實(shí)驗(yàn)一蛋白質(zhì)含量的測(cè)定

實(shí)驗(yàn)一蛋白質(zhì)含量的測(cè)定

(考馬斯亮藍(lán)法)1實(shí)驗(yàn)?zāi)康闹参矬w內(nèi)的可溶性蛋白質(zhì)大多數(shù)是參與各種代謝的酶類，測(cè)其含量是了解植物體總代謝的一個(gè)重要指標(biāo)。在研究每一種酶的作用時(shí)，常以比活（酶活力單位／mg蛋白）表示酶活力大小及酶制劑純度。因此，測(cè)定植物體內(nèi)可溶性蛋白質(zhì)是研究酶活的一個(gè)重要項(xiàng)目。2一、原理考馬斯亮藍(lán)G-250（CoomassitbrilliantblueG-250）測(cè)定蛋白質(zhì)含量屬于染料結(jié)合法的一種。在一定蛋白質(zhì)濃度范圍內(nèi)（5～100μg/ml），蛋白質(zhì)－色素復(fù)合物在595nm波長(zhǎng)下的光吸收與蛋白質(zhì)含量成正比，故可用于蛋白質(zhì)的定量測(cè)定。3特點(diǎn)蛋白質(zhì)與考馬斯亮藍(lán)G-250結(jié)合在2min左右的時(shí)間內(nèi)達(dá)到平衡，完成反應(yīng)十分迅速，其結(jié)合物在室溫下1h內(nèi)保持穩(wěn)定。該反應(yīng)非常靈敏，可測(cè)微克級(jí)蛋白質(zhì)含量(范圍為5～100μg蛋白質(zhì)）,，所以是一種比較好的蛋白質(zhì)定量法。4二、材料、試劑與儀器設(shè)備：植物材料：各種植物葉片及其他器官或離體細(xì)胞培養(yǎng)物

實(shí)驗(yàn)器具：分光光度計(jì)；離心機(jī)；研缽；離心管；移液管，試管等；試劑1．考馬斯亮藍(lán)試劑：

2．蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)溶液：

3．90%乙醇；

4.磷酸（85%，W/V）。5三、實(shí)驗(yàn)步驟樣品含量測(cè)定：（1）稱取鮮樣0.5g，剪碎放入研缽中加少量pH7.0緩沖液3ml研磨提取,再分別加2ml,1ml清洗研缽和研棒兩次,倒入離心管中，7000rpm/min離心15分鐘,把上清液倒入一刻度試管中,記錄體積。6（2）用移液管（或移液器）取上清液0.1ml(若樣品中的蛋白質(zhì)含量低可取0.5ml加5ml考馬斯亮藍(lán)，按照0～100μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)曲線求算蛋白質(zhì)含量)，加入到10ml刻度試管中，再加入5ml考馬斯亮藍(lán)試劑，充分搖勻，5分鐘后，在分光光度計(jì)595nm處比色。7四、結(jié)果計(jì)算樣品蛋白質(zhì)含量（μg/g鮮重）=(C×V/a)/W式中：C－查標(biāo)準(zhǔn)曲線所得每管蛋白質(zhì)含量（μg/mL）；V－提取液總體積（mL）；a－測(cè)定所取提取液體積（mL）；W－取樣量（g）。8五、注意事項(xiàng)1.在配制考馬斯亮藍(lán)時(shí)很容易看到絮狀物出現(xiàn)，應(yīng)用濾紙加以過(guò)濾，以免影響測(cè)定