嗅黏膜嗅鞘細(xì)胞的實驗研究概述

嗅黏膜嗅鞘細(xì)胞的實驗研究概述

【關(guān)鍵詞】嗅鞘細(xì)胞

嗅鞘細(xì)胞(olfactoryensheathingcells,OECs)在功能上是介于施萬細(xì)胞和少突膠質(zhì)細(xì)胞之間的一種特殊的膠質(zhì)細(xì)胞,具有神經(jīng)營養(yǎng)、抑制膠質(zhì)增生、瘢痕形成、成鞘作用等，為軸突生長提供了適宜的微環(huán)境及較強的遷移的特性，使其成為促進中樞神經(jīng)再生的理想候選細(xì)胞之一。嗅鞘細(xì)胞同膠質(zhì)細(xì)胞、施萬細(xì)胞在表現(xiàn)型上有共同點，它們都能促進軸突的再生，主要區(qū)別在于嗅鞘細(xì)胞不但存在于中樞神經(jīng)系統(tǒng)，也存在于外周神經(jīng)中。

嗅黏膜中的神經(jīng)元是唯一的生后才生長并在成年時繼續(xù)分化的神經(jīng)元，壽為4～12周，隨著新細(xì)胞的生長，又建立了新的神經(jīng)支配關(guān)系。嗅鞘細(xì)胞存在于嗅神經(jīng)及嗅球的神經(jīng)層上，沿嗅神經(jīng)的全長，從周圍神經(jīng)系統(tǒng)到中樞神經(jīng)分布。

成年哺乳類嗅黏膜中的嗅覺神經(jīng)元具有終生更新的特點,由此說明嗅黏膜中存在神經(jīng)干細(xì)胞。

嗅黏膜由源于外胚層的嗅板及位于其底部的間充質(zhì)發(fā)育、分化而來,由上皮和固有層組成。上皮內(nèi)的嗅細(xì)胞是初級嗅覺神經(jīng)元,成體嗅黏膜內(nèi)的嗅細(xì)胞終生處于不斷凋亡、更新之中,新生嗅細(xì)胞的軸突進入固有層由嗅鞘細(xì)胞包繞形成嗅神經(jīng),經(jīng)篩孔進入嗅球與僧帽細(xì)胞形成突觸,在軸突的生長和突觸的重建過程中,嗅鞘細(xì)胞具有重要的誘導(dǎo)作用［1～3］。

1嗅鞘細(xì)胞的研究現(xiàn)狀

嗅鞘細(xì)胞從被發(fā)現(xiàn)到體外培養(yǎng)成功,再到能夠用于動物實驗研究及應(yīng)用于臨床研究,經(jīng)歷了漫長的時間。Devon和Doucete［4］于1992年首次證實嗅鞘細(xì)胞可在體外培養(yǎng)條件下形成髓鞘。嗅鞘細(xì)胞移植治療脊髓損傷是近10年發(fā)展起來的。Li等［5］報道嗅鞘細(xì)胞移植到受損的成年大鼠皮質(zhì)脊髓束可以促進軸突再生,脊髓功能得以改善。2000年Barnet［6］首次報道用術(shù)中切除的嗅球在體外培養(yǎng)并擴增人類嗅鞘細(xì)胞,并證明這些細(xì)胞生理功能良好,植入嚙齒動物脫髓鞘區(qū)域能髓鞘化軸突,且無致瘤性。近年從嗅黏膜中提取、純化培養(yǎng)嗅鞘細(xì)胞，以其獨特優(yōu)勢和臨床應(yīng)用價值，越來越受到重視。

2嗅鞘細(xì)胞的實驗取材方法

成年SD大鼠體重250～300g,腹腔麻醉后,消毒面部皮膚。經(jīng)一側(cè)鼻孔沿鼻腔向上至內(nèi)眥部剪開皮膚及鼻骨,暴露鼻中隔黏膜,用虹膜槍和眼科剪分離、剪取鼻中隔后三分之一嗅黏膜?？梢姳侵懈糇詈笊喜康男釁^(qū),呈黃色與呼吸道黏膜有較明顯的區(qū)別。將此嗅區(qū)鼻中隔(嗅黏膜和骨質(zhì))完整取下,在顯微鏡下將兩側(cè)的嗅黏膜自骨片上完整刮下,立即放入冰的DMEM抗生素液中(青霉素和鏈霉素各100IU/L)。有學(xué)者從后鼻孔和直接開顱進入鼻中隔，分離嗅黏膜。

3嗅黏膜細(xì)胞的體外培養(yǎng)

嗅黏膜取出后用F12培養(yǎng)基漂洗3次去除血跡后移至%胰酶中,用眼科剪充分剪碎并用吸管吹打,制成嗅黏膜混合細(xì)胞懸液,用培養(yǎng)基終止消化,離心、清洗去除胰酶，用含10%胎牛血清的F12培養(yǎng)基將細(xì)胞濃度調(diào)至1×106/ml,接種于無包被的玻璃培養(yǎng)皿,置CO2培養(yǎng)箱內(nèi)(37℃,5%CO2)培養(yǎng)。每2～3天換液一次。

當(dāng)將離體嗅黏膜制成細(xì)胞懸液后,細(xì)胞之間的平衡即被打破,接觸抑制及反饋調(diào)節(jié)機制亦被解除。細(xì)胞懸液中的神經(jīng)干細(xì)胞在其他細(xì)胞分泌的細(xì)胞因子和細(xì)胞外基質(zhì)的作用下,將進入細(xì)胞分裂、增殖周期。

整個培養(yǎng)過程,更換培養(yǎng)液也十分關(guān)鍵。嗅黏膜OECs貼壁生長時間較晚,一般在培養(yǎng)第5～6天才開始,不像嗅球OECs24h后就大量貼壁生長。所以在這段時間內(nèi)換液應(yīng)十分小心,盡量不要晃動培養(yǎng)液,以保持細(xì)胞沉淀,根據(jù)情況最好行1/3量換液或根據(jù)培養(yǎng)液的顏色添加培養(yǎng)液,以免丟失細(xì)胞。

純化：按改良Nash差速貼壁法在培養(yǎng)36～48h后,將培養(yǎng)液吸出,重新種植于包被多聚右旋賴氨酸的24孔細(xì)胞培養(yǎng)板內(nèi),進行純化培養(yǎng)。純化培養(yǎng)液中可加入20μmol/L的Forskolin和20μg/ml的BPE(bovinepituitaryextract)以促進細(xì)胞的生長培養(yǎng)14天,其間觀察細(xì)胞生長情況,間或攝片。成纖維細(xì)胞的生長可機械刮除亦可用5μmol/LArac處理24h來控制。Arac對OECS的生長也有抑制作用，故有學(xué)者也不主張使用。

是否純化的觀點：有部分學(xué)者認(rèn)為根據(jù)嗅黏膜細(xì)胞的社會學(xué)特性,即各種細(xì)胞之間存在著相互依存、相互誘導(dǎo)、相互制約的調(diào)節(jié)機制。嗅黏膜神經(jīng)干細(xì)胞和嗅鞘細(xì)胞體外培養(yǎng)時,不宜過早地純化細(xì)胞,混合細(xì)胞培養(yǎng)更有利于各細(xì)胞成分的分裂、增殖尤其是有利于神經(jīng)干細(xì)胞克隆球的形成。Shou等［7］將嗅上皮細(xì)胞與其基底細(xì)胞共培養(yǎng)發(fā)現(xiàn),后者能促進神經(jīng)前體細(xì)胞的增生,其實驗結(jié)果從另一側(cè)面證明了上述觀點。

4嗅黏膜細(xì)胞的免疫細(xì)胞化學(xué)染色

目前常用的染色方法主要有：Nestin染色、NSE染色、GFAP及p75NGFR染色等，體外培養(yǎng)的時間不同，免疫反應(yīng)陽性細(xì)胞形態(tài)亦不相同，成熟的嗅鞘細(xì)胞大多為梭形雙極細(xì)胞,突起細(xì)長,其走向具有明顯的方向性,細(xì)胞排列成束。

5原代培養(yǎng)嗅黏膜細(xì)胞的生長特點

嗅黏膜細(xì)胞接種于培養(yǎng)皿24h內(nèi)除少數(shù)球形細(xì)胞懸浮外,大部分細(xì)胞已貼壁,貼壁細(xì)胞多呈扁平多邊形,單層片狀生長。此后可見散在的球形細(xì)胞粘附于扁平細(xì)胞表面并分裂增殖,逐漸形成克隆球。于培養(yǎng)早期可見少數(shù)克隆球首先懸浮生長,幾天后貼壁生長并逐漸分化?？寺∏蛴?周內(nèi)生長較快,隨著球體增大其生長逐漸變慢,2周后直徑至1mm左右,球體不再生長,自克隆球周邊有球形細(xì)胞向外遷移,遷移出的細(xì)胞大多最終分化成梭形的嗅鞘樣細(xì)胞,細(xì)胞排列方向性較為一致;少數(shù)分化成嗅細(xì)胞樣細(xì)胞,胞體為卵圓形具有兩根突起。突起一根細(xì)長,多貼附于梭形細(xì)胞上,另一根較粗短,頂端隱約可見嗅毛。形態(tài)多為雙極或三級。

改良差速貼壁法細(xì)胞生長特點：一般細(xì)胞培養(yǎng)7～8天后,增殖最快,數(shù)量明顯增多,細(xì)胞成分以梭形(雙極)和多突起的大細(xì)胞為主,常呈成團生長,但聯(lián)系松散,生長缺少方向性。據(jù)報道［8］這些梭形和雙極細(xì)胞主要是OECs和嗅神經(jīng)元,有部分窩形細(xì)胞屬上皮細(xì)胞,大細(xì)胞可能是未分化的神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞。培養(yǎng)至14天以后的細(xì)胞,形態(tài)沒有大的變化,主要為雙極和梭形細(xì)胞,但數(shù)量往往開始減少，雜細(xì)胞占優(yōu)勢。Forskolin和BPE的應(yīng)用可以大大促進細(xì)胞的生長。雜細(xì)胞主要是成纖維細(xì)胞,也有明顯生長,需應(yīng)用Arac進行純化，或者采用機械刮除。改良差速貼壁法，培養(yǎng)至14天的OECs免疫組化染色結(jié)果表明,大部分雙極或梭形細(xì)胞呈GFAP或p75NGFR免疫反應(yīng)陽性。

6同其他干細(xì)胞的比較

干細(xì)胞移植治療中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病已經(jīng)有了較大進展,但是目前還存在一些問題有待解決:神經(jīng)干細(xì)胞的分化取決于神經(jīng)營養(yǎng)和生長因子、細(xì)胞因子、細(xì)胞外基質(zhì)分子、細(xì)胞黏附分子、細(xì)胞-細(xì)胞接觸和神經(jīng)變性等的作用。干細(xì)胞有可能使受損的腦組織建立神經(jīng)連接,但原發(fā)和繼發(fā)的損傷事件如中性粒細(xì)胞和巨噬細(xì)胞侵入、神經(jīng)元和膠質(zhì)細(xì)胞死亡將影響移植的干細(xì)胞的分化;雖然干細(xì)胞具有低免疫原性的特點,但仍存在異體移植排斥;不管是在體外培養(yǎng)條件下還是體內(nèi)環(huán)境下神經(jīng)干細(xì)胞都會有很大一部分分化成星形膠質(zhì)細(xì)胞,形成星形膠質(zhì)的瘢痕,使干細(xì)胞分裂、分化和遷移、并形成有功能的正常神經(jīng)元網(wǎng)絡(luò)是非常困難的。

骨髓間質(zhì)干細(xì)胞是具有多分化潛能的細(xì)胞,可分化為間質(zhì)組織,在特定的條件下可分化為神經(jīng)細(xì)胞、肝細(xì)胞、心肌細(xì)胞等非來源組織的細(xì)胞,具有類似胚胎細(xì)胞的多能性［9～11］,且取材方便,因而作為組織工程“種子細(xì)胞”有廣泛的應(yīng)用前景［12～15］，自體移植可以避免排斥反應(yīng)，但誘導(dǎo)分化有一定困難。

臍血干細(xì)胞也是一種具有多向分化潛能的原始干細(xì)胞，但存在異體移植的倫理道德，及誘導(dǎo)分化的技術(shù)困難問題。

嗅黏膜嗅鞘細(xì)胞移植具有以下的優(yōu)點：移植物來源方便、損傷小，通過活檢方法即能獲得所需的移植物，且并不影響嗅覺，(2)避免了異體移植所帶來的技術(shù)與道德問題。但是其純化培養(yǎng)的方法尚不成熟，需要進一步研究。

嗅黏膜嗅鞘細(xì)胞以其獨特的優(yōu)勢成為細(xì)胞移植領(lǐng)域研究的一個熱點，是一種具有臨床應(yīng)用價值的、十分具有潛力的移植物。但其培養(yǎng)純化技術(shù)仍不十分成熟，需要相關(guān)研究人員共同努力，使之更加完善，以造福

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