基因工程第三章

基因工程第三章第一頁，共六十七頁，編輯于2023年，星期日3.1.1分子雜交與印漬技術的原理

分子雜交：不同來源的單鏈核酸（DNA或RNA），只要它們具有大致相同的堿基序列，經過退火處理，就能重新形成雜種雙螺旋，這一現(xiàn)象稱為分子雜交（molecularhybridization）。3.1分子雜交與印漬技術第二頁，共六十七頁，編輯于2023年，星期日0復性RNADNA第三頁，共六十七頁，編輯于2023年，星期日利用這一原理，就可以使用已知序列的單鏈核酸片段作為探針，去查找各種不同來源的基因組DNA分子中的同源基因或同源序列。第四頁，共六十七頁，編輯于2023年，星期日印漬技術：

Blotting印漬技術的原理首先由EdwenSouthern在1975年提出。第五頁，共六十七頁，編輯于2023年，星期日其基本操作過程是：將DNA片段在瓊脂糖凝膠中電泳分離后，置NaOH液中浸泡，從而將凝膠中的DNA變性為單鏈；然后將一張硝酸纖維素膜鋪在凝膠上，上面放上大量吸水紙巾，利用吸水紙巾的毛細作用，將單鏈DNA從凝膠中轉移到硝酸纖維素膜上，再將膜置80℃烘干并使單鏈DNA分子固定在膜上，再用于分子雜交分析。第六頁，共六十七頁，編輯于2023年，星期日分子雜交實驗①②③第七頁，共六十七頁，編輯于2023年，星期日SouthernBlotting第八頁，共六十七頁，編輯于2023年，星期日印跡技術的類別及應用1、DNA印跡技術

(Southernblotting)

用于基因組DNA、重組質粒和噬菌體的分析。2、RNA印跡技術

(Northernblotting)

用于RNA的定性定量分析。3、蛋白質的印跡分析

(Westernblotting)

用于蛋白質定性定量及相互作用研究。

第九頁，共六十七頁，編輯于2023年，星期日三種印跡技術的比較第十頁，共六十七頁，編輯于2023年，星期日探針技術：將已知序列的核酸片段用放射性同位素、生物素或熒光染料進行標記，然后用于分子雜交，雜交后通過放射自顯影、熒光檢測或顯色技術，使雜交區(qū)帶顯現(xiàn)出來。第十一頁，共六十七頁，編輯于2023年，星期日3.2PCR技術

PCR：聚合酶鏈式反應（PolymeraseChainReaction），是指利用耐熱DNA聚合酶的反復作用，通過變性-復性-延伸的循環(huán)操作，在體外迅速將DNA模板擴增數(shù)百萬倍的一種操作技術。第十二頁，共六十七頁，編輯于2023年，星期日PCR基本原理：變性-復性-延伸1．變性：通常采用加熱變性，即將模板DNA或延伸后的雙鏈DNA加熱到940C，使雙螺旋DNA解開成為單鏈。2．復性：通過降低反應溫度至500C-650C，使兩種引物能與兩條解開的DNA互補鏈的3`端粘合，以提供DNA聚合酶催化聚合所需的3`-OH。3．延伸：將反應溫度提高到約720C，在耐熱DNA聚合酶的催化下，根據(jù)模板DNA提供的堿基順序，合成兩條互補鏈，從而使模板DNA擴增一倍。第十三頁，共六十七頁，編輯于2023年，星期日PCR技術特點1、高度的敏感性。2、高度的特異性。3、操作簡便快速。4、樣品適用廣泛。5、有一定程度的單核苷酸錯誤摻入。第十四頁，共六十七頁，編輯于2023年，星期日引物要擴增模板DNA，首先要設計兩條寡核苷酸引物，所謂引物，實際上就是兩段與待擴增靶DNA序列互補的寡核苷酸片段，兩引物間距離決定擴增片段的長度；兩引物的5’端決定擴增產物的兩個5’末端位置。由此可見，引物是決定PCR擴增片段長度、位置和結果的關鍵，引物設計也就更為重要。第十五頁，共六十七頁，編輯于2023年，星期日引物的設計：引物設計的必要條件是與引物互補的靶DNA序列必須是已知的，兩引物之間的序列未必清楚，這兩段已知序列一般為18～21個堿基，可以用DNA合成儀合成與其對應互補的二條引物。

第十六頁，共六十七頁，編輯于2023年，星期日（1）引物長度：18-21bp（2）（G+C）%含量：引物的組成應均勻，盡量避免含有相同的堿基多聚體。兩個引物中（G+C）%含量一般以40%～60%為佳。（3）引物的結構：無明顯的次級結構（4）引物之間：不應發(fā)生互補(5）引物3’端配對精確和嚴格第十七頁，共六十七頁，編輯于2023年，星期日引物引物3’5’5’5’基因組引物第十八頁，共六十七頁，編輯于2023年，星期日PCR的反應原理第十九頁，共六十七頁，編輯于2023年，星期日PCR技術的基本過程TaqDNA聚合酶模板DNAdNTP引物Buffer預變性模板DNAdNTP引物Buffer循環(huán)儀94oC5’94℃55℃72℃第二十頁，共六十七頁，編輯于2023年，星期日1、dNTP:PCR常用的濃度為50～200μmol/L，不能低于10～15μmol/L。四種dNTP的濃度應相同。2、緩沖液：10mMTris.HClpH8.3,50mMKCl,1.5mMMgCl2。3、模板DNA：純度與含量。4、反應參數(shù)。PCR的影響因素第二十一頁，共六十七頁，編輯于2023年，星期日（1）變性--考慮酶的失活問題。一般為反應開始時用95oC×2-5min，在后續(xù)循環(huán)中設為94oC×30s-1min;（2）退火--退火溫度取決于引物的堿基組成、長度及引物與模板的匹配程度，一般在Tm–20-25oC左右；時間一般為30s-2min；（3）延伸—溫度一般為72oC；時間取決于待擴增片段的長度。在通常情況下，Taq酶的延伸速率約為2kb/min，而pfu為1kb/min。（4）在最后一個循環(huán)結束后，需再在72oC下延伸10min，以產物完整。第二十二頁，共六十七頁，編輯于2023年，星期日

單、雙鏈DNA或RNA都可以作為PCR的樣品。若起始材料是RNA，須先通過逆轉錄得到第一條cDNA。為了保證反應的特異性，還應用ng級的克隆DNA，μg水平的單拷貝染色體DNA或102-105拷貝的待擴增片段作為起始材料。模板可以是粗品，但不能混有任何蛋白酶、核酸酶、TaqDNA聚合酶抑制劑以及結合在DNA上的蛋白。第二十三頁，共六十七頁，編輯于2023年，星期日

模板的純度、含量測定

260nm1OD

雙鏈DNA50μg/ml

單鏈DNA40μg/ml

OD

260nm/

OD280nm≈1.8第二十四頁，共六十七頁，編輯于2023年，星期日ddH2O37.60μL10×Buffer5μLdNTPmixture(2.5mM)4μL引物上(20pmol/μL)1μL引物下(20pmol/μL)1μL

MgCl2(25mM)4μL模板(102-105

拷貝)0.5μLDNAPolymerase0.4μL總體積

50μL第二十五頁，共六十七頁，編輯于2023年，星期日

95℃變性處理3min94℃30S56℃30S72℃1min30個循環(huán)

72℃延伸7min第二十六頁，共六十七頁，編輯于2023年，星期日第二十七頁，共六十七頁，編輯于2023年，星期日PCR產物純化

從凝膠上盡量小的切下目的片段,放在一個干凈的EP管中，稱取凝膠的重量，并加入3倍體積的BufferS1(即100mg膠加300μLBufferS1)；盛膠EP管于50℃水浴10min，每2-3min搖動一次，至膠徹底融化；溶液加入到吸附柱內，13000rpm離心1min，棄去收集管中的液體；第二十八頁，共六十七頁，編輯于2023年，星期日

加入0.5mL的BufferW1洗滌DNA，13000rpm離心15sec；棄去收集管中的液體，再加入0.5mL的W1Buffer，靜置1min，13000rpm離心15sec；棄去收集管中的液體，13000rpm離心1min；把吸附柱放在一個干凈的EP管內，在柱子膜中央加入30μLBufferT1,室溫放置1min,13000rpm離心1min。凝膠回收后的目的基因，各取5μL電泳檢測，并測定濃度以確定連接體系（此步必做）。第二十九頁，共六十七頁，編輯于2023年，星期日第三十頁，共六十七頁，編輯于2023年，星期日第三十一頁，共六十七頁，編輯于2023年，星期日第三十二頁，共六十七頁，編輯于2023年，星期日PCR的主要用途

（一）目的基因的克隆：PCR技術是迅速獲得一定量的目的基因以用于基因克隆的有效方法之一。主要采用的方法有：①利用特異性引物以cDNA或基因組DNA為模板，獲得已知的目的基因；第三十三頁，共六十七頁，編輯于2023年，星期日②利用簡并引物從cDNA文庫或基因組文庫中獲得具有同源性的DNA片段；③利用隨機引物從cDNA文庫或基因組文庫中隨機獲得目的基因。第三十四頁，共六十七頁，編輯于2023年，星期日（二）基因的體外突變：采用隨意設計的引物，在體外對基因進行嵌合、缺失、點突變等改造。（三）DNA的微量分析：由于PCR技術具有高度敏感性，故可用于微量DNA的分析檢測。第三十五頁，共六十七頁，編輯于2023年，星期日3.3生物芯片生物芯片（biochip）的概念指采用光導原位合成或微量點樣等方法，將大量生物大分子如核酸片段、多肽分子甚至組織切片、細胞等生物樣品有序地固化于支持物的表面，組成密集二維分子排列，然后與已標記的待測生物樣品中的靶分子雜交，通過特定的儀器對雜交信號的強度進行快速、并行、高效地檢測分析，從而判斷樣品中靶分子的數(shù)量。第三十六頁，共六十七頁，編輯于2023年，星期日根據(jù)生物分子之間特異性相互作用的原理，如DNA-DNA、DNA-RNA、抗原-抗體、受體-配體之間可發(fā)生的復性與特異性結合，設計一方為探針，并固定在微小的載體表面，通過分子之間的特性性反應，檢測另外一方有無、多少或者結構改變等第三十七頁，共六十七頁，編輯于2023年，星期日生物芯片（Biochip或Bioarray）是指包被在固相載體上的高密度DNA、抗原、抗體、細胞或組織的微點陣(microarray）。未來十年最具發(fā)展?jié)摿Φ募夹g。第三十八頁，共六十七頁，編輯于2023年，星期日生物芯片的主要特點：高通量、微型化和自動化常用的生物芯片的分類：基因芯片、蛋白質芯片及芯片實驗室第三十九頁，共六十七頁，編輯于2023年，星期日基因芯片（Genechip）又稱DNA芯片,是根據(jù)核酸雜交的原理，將大量探針分子固定于支持物上，然后與標記的樣品進行雜交，通過檢測雜交信號的強度及分布來進行分析。第四十頁，共六十七頁，編輯于2023年，星期日2.蛋白質芯片(proteinchip)利用抗體與抗原特異性結合即免疫反應的原理，將蛋白質分子（抗原或抗體）結合到固相支持物上，形成蛋白質微陣列，即蛋白質芯片。第四十一頁，共六十七頁，編輯于2023年，星期日芯片實驗室(labs-on-chip)高度集成化的集樣品制備、基因擴增、核酸標記及檢測為一體的便攜式生物分析系統(tǒng)。實現(xiàn)生化分析全過程集成在一片芯片上完成，從而使生物分析過程自動化、連續(xù)化和微縮化。芯片實驗室是生物芯片技術發(fā)展的最終目標。第四十二頁，共六十七頁，編輯于2023年，星期日3.4基因文庫的構建第四十三頁，共六十七頁，編輯于2023年，星期日基因文庫基因組文庫第四十四頁，共六十七頁，編輯于2023年，星期日第四十五頁，共六十七頁，編輯于2023年，星期日為什么要建立基因文庫？直接從含目的基因的生物中提取不行嗎？第四十六頁，共六十七頁，編輯于2023年，星期日基因文庫限制性內切酶……克隆、轉化、培養(yǎng)、鑒定基因組DNA基因文庫第四十七頁，共六十七頁，編輯于2023年，星期日基因組DNA文庫基因組DNA限制性內切酶基因重組轉化細菌體外包裝第四十八頁，共六十七頁，編輯于2023年，星期日cDNA文庫的組建：基因重組反轉錄酶mRNAcDNA第四十九頁，共六十七頁，編輯于2023年，星期日如何從基因文庫中找到所需要的基因根據(jù)目的基因的有關信息基因的核苷酸序列基因的功能基因在染色體上位置基因的轉錄產物mRNA基因翻譯產物蛋白質第五十頁，共六十七頁，編輯于2023年，星期日3.6酵母雙雜交系統(tǒng)

酵母雙雜交技術是1989年由Fields等最先應的。與其他技術相比，它省去了耗時耗力的蛋白表達純化以及抗體制備步驟，并且可以用于高通量的篩選，因此以其簡便、快捷與廉價的優(yōu)點迅速發(fā)展成為一種常用的研究蛋白質相互作用的方法。根據(jù)對文獻的統(tǒng)計，目前已知的蛋白質相互作用至少有一半是通過酵母雙雜交實驗發(fā)現(xiàn)的。第五十一頁，共六十七頁，編輯于2023年，星期日原理轉錄激活因子在結構上是組件式的(modular),即這些因子往往由兩個或兩個以上相互獨立的結構域構成,其中有DNA結合結構域(DNAbindingdomain,簡稱為DB)和轉錄激活結構域(activationdomain,簡稱為AD),它們是轉錄激活因子發(fā)揮功能所必需的。單獨的DB雖然能和啟動子結合,但是不能激活轉錄。而不同轉錄激活因子的DB和AD形成的雜合蛋白仍然具有正常的激活轉錄的功能。第五十二頁，共六十七頁，編輯于2023年，星期日酵母雙雜交系統(tǒng)利用雜交基因通過激活報道基因的表達探測蛋白———蛋白的相互作用。主要結構由含有DNA結合域和DNA轉錄激活域二類載體以及酵母報告株構成。將DNA—BD與已知的誘餌蛋白質X融合,構建出BD-X質粒載體;將AD基因與cDNA文庫,基因片段或基因突變體(以Y表示)融合,構建出AD-Y質粒載體。第五十三頁，共六十七頁，編輯于2023年，星期日第五十四頁，共六十七頁，編輯于2023年，星期日酵母雙雜交系統(tǒng)的實驗基本過程第五十五頁，共六十七頁，編輯于2023年，星期日

3.7DNA堿基序列測定DNA堿基序列測定即DNA一級結構的測定，目前常用的方法為Maxam-Gilbert建立的化學裂解法和Sanger建立的雙脫氧末端終止法。第五十六頁，共六十七頁，編輯于2023年，星期日雙脫氧末端終止法的主要操作步驟有：1．獲得待測DNA片段的單鏈模板：一般采用基因工程的方法以獲取一定數(shù)量的單鏈待測DNA模板?？蓪⒋郎yDNA片段與噬菌體M13DNA進行重組，然后將其導入大腸桿菌進行增殖，M13噬菌體一般以單鏈DNA形式透出細胞再感染新的細菌，故此可獲得單鏈DNA模板。

第五十七頁，共六十七頁，編輯于2023年，星期日2．合成寡核苷酸引物：在待測DNA片段的3'-端合成一段互補的寡核苷酸引物，其順序可為待測DNA片段3'-端的一段已知順序，也可為一段M13噬菌體的順序?？衫肈NA合成儀自動合成。3．模板-引物雜交：將待測單鏈DNA模板與寡核苷酸引物混合，并在適當溫度條件下進行保溫處理，使引物與DNA單鏈模板的3'-端進行雜交。第五十八頁，共六十七頁，編輯于2023年，星期日4．互補鏈的延長和終止：將上述雜交混合液分為四份，每份混合液中均加入DNA聚合酶，四種dNTPS，一種帶放射性同位素標記的脫氧核糖核酸（如α-32P-dATP）。此外，還需分別加入一種雙脫氧核糖核酸（ddATP，ddGTP，ddCTP或ddTTP）。然后在適當溫度條件下延伸互補鏈，就可得到四組分別以A、G、C、T，終止的長短不一的互補鏈的混合物。因在互補鏈合成時，如摻入的是雙脫氧核糖核酸，由于缺乏3`-和2`-OH，故可導致互補鏈合成終止。第五十九頁，共六十七頁，編輯于2023年，星