刻度線相切。3）搖勻：輕輕搖勻，蓋上瓶塞，用錫紙將瓶身包住，貼上標(biāo)簽。注：5%NaClO溶液是本實(shí)驗(yàn)的消毒劑，因此配制過(guò)程中需在超凈工作臺(tái)中操作。稀釋中用到的槍頭、細(xì)口瓶均需經(jīng)過(guò)高壓滅菌處理。NaClO易分解需遮光保存，最好現(xiàn)配現(xiàn)用不易久置。優(yōu)化實(shí)驗(yàn)——實(shí)驗(yàn)步驟4.試劑配制：無(wú)菌水制備：將去離子水倒入1000ml玻璃瓶中，溶液體積占瓶子容積的4/5左右。置于高壓滅菌鍋中121℃中，

滅菌20min，冷卻備用。（滅菌時(shí)，瓶蓋不可擰緊，避免瓶身炸裂）100mg/L6-BA(50ml)溶液制備1）稱量：用分析天平稱取5mg6-BA粉末。2）溶解：加入10ml1mol/LHCl助溶。3）定容：加入蒸餾水定容搖勻，置于已烘干滅菌的離心管保存。優(yōu)化實(shí)驗(yàn)——實(shí)驗(yàn)步驟5.培養(yǎng)基配制：均已以1L為例發(fā)芽培養(yǎng)基（MS+1mg/L6-BA）1）配制：取1000ml燒杯，稱取4.74gMS培養(yǎng)基粉末、25g蔗糖、2g植物凝膠于燒杯中，移液槍移取10ml100mg/L6-BA加水定容至1000ml，混合均勻，用2%NaoH及2%HCl調(diào)PH至5.8。2）分裝：分裝至25個(gè)100ml三角燒瓶中，每瓶約40ml溶液。3）滅菌：用牛皮紙包扎封口，放入滅菌鍋，121℃滅菌20min，冷卻備用。生根培養(yǎng)基(MS)1）配制：取1000ml燒杯，稱取4.74gMS培養(yǎng)基粉末、25g蔗糖、2g植物凝膠于燒杯中，加水定容至1000ml，

混合均勻，用2%NaoH及2%HCl調(diào)PH至5.8。2）分裝：分裝至25個(gè)100ml三角燒瓶中，每瓶約40ml溶液。3）滅菌：用牛皮紙包扎封口，放入滅菌鍋，121℃滅菌20min，冷卻備用。建議：配制得到的培養(yǎng)基放置3-4天后使用，排除制備過(guò)程已被污染的培養(yǎng)基。優(yōu)化實(shí)驗(yàn)——實(shí)驗(yàn)步驟7.無(wú)菌接種：（兩人一組為例）1)試驗(yàn)用具和材料的準(zhǔn)備

2)用75%酒精擦拭超凈工作臺(tái)，打開通風(fēng)，將實(shí)驗(yàn)器具置于超凈工作臺(tái)中，然后打開超凈工作臺(tái)用

紫外燈殺菌30min。

（實(shí)驗(yàn)用具：長(zhǎng)芽培養(yǎng)基4個(gè)、刀具1副、小鐵架、酒精燈、打火機(jī)、廢液缸、75%酒精、2%NaClO、

濾紙、無(wú)菌水、空培養(yǎng)瓶。盡量避免重疊放置，以免降低滅菌效果。）

3)關(guān)紫外燈、打開風(fēng)機(jī)，通風(fēng)30min。（開紫外燈及通風(fēng)時(shí)，實(shí)驗(yàn)人員遠(yuǎn)離超凈工作臺(tái)）

6.外植體取材及預(yù)處理：

選取健康本氏煙煙草葉片，采摘時(shí)保持葉片完整，置于潔凈培養(yǎng)皿中，軟刷刷去植株表面污物。自來(lái)水沖洗30min，置于無(wú)菌水中備用。優(yōu)化實(shí)驗(yàn)——實(shí)驗(yàn)步驟7.無(wú)菌接種：（兩人一組為例）4）用75％的酒精拭擦臺(tái)面并消毒雙手。將裝有煙草葉片的培養(yǎng)瓶表面酒精消毒后拿入超凈工作臺(tái)。點(diǎn)燃

酒精燈，所有接種操作都必須在酒精燈旁進(jìn)行，將金屬器械在其火焰上灼燒，冷卻待用。

5）取外植體，分別在到有消毒酒精(75%，30s)、NaClO(5%,15min)培養(yǎng)瓶中浸泡消毒，無(wú)菌水洗3~4次，

置于裝有無(wú)菌水的培養(yǎng)瓶備用。6）裝有濾紙的培養(yǎng)皿置于酒精燈火焰下方打開，夾取葉片于濾紙上吸干水分，葉片剪去邊緣部分，處理為1.5*1.5矩形。7）左手持錐形瓶，右手拉開捆錐形瓶的瓶子。并將封口膜攥于右手手心，以避免封口膜接觸瓶口的一面被

污染。左手持瓶，使瓶口旋轉(zhuǎn)通過(guò)火焰；右手鑷子夾取葉片，將培養(yǎng)材料置于培養(yǎng)基上，每3個(gè)一瓶，

灼燒鑷子放回鐵架臺(tái)，灼燒瓶口，牛皮紙封口，細(xì)繩包扎。

8）更換濾紙，用酒精擦洗工作臺(tái)和手，進(jìn)行下一輪操作。優(yōu)化實(shí)驗(yàn)——實(shí)驗(yàn)步驟8.誘導(dǎo)生根（兩人一組為例）1）用75%酒精擦拭超凈工作臺(tái)，打開通風(fēng)，將實(shí)驗(yàn)器具置于超凈工作臺(tái)中，打開超凈工作臺(tái)紫外燈殺菌30min。

（實(shí)驗(yàn)用具：生根培養(yǎng)基4個(gè)、刀具1副、小鐵架、酒精燈、打火機(jī)、濾紙）

2）關(guān)紫外燈、打開風(fēng)機(jī)，通風(fēng)30min。（開紫外燈及通風(fēng)時(shí)，遠(yuǎn)離超凈工作臺(tái)）3）用75％的酒精拭擦臺(tái)面并消毒雙手。將裝有煙草小苗的培養(yǎng)瓶表面酒精消毒后拿入超凈工作臺(tái)。點(diǎn)燃酒精

燈，將金屬器械在其火焰上灼燒，冷卻待用。4）裝有濾紙的培養(yǎng)皿置于酒精燈火焰下方打開，切取約3～4cm長(zhǎng)的無(wú)根健壯小苗。5）打開培養(yǎng)瓶，瓶口在燈焰處旋轉(zhuǎn)灼燒，用鑷子將小苗接種于培養(yǎng)基上，接種是注意方向，不可插倒，每瓶1

個(gè)，灼燒鑷子放回，灼燒瓶口，擰緊瓶蓋。

6）更換濾紙，用酒精擦洗工作臺(tái)和手，進(jìn)行下一輪操作。優(yōu)化實(shí)驗(yàn)——實(shí)驗(yàn)步驟9.煉苗及移栽：1）煉苗處理：將已經(jīng)生根2cm的煙草置于白天最高溫度不超過(guò)30℃、夜間最低溫度不低于10℃的室內(nèi)2天。打開

瓶蓋，遮住一半瓶口，再相同環(huán)境中放置2天。之后完全移去瓶蓋在相同環(huán)境中放置2天，對(duì)組培苗

進(jìn)行選壯去弱。2）盆土消毒：用沸水澆灌盆土進(jìn)行燙土消毒殺菌，自然降溫至室溫備用。3）組培苗消毒清洗：煉苗處理后的煙草組培苗去除根部培養(yǎng)基，水洗2-3次，0.3~0.5%濃度的多菌靈消毒5~10分

鐘，水洗煙草植株出去多菌靈。4）移栽上盆：將消毒后的煙草組培苗移植盆土中。5）分株移栽：將移栽上盆后的煙草組培苗置于室內(nèi)通風(fēng)處，保持土壤濕潤(rùn)，生長(zhǎng)5~6周，待組培苗成活壯苗后，

進(jìn)行分株移栽至未經(jīng)消毒的盆土中，同樣環(huán)境中成長(zhǎng)4~5周，將盆土移植于室外遮陽(yáng)處繼續(xù)生長(zhǎng)3~5周，在將盆土移植于正常露天環(huán)境中，按常規(guī)澆水、施肥管理。優(yōu)化實(shí)驗(yàn)——課程安排查閱文獻(xiàn)，確定選材（植株種類及部位）明確實(shí)驗(yàn)步驟用具購(gòu)買清洗儀器高壓滅菌，烘干備用試劑配制（消毒劑、植物激素等）培養(yǎng)基配制（長(zhǎng)芽培養(yǎng)基：MS+1mg/L6-BA、生根培養(yǎng)基：MS）外植體取材及預(yù)處理外植體消毒、無(wú)菌接種移栽，誘導(dǎo)生根煉苗，移栽土培觀察記錄植株變化情況，討論出現(xiàn)的問(wèn)題撰寫實(shí)驗(yàn)報(bào)告前期準(zhǔn)備第一課時(shí)第二課時(shí)第三課時(shí)注：考慮課程時(shí)長(zhǎng)及植物組培周期，實(shí)驗(yàn)時(shí)學(xué)生進(jìn)行接種、生根及煉苗實(shí)驗(yàn)時(shí)可使用教師提前準(zhǔn)備好的實(shí)驗(yàn)材料。消毒處理時(shí)教師進(jìn)行演示實(shí)驗(yàn)。優(yōu)化實(shí)驗(yàn)——植株階段性變化第一周：植株葉片出現(xiàn)明顯地卷曲彎折，葉片部分區(qū)域厚度明顯增加。葉片在激素誘導(dǎo)下脫分化，

細(xì)胞分裂增殖而導(dǎo)致葉片厚度增加。由于不同區(qū)域增殖速率不同，使葉片出現(xiàn)彎折現(xiàn)象。第三周：葉片進(jìn)一步彎折，植物激素誘導(dǎo)下，脫分化的葉片細(xì)胞持續(xù)增殖，導(dǎo)致葉片厚度增幅明顯，

同時(shí)出現(xiàn)淺綠色愈傷組織。由于葉片細(xì)胞自身增殖能力不同及與培養(yǎng)基接觸面積差異而導(dǎo)

致細(xì)胞增殖速率不同。第五周：愈傷組織不斷增殖，其上出現(xiàn)淺黃綠色芽點(diǎn)。細(xì)胞分裂素誘導(dǎo)愈傷組織不斷增殖，并誘

導(dǎo)脫分化細(xì)胞形成芽。優(yōu)化實(shí)驗(yàn)——植株階段性變化生根培養(yǎng)10-12天后幼芽基部產(chǎn)生白色幼根，25天后煙草完整植株形成。生根2cm的煙草，煉苗5天選壯去弱，去除根部培養(yǎng)基，多菌靈消毒，移栽上盆。5-6周后，待組培苗成為壯苗后分株移栽。優(yōu)化實(shí)驗(yàn)——實(shí)驗(yàn)注意事項(xiàng)1)實(shí)驗(yàn)所使用的器材要嚴(yán)格滅菌，注意無(wú)菌操作，避免因染菌導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)失??；2)接種時(shí)在近火焰處打開牛皮紙（瓶蓋），使瓶?jī)A斜，以免空氣中微生物落入瓶中；3)整個(gè)接種操作應(yīng)在近火焰處進(jìn)行，且動(dòng)作要迅速；4)接種過(guò)程中盡可能達(dá)到懸空要求；5)接種時(shí)不得用手接觸瓶蓋內(nèi)壁或瓶口；6)接種完一瓶用火燒用具以防止交叉污染產(chǎn)生；7)刀具及鑷子在灼燒后稍待冷卻后，方可進(jìn)行操作避免鑷子及刀具過(guò)燙，而燙傷植物組織；8)材料脫毒時(shí)不要在酒精或升汞中停留過(guò)長(zhǎng)時(shí)間，以免植物細(xì)胞被殺死；9)選取葉片時(shí)，應(yīng)選取新鮮且活力較強(qiáng)的葉片組織進(jìn)行培育。防止污染優(yōu)化實(shí)驗(yàn)——實(shí)驗(yàn)注意事項(xiàng)正確錯(cuò)誤整個(gè)接種操作應(yīng)在近火焰處進(jìn)行，且動(dòng)作要迅速。優(yōu)化實(shí)驗(yàn)——實(shí)驗(yàn)注意事項(xiàng)正確錯(cuò)誤接種過(guò)程中盡可能達(dá)到懸空要求，植株不接觸瓶壁。優(yōu)化實(shí)驗(yàn)——實(shí)驗(yàn)注意事項(xiàng)

正確錯(cuò)誤瓶蓋朝下放，接種完畢后立即蓋好瓶口。優(yōu)化實(shí)驗(yàn)——常見問(wèn)題及處理方案褐化：細(xì)胞受脅迫條件或其他不利條件影響而死亡或細(xì)胞發(fā)生自然死亡。材料傷口

分泌的酚類物質(zhì)，在多酚氧化酶作用下氧化為醌類物質(zhì)形成的。原因：外植體、培養(yǎng)基、pH值、其他培養(yǎng)條件不合適。處理：葉片已經(jīng)失活，因此必須重新實(shí)驗(yàn)，同時(shí)調(diào)整實(shí)驗(yàn)環(huán)境。（降低細(xì)胞分裂素濃度、培養(yǎng)基PH、植物凝膠量）污染：在葉片周圍出現(xiàn)白色粘液狀細(xì)菌或絨毛狀霉菌污染，且隨著時(shí)間推移，菌不

斷繁殖，最終完全奪取葉片營(yíng)養(yǎng)導(dǎo)致葉片死亡。原因：真菌污染（消毒方案不當(dāng)）、細(xì)菌污染（主要是不規(guī)范操作造成）處理：取出植物組織重新消毒，接種于新培養(yǎng)基。褐化細(xì)菌污染真菌污染優(yōu)化實(shí)驗(yàn)——常見問(wèn)題及處理方案

玻璃化：試管苗呈半透明狀外觀形態(tài)異常的現(xiàn)象。植株內(nèi)源激素失調(diào)，能量代謝

受阻，蛋白質(zhì)的正常合成受抑，使分化難以順利啟動(dòng)，細(xì)胞發(fā)育異常而致。

原因：植體材料差異、環(huán)境濕度、碳源、無(wú)機(jī)鹽、外源激素、溫度、光照、培養(yǎng)基pH值及其添加物等不適宜造成。

處理：玻璃化試管苗難以回到正常狀態(tài)，需要重新實(shí)驗(yàn)，調(diào)整培養(yǎng)環(huán)境。1）培養(yǎng)基的硬度。提高瓊脂濃度。2）培養(yǎng)基成分。提高培養(yǎng)基的碳氮比，降低NH4+濃度或及時(shí)轉(zhuǎn)移培養(yǎng)基，在

其中加入適量的根本苷、活性炭或聚乙烯醇和青霉素G鉀等添加物。3）合適的培養(yǎng)環(huán)境。適當(dāng)提高光照強(qiáng)度，保持適宜溫度，降低濕度。4）適當(dāng)降低細(xì)胞分裂素的濃度和細(xì)胞分裂素與生長(zhǎng)素的比例。討論反思1.前期準(zhǔn)備工作繁雜，準(zhǔn)備時(shí)間較長(zhǎng)，需提前2-3個(gè)月準(zhǔn)備實(shí)驗(yàn)材料以供生根，煉苗實(shí)驗(yàn)使用。

2.實(shí)驗(yàn)安排較為緊湊，人員輪換頻率高，無(wú)菌操作過(guò)程中易出現(xiàn)交叉污染。

3.學(xué)生僅嘗試部分操作，對(duì)于完整植物組織實(shí)驗(yàn)認(rèn)識(shí)不足。

查找文獻(xiàn)，尋找生長(zhǎng)周期較短的植株。操作時(shí)注意濾紙更換，刀具灼燒消毒。人員輪換時(shí)，注意雙手消毒。依據(jù)學(xué)校實(shí)際情況及地方特色，開設(shè)組培選修課，學(xué)生能夠參與完整實(shí)驗(yàn)過(guò)程。植物的組織培養(yǎng)課時(shí)安排次序?qū)嶒?yàn)內(nèi)容課時(shí)安排備注1植物組織培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)室參觀及安全指導(dǎo)1（第一周）/2植物激素及消毒液的配制和保存1（第二周）需在超凈工作臺(tái)中進(jìn)行配置，教師需提前1小時(shí)進(jìn)行紫外通風(fēng)工作。3培養(yǎng)基配制及滅菌1（第三周）滅菌后教師（或安排同學(xué)）將培養(yǎng)基從高壓滅菌后拿出，置于組培間，靜置備用，取出時(shí)需輕拿輕放。4外植體消毒、接種1（第四周）接種需在無(wú)菌環(huán)境中進(jìn)行，教師需提前滅菌實(shí)驗(yàn)用具，并將其置于超凈工作中。實(shí)驗(yàn)前1小時(shí)完成紫外通風(fēng)工作。5植物組織培養(yǎng)理論講解3（第五--七周）學(xué)生每三天觀察、記錄植物組織變化，撰寫實(shí)驗(yàn)報(bào)告。6小組報(bào)告，課堂交流，探討實(shí)驗(yàn)出現(xiàn)問(wèn)題，分析實(shí)驗(yàn)結(jié)果2（第八--九周）結(jié)合課堂交流，小組完善實(shí)驗(yàn)報(bào)告。7實(shí)驗(yàn)器材清洗、處理1（第十周）實(shí)驗(yàn)垃圾分類處理。開設(shè)學(xué)期：春學(xué)期試題解析——生物競(jìng)賽2017年全國(guó)中學(xué)生生物學(xué)聯(lián)賽試題50.

在植物組織培養(yǎng)中，理論上下列哪種激素的配方有利于芽的形成：

B

A.

6-BA

:IAA=1:1

B.

6-BA

:IAA

=3:1

C.

6-BA

:IAA

=1:351.

細(xì)胞分裂素的特異效應(yīng)表現(xiàn)在：

D

A.

促進(jìn)不定根的形成

B.

抑制側(cè)芽生長(zhǎng)

C.

延遲開花

D.

促進(jìn)愈傷組織分化不定芽（叢芽）39.在農(nóng)業(yè)生物技術(shù)中，可以通過(guò)珠心組織培養(yǎng)獲得無(wú)病毒植株，這是因?yàn)锳

A.珠心組織與維管組織沒有直接聯(lián)系

B.珠心組織與分泌組織沒有直接聯(lián)系

C.珠心組織與分生組織沒有直接聯(lián)系

D.珠心組織與保護(hù)組織沒有直接聯(lián)系2016年全國(guó)中學(xué)生生物學(xué)聯(lián)賽試題試題解析——生物競(jìng)賽2017年浙江省高中生物競(jìng)賽試卷33.將某種植物種子放在黑暗中萌發(fā)，并在生長(zhǎng)狀況相同的一些胚芽鞘分別對(duì)應(yīng)截取三種切段即S1、S2、S3。然后把這三種切段分別放在不含IAA和赤霉素、含赤霉素、含IAA三種相同濃度的溶液中，培養(yǎng)3天后，測(cè)量切段長(zhǎng)度，結(jié)果如下圖DA.若從幼根獲取相應(yīng)切段進(jìn)行處理，結(jié)果與上圖無(wú)明顯差異B.不同種類激素對(duì)同一器官不同年齡細(xì)胞的作用無(wú)明顯差異C.該實(shí)驗(yàn)證明赤霉素促進(jìn)切段伸長(zhǎng)的效果顯著優(yōu)于IAAD.該實(shí)驗(yàn)無(wú)法證明赤霉素和IAA共同作用的效果試題解析——高考生物(1)利用植物愈傷組織獲得再生植株主要有兩條途徑:一是由愈傷組織的細(xì)胞先分化產(chǎn)生芽和根后再形成一個(gè)完整植株的器官發(fā)生途徑,二是由愈傷組織細(xì)胞產(chǎn)生胚狀體后再萌發(fā)形成完整植株的胚胎發(fā)生途徑。另外也可不通過(guò)愈傷組織階段而直接采用腋芽帶的莖段培養(yǎng)成叢狀苗,再誘導(dǎo)生根獲得再生植株,其原因是腋芽中存在分生組織。(2)利用植物克隆培育新品種,一方面可利用帶有目的基因的農(nóng)桿菌侵染植株，或通過(guò)顯微注射的方法導(dǎo)入植物細(xì)胞、組織、器官獲得轉(zhuǎn)基因，另一方面利用異源植株的原生質(zhì)體進(jìn)行融合產(chǎn)生雜種植株,或利用異源因植株在試管內(nèi)進(jìn)行受精,對(duì)其產(chǎn)生的胚進(jìn)行培養(yǎng)產(chǎn)生雜種植株。(3)下列屬于植物克隆和動(dòng)物克隆共有培養(yǎng)方法是（A）A懸浮培養(yǎng)、器官培養(yǎng)B.貼壁培養(yǎng)、傳代培養(yǎng)C.器官培養(yǎng)、愈傷組織培養(yǎng)D.原生質(zhì)體培養(yǎng)、傳代培養(yǎng)32、【加試題】回答與植物克隆和動(dòng)物克隆有關(guān)的問(wèn)題:2017年11月浙江省普通高校招生選考生物科試卷試題解析——高考生物32．【加試題】（二）某小組欲進(jìn)行煙草原生質(zhì)體分離與培養(yǎng)的研究，請(qǐng)回答：（1）原生質(zhì)體的分離：在無(wú)菌條件下，取煙草無(wú)菌苗的葉片，放入含有0.5mol/L的甘露醇（維持較高滲透壓）的果膠酶和纖維素酶混合液處理，經(jīng)過(guò)離心純化后獲得原生質(zhì)體。（2）原生質(zhì)體的培養(yǎng)：將原生質(zhì)體進(jìn)行培養(yǎng)，重新長(zhǎng)出細(xì)胞壁，形成胚性細(xì)胞，此時(shí)，應(yīng)該降低培養(yǎng)基中甘露醇的濃度，以利于胚性細(xì)胞繼續(xù)培養(yǎng)形成細(xì)胞團(tuán)，然后經(jīng)兩次途徑形成再生植株。途徑一：細(xì)胞團(tuán)形成球胚、心形胚和胚狀體，最好發(fā)育成植株。途徑二：細(xì)胞團(tuán)增殖為愈傷組織，然后在發(fā)芽培養(yǎng)基上又到出芽，切割芽經(jīng)過(guò)生根后形成完整植株。上述發(fā)芽培養(yǎng)基中含量相對(duì)較高的激素是細(xì)胞分裂素、胚性細(xì)胞的主要特點(diǎn)是D

。（A.液泡小、細(xì)胞核小B.液泡大、細(xì)胞核大C.液泡大、細(xì)胞核小D.液泡小、細(xì)胞核大）（3）為了對(duì)煙草的某些性狀進(jìn)行改良，分離得到兩種煙草的原生質(zhì)體，通過(guò)原生質(zhì)體融合方法將它們的遺傳物質(zhì)組合在一起，經(jīng)培養(yǎng)獲得具有新性狀的再生植株，提取再生植株的DNA，采用PCR技術(shù)擴(kuò)增相關(guān)基因，來(lái)鑒定遺傳物質(zhì)是否成功重組。2016年10月浙江省普通高校招生選考科目考試生物試題在進(jìn)行外植體消毒時(shí)，消毒效果最好的消毒液是———，實(shí)驗(yàn)中經(jīng)常用的是下面哪些激素經(jīng)常被用于誘導(dǎo)叢生芽參考文獻(xiàn)[1]陳芝娟.RNA沉默介導(dǎo)的本氏煙抗ORSV/CymMV病毒株的研究[D].杭州師范大學(xué),2013.[2]馬璐琳,王祥寧,王繼華,等.一種提高煙草K326組培苗移栽成活率的煉苗過(guò)渡方法:,CN104920048A[P].2015.[3]潘娟,李先源,李名楊.植物組織培養(yǎng)過(guò)程中常見問(wèn)題及解決方法[J].安徽農(nóng)業(yè)科學(xué),2009,37(6):2392-2394.[4]周健博.基于選修教材的“植物組織培養(yǎng)”課程開發(fā)[J].生物學(xué)教學(xué),2013,38(9):17-18.[5]姚曉惠,張峰,等.植物組織培養(yǎng)課程實(shí)驗(yàn)教學(xué)改革的探討[J].商丘師范學(xué)院學(xué)報(bào),2007,23(6):125-127.[6]田士林,李莉.植物激素對(duì)愈傷組織形成和根芽分化的影響[J].安徽農(nóng)業(yè)科學(xué),2007,35(14):4132-4132.[7]吳映明,關(guān)見留,龔玉蓮.植物組織培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)的幾點(diǎn)問(wèn)題及其改進(jìn)方法[J].廣東第二師范學(xué)院學(xué)報(bào),2003,23(2):74-77.[8]譚潔敏,黃勝琴,許德成.“胡蘿卜的組織培養(yǎng)”消毒方法的優(yōu)化[J].生物學(xué)通報(bào),2016,51(7):50-52.[9]邱豐艷,徐前杰,林小燕.《生物學(xué)教學(xué)論》綜合設(shè)計(jì)性實(shí)驗(yàn)探索與實(shí)踐——胡蘿卜愈傷組織誘導(dǎo)實(shí)驗(yàn)的探究[J].龍巖學(xué)院學(xué)報(bào),2010,28(2):113-116.參考文獻(xiàn)[10]羅文俊.胡蘿卜愈傷組織培養(yǎng)試驗(yàn)及改進(jìn)[J].文理導(dǎo)航,2015(26):63-63.[11]黃元國(guó).因陋就簡(jiǎn)開展胡蘿卜組織培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)[J].生物學(xué)教學(xué),2009,34(10):39-40.[12]倫君,張?jiān)獓?guó),徐香梅,等.菊花的組織培養(yǎng)技術(shù)規(guī)程[J].北方園藝,2011(9):151-151.[13]吳相鈺,劉恩山.生物學(xué),選修1,生物技術(shù)實(shí)踐[M].浙江科學(xué)技術(shù)出版社,2005.[14]吳相鈺,劉恩山.生物學(xué),教師教學(xué)用書,選修三[M].浙江科學(xué)技術(shù)出版社,2007.[15]生物課程教材研究中心.生物:生物技術(shù)實(shí)踐[M].人民教育出版社,2007.[16]生物課程教材研究中心.生物:現(xiàn)代生物科技專題[M].人民出版社,2007.[17]李浚明,朱登云.植物組織培養(yǎng)教程[M].中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)出版社,2005.[18]曾艷玲,張黨權(quán),譚曉風(fēng),等.《植物組織培養(yǎng)》理論與實(shí)踐教學(xué)模式改革探討[J].中南林業(yè)科技大學(xué)學(xué)報(bào)(社會(huì)科學(xué)版),2013,7(4):168-170.一、植物組織培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)室的結(jié)構(gòu)及