肽的人工合成

第六章

肽的人工合成1前言20世紀(jì)初，fischer創(chuàng)立蛋白質(zhì)的多肽結(jié)構(gòu)學(xué)說1932年，Bergmann采用芐氧羰酰基作為氨基保護(hù)基同時(shí)期Curtius創(chuàng)立酰氯法，疊氮法活化羧基的肽鍵生成法50年代初，Wieland等發(fā)展了活化酯法和混合酸酐法1953年，Vigneaud首次化學(xué)合成了多肽激素催產(chǎn)素1963年，Schwyzer合成24aa的促腎上腺皮質(zhì)激素(ACTH)1965年，我國合成51aa的牛胰島素1979年，矢島治明液相法合成牛胰RNaseA(124aa)80年代，Merrifield提出固相合成法；多肽合成儀不斷發(fā)展2第一節(jié)肽化學(xué)合成原理和液相合成基本步驟：

1.-氨基和-羧基以及側(cè)鏈的保護(hù)

2.羧基的活化和肽鍵的形成3.脫除保護(hù)基和純化

Z2Z1Z2Z1XNHCHCOOH+H2NCHCOOY

–H2O

XNHCHCO-NHCHCOOYZ3Z2Z1

脫保護(hù)XNHCHCOOH+H2NCHCO-NHCHCOOYZ3Z2Z1

縮合XNHCHCO-NHCHCO-NHCHCOOY保護(hù)基全脫除

三肽3一氨基酸保護(hù)基為了使肽鍵生成反應(yīng)能夠定向進(jìn)行，需要對(duì)氨基酸的各種官能團(tuán)進(jìn)行保護(hù)（一）-氨基保護(hù)基：常用：烷氧羰基、?；屯榛?CH2O-CO-HCH2O-CO-4（二）-羧基保護(hù)基保護(hù)基種類相對(duì)較少-羧基保護(hù)基種類：①鹽：鉀鹽、鈉鹽、三乙胺鹽、三丁胺鹽等鹽是對(duì)羧基的臨時(shí)性保護(hù)②酯：甲酯和乙酯、芐酯、叔丁酯(最常用）（三）側(cè)鏈的保護(hù)：20種aa中有13種側(cè)鏈需要保護(hù)Lys--NH2和側(cè)鏈羧基:選擇與-氨基和羧基不同的保護(hù)基

Cys-SH:甲基芐基、對(duì)氧芐基等（三氟乙酸鉈/TFA脫除)羥基aa(Ser,Thr,Tyr)：芐基、叔丁基酰胺基保護(hù)：2,4,6-三甲氧芐基等（可用TFA脫除）5二肽鍵生成法基本思路：使-羧基活化為RCOX形式，加強(qiáng)羰基碳原子的正電性，便于-氨基進(jìn)行親和攻擊而成肽（一）活化酯法：方法：采用巰基、烷基、酚基和N-羥胺類物質(zhì)（最常用：N,N’-二環(huán)乙基碳二亞胺，DCC)與N-保護(hù)aa作用，使-羧基活化為酯的形式，然后進(jìn)行成肽反應(yīng)。優(yōu)點(diǎn)：中間產(chǎn)物可以分離、結(jié)晶、保存，便于去除副產(chǎn)物氨基組分的末端羧基可以不保護(hù)對(duì)酰胺基活化特別有效6（二）縮合劑法：重要的縮合劑：DCC,DIC(二異丙基DCC）等DCC接肽反應(yīng)機(jī)理：-N=C=N-R-COOH-NH-C=N-OCOR-NH-CO-NH-N,N’-二環(huán)己基脲（DCU）RCO-NH-R’+H2N-R’R-COOH+(R-CO)2O對(duì)稱酸酐O-?；錒2N-R’DCC-NH-CO-NH-7（三）疊氮法：是最古老的經(jīng)典肽鍵生成法(1902年），該法最少引起消旋OOOR-C-OCH3

H2NNH2R-C-NHNH2

R’NO2

R-C-N3

（?；被狨ｋ拢；被岑B氮）

O

H2N-R’R-C-NH-R’+堿·HN3

堿8（四）混合酸酐法：50年代提出，簡單、反應(yīng)快、純度好，尤其適合小肽合成R1R1

Z-NH-CH-COOH

叔胺(Et3N)Z-NH-CH-COO-Et3+NHR1OORO-COClZ-NH-CH-C-O-C-ORH2N-R2

成肽（存在副反應(yīng)）9三脫保護(hù)基及純化（一）TFA法：方法：將產(chǎn)物置于三氟乙酸(TFA)中處理，以脫除保護(hù)基優(yōu)點(diǎn)：用于脫除一些不耐酸的保護(hù)基，溫和，副反應(yīng)少，尤其適合于固相合成法。曾用于胰高血糖素合成。缺點(diǎn)：TFA用量較大，需保護(hù)的氨基酸種類較多等（二）HF法：方法：以無水氟化氫(HF)在0~20C處理30~60min優(yōu)點(diǎn)：可脫除其他方法難以脫除的保護(hù)基，比TFA法有效缺點(diǎn)：HF腐蝕性強(qiáng)，脫除時(shí)副反應(yīng)較多（三）含硅試劑法、有機(jī)磺酸法等10四二硫鍵的生成是蛋白質(zhì)合成中最困難的工作經(jīng)典方法：空氣氧化法、碘氧化法，收率低，副反應(yīng)嚴(yán)重目前:①三氟乙酸鉈（(CF3COO)3Tl）法：可先裂解Cys的各種保護(hù)基，然后金屬鉈作為弱氧化劑催化二硫鍵的生成，效率是碘氧化法的2倍

②亞砜介導(dǎo)法（sulfoxid-directed):Cys亞砜和CysR’在酸處理下，生成的SH作用于亞砜的S原子，在亞砜位置處生成二硫鍵。用不同的Cys亞砜和酸處理，可在需要的位置定點(diǎn)生成二硫鍵。11五合成肽的純化和純度鑒定純化：凝膠過濾、離子交換層析、反向HPLC等鑒定：薄層層析、等電點(diǎn)聚焦、分析HPLC、質(zhì)譜法等12六肽的液相法合成策略與示例：小肽合成：逐步延長法(stepwiseelongation)，從C-端開始逐一合成，使肽鏈向N末端延長的方法大肽合成：片段縮合法(fragmentcondensation)，先分段合成小肽再縮合成大肽段，縮合時(shí)常用不易消旋的疊氮法片段縮合法策略：

①劃分肽段：長度一般不超過10個(gè)aa殘基盡可能以不易消旋的Gly、Pro等為肽的C-端aa和保護(hù)基性質(zhì)對(duì)肽段純化難異的影響構(gòu)象因素影響②選擇接肽順序：小片段分頭縮和大片段肽(有時(shí)很難或不能進(jìn)行)小片段逐一縮合(反應(yīng)步驟多但產(chǎn)率高)較大片段逐一縮合（常用)13

示例：牛胰RNaseA（124aa）的合成將RNaseA分成長短不一30個(gè)片段，分別以逐步延長法合成從肽的C-端開始，用疊氮法小片段依次接肽，得到保護(hù)的RNaseA（N-端為Z(芐氧?；?；C-端，OBzl(芐氧基)）Cys(對(duì)甲氧芐基，Mbzl)和Met亞砜的還原，得到還原型保護(hù)的RNaseA1mol/L三氟甲磺酸/TFA脫保護(hù)；巰基乙醇+二硫蘇糖醇；過SephadexG-25層析柱，得到去保護(hù)基的RNaseA在谷胱苷肽存在下空氣氧化形成二硫鍵，SephadexG-25，得到合成的RNaseA粗品(活力18.9%)經(jīng)過親和層析，產(chǎn)物活力81.3%CM-纖維素層析，得到離子交換層析純產(chǎn)物95%乙醇處理，得到牛胰RNaseA結(jié)晶，酶活力100%14第二節(jié)固相肽合成一、合成原理：

1963年，Merrifield將aa的C-端固定在不溶性樹脂上，然后在其上依次進(jìn)行氨基酸縮合，延長肽鏈?？朔艘合嗪铣煞ㄖ忻恳徊疆a(chǎn)物純化的困難，奠定了自動(dòng)化肽合成的基礎(chǔ)，為此，Merrifield于1984年獲得Nobel化學(xué)獎(jiǎng)固相法合成較之液相法簡單、快速，不需每步純化中間物固相法適合10~30aa的小肽，不流失但固相法合成肽的純度差，大肽或高純、大量小肽合成采用液相法（一）Boc固相法（經(jīng)典Merrifield法):因氨基保護(hù)基采用可用TFA脫除的Boc而得名;側(cè)鏈用芐醇類保護(hù)；樹脂為氯甲基化或羥甲基化聚苯乙烯,對(duì)乙酰氨基芐酯樹脂15方法：

Boc-NH-CHR1-COO-+Cl-CH2-樹脂①

C-末端aa與樹脂結(jié)合：

Boc-NH-CHR1-COO-CH2-樹脂

②用TFA法脫除N-Boc

CF3COO--+NH3-CHR1-COO-CH2-樹脂③三乙胺中和、洗滌NH2-CHR1-COO-CH2-樹脂

④在DCC存在下與Boc-aa耦聯(lián)，洗滌

Boc-NH-CHR2-CO-NH-CHR1-COO-CH2-樹脂⑤脫保護(hù)、重復(fù)接肽

Boc-NH-CHRn-CO-···-NH-CHR1-COO-CH2-樹脂⑥全部保護(hù)基脫除，HF法等目的肽16（二）Fmoc固相合成法：

Fmoc固相合成法的步驟與Boc固相合成法類似不同之處：氨基保護(hù)基為：可用堿(20%呱啶)脫除的芴甲氧羰基(Fmoc),側(cè)鏈保護(hù)基為：可以用TFA脫除的叔丁基樹脂：采用90%TFA可切斷的烷氧芐醇型或1%TFA可切斷的二烷氧芐醇型優(yōu)點(diǎn)：避免最終的強(qiáng)酸處理二、自動(dòng)肽合成儀：1966年，Merrifield等報(bào)道了最初的自動(dòng)肽合成儀一般以Boc或Fmoc固相合成法為基礎(chǔ)，將肽合成自動(dòng)化監(jiān)測：Fmoc有明顯的紫外吸收17第三節(jié)酶促肽合成和半合成一、基本原理：

利用蛋白水解酶催化肽鍵的形成優(yōu)點(diǎn)：反應(yīng)條件溫和；不引起aa消旋；不要求aa側(cè)鏈保護(hù)；副產(chǎn)物少，后處理較簡單1.酶促合成多肽的酶類：主要有四類：Ser蛋白水解酶；HS-蛋白水解酶；羧肽酶；金屬蛋白酶類2.對(duì)aa成分的選擇：為使反應(yīng)向肽鍵生成方向進(jìn)行18二酶合成反應(yīng)的幾個(gè)系統(tǒng)：為了使反應(yīng)定向進(jìn)行，將參與反應(yīng)的氨基組分的羧基端和羧基組分的氨基端保護(hù)為提高合成反應(yīng)效率，防止二次水解，創(chuàng)建一些特定的反應(yīng)系統(tǒng)，如：1.沉淀系統(tǒng)：降低產(chǎn)物溶解度，使其沉淀，防止水解如：Z-Phe-COOH+Z-Leu-NH2Z-Phe-Leu-NH2在凝乳酶(200mol/L)催化下，PH7反應(yīng)20hr，收率為70~80%。隨反應(yīng)進(jìn)行溶液逐步變褐色，黏稠化、最終完全固化2.二相系統(tǒng)：將緩沖液與有機(jī)溶劑攪拌成乳濁液（二相系統(tǒng)，水相一般占2~5%），底物和酶在水的懸滴中反應(yīng)，但生成的產(chǎn)物為脂溶性的。隨著反應(yīng)地進(jìn)行，產(chǎn)物自動(dòng)轉(zhuǎn)移至有機(jī)相中，不再與酶接觸。如：Z-Glu-COOH+Ala-ODPM