當(dāng)歸補血湯煮出汁激活成熟T淋巴細(xì)胞胞外信號控制激酶的研究

當(dāng)歸補血湯煮出汁激活成熟淋巴細(xì)胞胞外信號控制激酶的研究摘要:當(dāng)歸補血湯（D源自紫云英類和當(dāng)歸類植物根部。這種中藥煮出物已經(jīng)被證實能夠刺激淋巴細(xì)胞增殖然而這種激活的機理尚不得而知。在成熟淋巴細(xì)胞中，當(dāng)歸多糖的應(yīng)用能夠顯著誘導(dǎo)細(xì)胞的增殖白細(xì)胞介素的釋放以及胞外信號控制激（EK的磷酸化對E制劑的預(yù)處理阻止了D導(dǎo)免疫反應(yīng)另外，D多糖富集片段對成熟淋巴細(xì)胞具有顯著作用，這表明DBT多糖在制免疫應(yīng)中扮了重要色。關(guān)鍵詞當(dāng)歸補血湯，紫云英屬植物根部，當(dāng)歸類植物根部淋巴細(xì)胞，細(xì)胞原漿移動，ERK.1介紹在數(shù)以千計的中國傳統(tǒng)中草藥中當(dāng)歸僅由兩種草藥構(gòu)成。公元12中國人李東玉在其著《內(nèi)外傷編獲論中第一次記載了當(dāng)歸補血湯李認(rèn)為當(dāng)歸補血湯應(yīng)該包括以下內(nèi)容1錢紫云英根錢當(dāng)歸。一錢大約相當(dāng)于克。在傳。補血湯（D來提升她們的“氣（生命活力）并促進(jìn)血液循環(huán)。紫云英根作藥用因單，但對D兩種草藥復(fù)合作用機理尚未研究，這無。通過確定D的生化組成，我們得以確定一個最優(yōu)提取比例，有趣的是，這個比列與古代配方的比例R：RA是一致的。另外，在弄清了DTRA類衍生物：毛蕊，芒柄花素，R衍生物：阿魏酸，藁本內(nèi)酯的數(shù)量后，我們得以建立D標(biāo)準(zhǔn)。DB的免疫管理“氣”功能中的一種）是由這里決定的。之前的研究顯示D使用能夠刺激淋巴細(xì)胞的擴(kuò)散然而對這種刺激起作用的分子尚不得而知為了揭示這種古老草藥煮出汁的作用機理我們用D理成熟的淋巴細(xì)胞，之后分析了包括白細(xì)胞介素IL，，，，，101，巨噬細(xì)胞群落刺激因子（GM-馬干擾素，腫瘤壞死阿爾法因子以及胞外信號控制激酶等1中細(xì)胞因子。此外我們還鑒定了D糖的作用以及D導(dǎo)細(xì)胞因子釋放的信號通路。2材料與方法2.1與標(biāo)準(zhǔn)化我們于20收集來自中國陜西省的年生黃芪植物根部和來自甘肅省的年生的冬蟲夏草根部。將RSR以：的比例加入并在渦流中混勻而得到D將混合物與升水共煮兩小時并提取兩次提取的方法遵照古代配方進(jìn)行，此配方已被證實是最優(yōu)提取方法。R與R分離樣本也采用同樣的提取方法。用7醇處理D取物沉淀可以將D糖分割成富多糖片段和貧多糖片段兩部分。在40的離心加速度下離心20將這兩種片段分離開來。富集多糖片段占總干重的1將這兩種片段用凍干法干燥并在-氏度下保存。D標(biāo)準(zhǔn)化通過使用高效液相色譜法（HP）分析阿魏酸，毛蕊，芒柄花和HP試劑來自德國達(dá)姆施塔特地區(qū)（Darm司（Me。一套沃特斯（Wat）HP系統(tǒng)包括600泵717自動采樣（auto-s1pler見光電二極（UV/VISPhoto于全程分析的29檢測器色譜分離是用乙腈作為溶劑A以及0.作為溶劑B在DELTA柱（粒徑為4.7米，3.9mm150mm內(nèi)并在流速為1.0m以及室溫下進(jìn)行的。2.淋細(xì)胞的成熟與增殖試驗人類淋巴細(xì)胞來自Ficou-康血液細(xì)胞。純化的淋巴細(xì)胞在RPIM經(jīng)過兩次清洗再投入密度為100格共有96格的成熟盤。其中有六成的淋巴細(xì)胞是為了做XTT試驗的標(biāo)準(zhǔn)曲線而進(jìn)行培養(yǎng)的成熟的淋巴細(xì)胞分別用DBT,RARA物以及植物凝血素（P處理天。用2微升注射器將混合的X液注入每個方格中，在含空氣9二氧化碳5的飽和水溶液下經(jīng)過四小時培養(yǎng)使其成熟在4米條件下測量其吸光率。細(xì)胞數(shù)量由標(biāo)準(zhǔn)曲線決定。在阻礙試驗分能夠析中，MK制劑U0甲基亞砜溶解并于其他藥物加入前小時加入。用T為ERK。2.細(xì)胞素抗體試驗與ELISA成熟t淋巴細(xì)胞不同細(xì)胞分泌物的檢測由鐳射生物（RayBch簡要來說抗體對對抗不同的細(xì)胞活素后會在人造的細(xì)胞活素試驗器具上留下斑點用D理淋巴細(xì)胞天在試驗過程中持續(xù)加入10件培養(yǎng)液兩小時以測量細(xì)胞活素的分泌量再加入共軛生物素基本抗體一小時使用GenePixprofessio掃描可知碎片在55nm波下被激活并發(fā)散出565nm光波。使用GenP件分析成像，并按照之前試驗校準(zhǔn)的標(biāo)準(zhǔn)曲線為細(xì)胞活素定量。t淋巴細(xì)胞分泌的IL2,IL使用電子生物科學(xué)儀EL出。再將淋巴細(xì)胞用D理天。用1升注射器收集每議IL2,IL由ELISA造商測定。最終經(jīng)校核后可知盤中物質(zhì)吸光率為45nm2.4E測定用D成熟淋巴細(xì)胞各自處理，1，20304，60了分析抑制劑的作用，在加入藥劑前先讓所有成熟淋巴細(xì)胞的血清“挨餓”小時。在藥物處理結(jié)束后立即將細(xì)胞投入細(xì)胞溶解緩沖儀（125mlTris-HCL,2%SDS甘油，PH.8中的蛋白質(zhì)使用SDS-法進(jìn)行分析。在攝氏度的條件下用抗ER化抗體和ER處理1小時即可識別出已磷酸化的ERK12,免疫復(fù)合物用E分析。蛋質(zhì)含常用國工盒布德方行定統(tǒng)數(shù)據(jù)由版本的PRE實現(xiàn)：基本變量和控制變量的差異按學(xué)生測試的結(jié)果進(jìn)行劃分：P<0較顯著,P<0.01P<0非常顯著。3結(jié)果3.1DBT通過發(fā)現(xiàn)兩種化學(xué)標(biāo)記（毛蕊異黃酮和芒柄花）在R的數(shù)量和另外兩種化學(xué)標(biāo)記（阿魏酸和藁本）在R數(shù)量，我們能夠使最優(yōu)的D準(zhǔn)化。標(biāo)準(zhǔn)化的DBT當(dāng)是：每1克干DBT含0.186毛蕊，0.155異黃酮，0.351毫克阿魏酸和0.藁這符合我們先前的校準(zhǔn)[5提取效率的計算，我們發(fā)現(xiàn)D產(chǎn)量在這個重量比為3±％（n。這些參數(shù)為其余生化實驗確定化學(xué)標(biāo)準(zhǔn)和最佳D混合物。3.2B淋巴細(xì)胞再生為了揭示D能具有的免疫調(diào)節(jié)功能，將DR、RSRA+的液AS態(tài)提?。ㄏ雀髯灾蠓?，然后按5比例混合在一起）培養(yǎng)應(yīng)用到人類淋巴細(xì)胞，促使細(xì)胞增殖。各組都顯示對細(xì)胞的增殖有明顯的刺激效應(yīng)（如圖。為0.1克毫升，DBT顯示出的再。相比之下，增加R合液（先各自煮沸，對淋巴細(xì)胞增殖的促進(jìn)作用則小得多。圖1:RA,以及D提取物對淋巴細(xì)胞的成熟作用將不同劑量的DBT,R或者RASRA+待成熟的淋巴細(xì)胞處理天以P正面控制用百分?jǐn)?shù)的形式表示細(xì)胞的增殖并與沒有加入上述物質(zhì)的細(xì)胞做比較.3.3B淋巴細(xì)胞的細(xì)胞活素生成運用來自于DRARSR+R液態(tài)提取物，可以在天之內(nèi)創(chuàng)造出成熟的淋巴細(xì)胞。藥物催生的淋巴細(xì)胞釋放細(xì)胞活素（IL和L-4和IL和L和L和L-和10，3-擾素-c和腫瘤壞死因子-的藥物，是由細(xì)胞活素抗體排列所決定的。通過比較受控制的成熟細(xì)胞可以看出，IL-I2和L和L的量明顯受到D影響（如圖2。在四種細(xì)胞活素當(dāng)中，IL-2L和L的10示出相對D特殊性，即不受R，RASRA+導(dǎo)，因此它們被選來作進(jìn)一步分析。D處理會引起IL釋放量增加至倍，IL的放量增加至120和IL的量增加至2倍。有趣的是，用RAR一個簡單的R和R合物進(jìn)行處理，并不能改變的細(xì)胞活素的釋放量，這表明將兩種草本提取物煮沸是必不可少的環(huán)節(jié)。IL和L和L，3-，CSF干擾素-cTNF-水a(chǎn)不受DR，RASRA+的影響。IL-I2和L的量用酶聯(lián)免疫吸附測定法分析進(jìn)行量化。圖2和顯示經(jīng)D處理后細(xì)胞活素的釋放量的劑量反應(yīng)曲線。種細(xì)胞因子的反應(yīng)相當(dāng)類似，即都是在濃度為0.1m，誘導(dǎo)產(chǎn)生的釋放量最高；IL最大誘導(dǎo)生成量為倍，IL2倍，而IL1倍。通過對細(xì)胞活素排列分析結(jié)果進(jìn)行比較可以發(fā)現(xiàn)酶聯(lián)免疫吸附測定法分析的結(jié)果顯示了一個較低的數(shù)值，它能利用兩種不同的檢測系統(tǒng)的敏感性進(jìn)行計數(shù)。圖2胞因子陣列中加入條件培養(yǎng)液檢測含量不同的細(xì)胞因子B,C:ELA條件培養(yǎng)液進(jìn)行檢測得到的細(xì)胞因子數(shù)量白細(xì)胞介素IL-2IIL-10).3.4DBERK酸化E有絲分裂原激活蛋白激酶（M的一員，它在淋巴細(xì)胞增殖過程中發(fā)揮著關(guān)鍵信號的作用，E激活決定于產(chǎn)生D細(xì)胞。通過對磷酸化過的E其他所有E用抗體特效藥，我們揭示了在成熟T淋巴細(xì)胞中ERK1（4k和ER（4k的磷酸化過程：D應(yīng)用能使這兩種磷酸化作用增強（如圖3和。D用3分鐘之后，E磷酸化量最大，為先前的10倍，但對E激活是短暫的，處理6分鐘后就會完全回到活性較低的水平。T作為一個對照量被使用，能誘導(dǎo)ERK1磷化過程更加持續(xù)，這比D可靠D導(dǎo)的EK3分鐘時將被先前處理的成熟細(xì)胞完全阻（如圖3和。為了進(jìn)一步探討D免疫調(diào)節(jié)作用是否與ER的磷酸化有關(guān)，我們對在U0之前用D理過的淋巴細(xì)胞中的細(xì)胞活素釋放量進(jìn)行測試。D導(dǎo)的淋巴細(xì)胞增殖過程完全被U0（如圖。與此同時，由DBT誘導(dǎo)，IL，IL和6L-的10也被U0理所阻斷（如圖。這些結(jié)果有力地證明M制劑的預(yù)處理作用可以充分制止DT淋巴細(xì)胞的免疫調(diào)節(jié)作用，這顯示了E調(diào)解D免疫反應(yīng)的關(guān)鍵作用。圖3:誘導(dǎo)ERK酸化在加入B之前先讓淋巴細(xì)胞處于血清饑餓狀態(tài)小時。用特制抗體使全部的以及被磷酸化了的ERK放出來。使用T為正面控制。用密度標(biāo)定法確定由中所得的磷酸的數(shù)量磷酸法測定經(jīng)過處理后的成熟淋巴細(xì)胞的數(shù)量，二甲基亞砜作為對照。用密度標(biāo)定法確定由所得的磷酸的量。圖：D誘導(dǎo)免疫調(diào)節(jié)作用是借助ER完成的。淋巴細(xì)胞在處理前預(yù)裝了緩沖處理（0二甲基亞砜）或者是U0后用D理它天。用X檢測淋巴細(xì)胞的增殖，用EL定細(xì)胞因子數(shù)，如圖那樣。3.5是免疫的催化劑為了確定D內(nèi)中觸發(fā)上述免疫活性的活性成分，取兩小部分：多糖豐富（1％干重）和多糖耗盡（干重的8％。多糖豐富的一小部分，當(dāng)應(yīng)用到成熟淋巴細(xì)胞時，其免疫激活作用表現(xiàn)出明顯的增加。在濃度為5毫克毫升的多糖豐富的一小部分里，細(xì)胞增殖受刺激增加逾50，比多糖較少的部分高出倍（如圖5。與此同時，富含多糖的部分在刺激細(xì)胞活素釋放方面顯示了更高的激活效應(yīng)。在濃度為5毫克毫升的多糖豐富的一小部分里，釋放出的IL-2LIL-10增加了4倍，2倍和6倍，分別為（如圖5B相比之下，多糖少的部分只能輕微誘導(dǎo)細(xì)胞活素釋放。通過應(yīng)用多糖豐富的部分，成熟T淋巴細(xì)胞中的ERK14kDERK2（42kDa酸化程度均提高了（圖6和。類比D作用，在使用DBT多糖豐富部分3分鐘之后，E酸化量為最大誘導(dǎo)量的1倍。D糖的作用也完全被用U0理過的成熟細(xì)胞阻隔（如圖6和。相比之下，多糖少的部分則沒有在E磷酸化過程中顯示激活（圖6和。D信號通道。圖：D糖誘導(dǎo)淋巴細(xì)胞增殖以及細(xì)胞因子的釋放。淋巴細(xì)胞分別用富含多糖和不富含多糖的片段處理3天。：用百分?jǐn)?shù)表示的細(xì)胞增殖圖，富含與不富含的比較。BD用EL定的在條件培養(yǎng)液內(nèi)的細(xì)胞因子的釋放圖。圖：D糖誘導(dǎo)淋巴細(xì)胞中E磷酸化。將淋巴細(xì)胞分別用富含多糖片段和不富含多糖片段處理天。：用特定的抗體使總的和被磷酸化的ERK放。用T為正面控制用密度標(biāo)定法確定由中釋放的磷酸化的量用磷酸法測定中除之前用U0126預(yù)處理過小時之外的所有成熟淋巴細(xì)胞。用密度標(biāo)定法確定中的磷酸量。4討論DBT個古老的中藥煎劑配方，其R和R重量比為5相比R或RASRA+物（分開煮沸然后按5合在一起，D刺激成熟淋巴細(xì)胞方面效果要好得多。與這種功能相仿，細(xì)胞活素排列分析揭示了由于受D激，一組特定細(xì)胞活素包括IL-2LIL成熟的淋巴細(xì)胞釋放出來；細(xì)胞活素的釋放不是單單由R或者R抑或是RA+的。此外，成熟淋巴細(xì)胞中RA+激作用不夠，說明把這兩種草藥放在一起沸騰是必不可少的當(dāng)然，這種D制備方法長期以來一直為中醫(yī)師所推崇。除了淋巴細(xì)胞的效用正確的RR量比也已在乳腺癌巨噬細(xì)胞和成骨細(xì)用。為什么D要兩種藥草在5比例下一起煮沸？D發(fā)明者，李東垣，金代、元代（從1113）四大著名中醫(yī)之一，寫下的規(guī)定，也許這五的（古代中國的哲學(xué)書）的記載，地球代表五這個數(shù)字。因此，李認(rèn)為，當(dāng)R和RS5比時，DBT。釋DBT種獨特的生化功能。首先，DBT可能含純R或R取物更大數(shù)量的活性成分，R和RS一起煮沸可能提高了新化學(xué)物質(zhì)的溶解度，并且新化學(xué)物質(zhì)只溶于D這些額釋D特殊效用另一方面兩種草藥比例的最優(yōu)化能產(chǎn)，。，部分應(yīng)包含了D有效成分之一。根據(jù)這一路線，化學(xué)分析表明，D的多糖明顯高于R和R混合物種的多糖。此外，在D劑中也發(fā)現(xiàn)了高量的鐳衍生毛蕊，芒柄花素和R生阿魏酸。第二，D不同組成部分可能存在協(xié)同效應(yīng)這種協(xié)同效應(yīng)是不存在于單一的草藥提取物中。這個假設(shè)為這一事實所支持D活性不無法完全取決于多糖豐富的一小部分。目前，我們還沒有直接的證據(jù)說明為什么D需要兩種不同的草藥。巴細(xì)胞增殖具有重大影響，而這一影響，可能是I，I6和IL釋加的結(jié)果。M制劑阻斷細(xì)胞活素釋放以及淋巴細(xì)胞增殖能有力地支持了這一觀點細(xì)胞活素是一系列可溶性蛋白它們在先天免疫和適應(yīng)性免疫反應(yīng)的調(diào)節(jié)中發(fā)揮關(guān)鍵作用。在D特殊