雙向電泳詳解演示文稿

雙向電泳詳解演示文稿本文檔共70頁；當(dāng)前第1頁；編輯于星期日\11點30分（優(yōu)選）雙向電泳本文檔共70頁；當(dāng)前第2頁；編輯于星期日\11點30分應(yīng)用對象：蛋白質(zhì)混合物的分離運動方向：等電聚焦電泳（水平方向）-重點SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳（垂直方向）

本文檔共70頁；當(dāng)前第3頁；編輯于星期日\11點30分1994年Wilkin和Williams提出蛋白質(zhì)組這一概念后，蛋白質(zhì)組在生物學(xué)界得到了充分關(guān)注，而蛋白質(zhì)組的開門技術(shù)———雙向電泳由O’Farrell于1975年首次建立并成功地分離約1000個E.coli蛋白。本文檔共70頁；當(dāng)前第4頁；編輯于星期日\11點30分蛋白質(zhì)組學(xué)蛋白質(zhì)組學(xué)：研究一種生物或一種細(xì)胞組織內(nèi)全部蛋白質(zhì)組成及其活動規(guī)律的科學(xué)?？梢暈榉肿由飳W(xué)的大規(guī)模篩選技術(shù)，

目的在于：1.歸類細(xì)胞中的蛋白質(zhì)的整體分布；2.鑒定并分析感興趣的個別蛋白；3.最終闡明它們的關(guān)系與功能。本文檔共70頁；當(dāng)前第5頁；編輯于星期日\11點30分蛋白質(zhì)組分析的首要要求將來自于全細(xì)胞、組織或生物體中所包含的多達(dá)幾千種混合蛋白質(zhì)進(jìn)行分離、檢測和分析。雙向電泳技術(shù)依然是大多數(shù)蛋白質(zhì)組研究中分離復(fù)雜蛋白質(zhì)混合物的首選技術(shù)。對于蛋白質(zhì)組學(xué)的研究來說，它的最基本的實驗手段就是利用雙向凝膠電泳在整個基因組水平上檢測蛋白質(zhì)表達(dá)的情況。本文檔共70頁；當(dāng)前第6頁；編輯于星期日\11點30分雙向電泳(2DE/DIGE)實驗組和對照組樣品制備提出生物學(xué)問題凝膠圖像分析差異蛋白點選取蛋白酶解及質(zhì)譜分析差異蛋白點的成功鑒定生物學(xué)問題的解釋蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)流程

本文檔共70頁；當(dāng)前第7頁；編輯于星期日\11點30分本文檔共70頁；當(dāng)前第8頁；編輯于星期日\11點30分雙向電泳技術(shù)應(yīng)用中的關(guān)鍵步驟：1、樣品制備（蛋白提取）：（1）細(xì)胞培養(yǎng)、處理和收集；（2）將細(xì)胞在IEF裂解緩沖液中溶解；（3）將樣品離心以去除不溶的細(xì)胞碎片和DNA，提取

上清，-80℃保存。2、蛋白質(zhì)定量和上樣：（1）固相PH梯度干膠條（immobiline

PH

Gradient,IPG）水化、等電聚焦；（2）IPG的平衡；（3）SDS；(4)蛋白質(zhì)檢測：考馬斯亮蘭染色或銀染色；3、圖像分析及數(shù)據(jù)處理：

將染色后凝膠放在光密度掃描儀上，掃描后的圖像用PDQUEST2DE軟件分析，選擇部分匹配的蛋白質(zhì)斑點進(jìn)行比較。本文檔共70頁；當(dāng)前第9頁；編輯于星期日\11點30分雙向電泳的作用和地位雙向電泳（two-dimensionalgelelectrophoresis,2-DE）是一種分析從細(xì)胞、組織或其他生物樣本中提取的蛋白質(zhì)混合物的有力手段，是目前唯一能將數(shù)千種蛋白質(zhì)同時分離與展示的分離技術(shù)，其高分辨率、高重復(fù)性和兼具微量制備的性能是其他分離方法所無與倫比的。雙向電泳技術(shù)、計算機(jī)圖像分析與大規(guī)模數(shù)據(jù)處理技術(shù)以及質(zhì)譜技術(shù)被稱為蛋白質(zhì)組研究的三大基本支撐技術(shù)。本文檔共70頁；當(dāng)前第10頁；編輯于星期日\11點30分雙向電泳定義

雙向電泳（two-dimensionalelectrophoresis)是

一種平板電泳技術(shù)，是等電聚焦膠電泳和SDS的組合，即先進(jìn)行等電聚焦電泳（按照PI分離），然后再進(jìn)行SDS(按照分子大?。瑯悠分械牡鞍捉?jīng)過等電點和分子質(zhì)量的兩次分離后，可以得到分子的等電點、分子質(zhì)量和表達(dá)量等信息。

本文檔共70頁；當(dāng)前第11頁；編輯于星期日\11點30分由于2DE是依據(jù)蛋白質(zhì)的兩種不同性質(zhì)，即等電點和分子量進(jìn)行分析，因此分辨率遠(yuǎn)高于其它任何一種單一的電泳方法，是目前分析混合蛋白質(zhì)樣品最有效的手段。另外，經(jīng)染色得到的電泳圖，是個二維分布的蛋白質(zhì)圖并且雙向電泳分離的結(jié)果是蛋白質(zhì)呈現(xiàn)斑點狀而不是條帶狀。本文檔共70頁；當(dāng)前第12頁；編輯于星期日\11點30分膠性PH9中電加解入質(zhì)了溶雙液

PH3加上電場后建立穩(wěn)定PH梯度蛋白質(zhì)溶液加入，建立電場染色后，蛋白質(zhì)因PI值不同，沿PH梯度分離開第一向等電聚焦PI逐漸降低等電聚焦膠放在SDS－聚丙烯酰胺凝膠上

第二向SDS－聚丙烯酰胺凝膠電泳分子量逐漸降低PI逐漸降低

雙向凝膠電泳示意圖本文檔共70頁；當(dāng)前第13頁；編輯于星期日\11點30分本文檔共70頁；當(dāng)前第14頁；編輯于星期日\11點30分本文檔共70頁；當(dāng)前第15頁；編輯于星期日\11點30分2DE儀器系統(tǒng)恒溫水浴垂直板電泳儀（第二向）電源等電聚焦儀（第一向）本文檔共70頁；當(dāng)前第16頁；編輯于星期日\11點30分雙向電泳的優(yōu)缺點優(yōu)點：根據(jù)電荷差異和分子大小分離蛋白，因此能分離分子電荷相同但分子大小不同或者同分異構(gòu)體（分子量相同但構(gòu)象不同）以及經(jīng)過翻譯后修飾的蛋白（如電荷數(shù)不同的磷酸化蛋白和非磷酸化蛋白，在雙向電泳膠上出現(xiàn)一串水平斑點）。缺點：不能分離疏水性及強(qiáng)酸強(qiáng)堿性蛋白；不能分離低豐度蛋白；靈敏度受樣品量限制及染色效果影響；不能完全自動化，耗時較長。本文檔共70頁；當(dāng)前第17頁；編輯于星期日\11點30分雙向電泳經(jīng)典工作流程1、樣品制備的基本步驟：⑴破碎、⑵沉淀、⑶溶解、⑷去除雜質(zhì)2、等電聚焦電泳3、兩維間的平衡4、SDS—PAGE電泳5、染色6、結(jié)果分析本文檔共70頁；當(dāng)前第18頁；編輯于星期日\11點30分樣品處理

一般性原則：樣品制備是雙向電泳中最為關(guān)鍵的一步，這一步處理的好壞將直接影響2-DE結(jié)果。目前并沒有一個通用的制備方法，盡管處理方法是多種多樣，但都遵循幾個基本的原則：1.盡可能的提高樣品蛋白的溶解度，抽提最大量的總蛋白，減少蛋白質(zhì)的損失；2.減少對蛋白質(zhì)的人為修飾；3.破壞蛋白質(zhì)與其他生物大分子的相互作用，并使蛋白質(zhì)處于完全變性狀態(tài)。本文檔共70頁；當(dāng)前第19頁；編輯于星期日\11點30分樣品制備的基本步驟破碎——最小限度的減少蛋白水解和其它形式的蛋白降解原則

機(jī)械破碎搗碎法、研磨法、勻漿法

物理破碎溫度差破碎法、壓力差破碎法、超聲波破碎法

化學(xué)破碎有機(jī)溶劑：甲苯、丙酮、丁醇、氯仿表面活性劑：Triton、Tween酶促破碎自溶法、外加酶制劑法本文檔共70頁；當(dāng)前第20頁；編輯于星期日\11點30分沉淀蛋白——可溶性是關(guān)鍵

硫酸銨沉淀法三氯乙酸(TCA)沉淀法丙酮沉淀法TCA-丙酮沉淀法醋酸銨沉淀法

本文檔共70頁；當(dāng)前第21頁；編輯于星期日\11點30分樣品的溶解——是2-DE成功分離蛋白質(zhì)的最關(guān)鍵因素之一

樣品的溶解直接關(guān)系到分離的分辨率，為使盡可能多的蛋白質(zhì)溶解，必須完全破壞分子間的相互作用，把蛋白質(zhì)復(fù)合物解聚和變性為單體形式，使其在整個分離過程以多肽鏈形式存在，同時要避免對蛋白質(zhì)的任何化學(xué)修飾。本文檔共70頁；當(dāng)前第22頁；編輯于星期日\11點30分溶解的目標(biāo)：1、樣品中非共價結(jié)合的蛋白質(zhì)復(fù)合物和聚積體完全破壞，從而形成各個多肽的溶解液（否則樣品中結(jié)合牢固的蛋白復(fù)合物可能使2-DE中出現(xiàn)新的蛋白點，相應(yīng)的表示單個多肽的點的強(qiáng)度會下降）2、溶解方法必須允許可能干擾2-DE分離的鹽、脂類、多糖和核酸等物質(zhì)的去除3、溶解方法要保證樣品在電泳過程中保持溶解狀態(tài)本文檔共70頁；當(dāng)前第23頁；編輯于星期日\11點30分增加樣品溶解性的手段一些疏水蛋白尤其是膜蛋白很難溶解，為了促進(jìn)其溶解，常加入一些增溶劑如變性劑、表面活性劑、還原劑等。1.變性劑：通過改變?nèi)芤褐械臍滏I結(jié)構(gòu)使蛋白質(zhì)充分伸展，將其疏水中心充分暴露，降低接近疏水殘基的能量域。其典型代表是尿素和硫尿。尿素是2D中最常用的變性劑，其作用是可逆的，在凝膠中的濃度必需保持在8mol/L以上。過低則達(dá)不到完全溶解樣品的目的，當(dāng)尿素與硫脲結(jié)合使用時，極大地提高了膜蛋白的溶解。由于硫脲難溶于水，高濃度的尿素能促進(jìn)硫脲的溶解，因此2mol/L硫脲常在5-7mol/L尿素濃度下使用，硫脲濃度大于2mol/L會降低等電聚焦(IEF)分辨率。本文檔共70頁；當(dāng)前第24頁；編輯于星期日\11點30分2.表面活性劑：

經(jīng)過變性劑處理而暴露蛋白質(zhì)的疏水基團(tuán)后，還常需至少一種表面活性劑來溶解疏水基團(tuán)。強(qiáng)離子型去垢劑如SDS會影響蛋白所帶的電荷，不適合在等電聚焦中使用，因此盡量選用非離子型或兩性離子表面活性劑，從而保證蛋白質(zhì)僅依靠其自身的電荷進(jìn)行移動，其中CHAPS和SB3-10最好。3.還原劑：

在變性劑和表面活性劑聯(lián)用條件下，加用還原劑可使已變性的蛋白質(zhì)展開更完全，溶解更徹底。常用含自由巰基的DTT或β-巰基乙醇，以及不帶電荷的三丁基膦（TBP)進(jìn)行還原。本文檔共70頁；當(dāng)前第25頁；編輯于星期日\11點30分4.起載體作用的兩性電解質(zhì)

即便在變性劑和表面活性劑存在的情況下，某些蛋白質(zhì)也需要在鹽離子作用下才能保持其處于溶解狀態(tài)，否則這些蛋白質(zhì)在其處于PI點時會發(fā)生沉淀。

Carrierampholytes的作用于捕獲樣品中的少量鹽分，從而保證蛋白質(zhì)的溶解性。應(yīng)用時，兩性電解質(zhì)的濃度應(yīng)小于0.2%（W/V)。濃度過高會使IEF的速度降低。另外，為了保證實驗的精確性，在選擇不同PH范圍的IPG膠條時，也應(yīng)使兩性電解質(zhì)的pH值與之相符合。本文檔共70頁；當(dāng)前第26頁；編輯于星期日\11點30分去除雜質(zhì)——關(guān)鍵是盡量不丟失蛋白和減少蛋白修飾在樣品中常常會含有像核酸、多糖、去污劑和代謝物等非蛋白雜質(zhì)，需要去除，否則會影響雙向電泳的結(jié)果，這個過程有時會造成蛋白的丟失以及蛋白的化學(xué)修飾和解聚，特別是后者會導(dǎo)致雙向電泳圖譜中蛋白點的增多（由于電荷的改變），所以操作中要多加注意。1.核酸的清除對電泳的影響：增加樣品粘度、與蛋白質(zhì)形成復(fù)合物后會出現(xiàn)假象遷移和條紋。解決的方法：用適量純的不含蛋白酶的核酸內(nèi)切酶進(jìn)行降解，或是利用合成載體兩性電解質(zhì)（SCA)同核酸結(jié)合形成復(fù)合物的能力，再通過超速離心來去除復(fù)合物。2.多糖的清除對電泳的影響：帶負(fù)電的多糖會與蛋白形成復(fù)合物導(dǎo)致拖尾影響聚焦。解決的方法：利用超離心和高pH,高離子強(qiáng)度和TCA等沉淀法。本文檔共70頁；當(dāng)前第27頁；編輯于星期日\11點30分3.去污劑的清除對電泳的影響：SDS能與蛋白形成帶負(fù)電的復(fù)合物，對等電聚焦影響大，需要清除。解決的方法：用含載體的兩性電解質(zhì)或兩性離子去污劑（CHAPS、TritonX-100或NP-40)溶脹液稀釋，或者丙酮沉淀法。4.鹽離子和外源帶電小分子的清除對電泳的影響：樣品中的鹽會增加凝膠條的電導(dǎo)，使其無法達(dá)到設(shè)置的電流，從而影響蛋白質(zhì)聚焦，帶電小分子會引起水的流動，使膠條的一端腫脹而另一端變干，導(dǎo)致兩端的酸、堿性蛋白無法聚焦，造成拖尾或丟失。解決的立法：常用透析去除鹽成份，TCA-丙酮沉淀法可以清除小分子。本文檔共70頁；當(dāng)前第28頁；編輯于星期日\11點30分定義：等電聚焦電泳是一種利用有pH值梯度的介質(zhì)，

分離等電點不同的蛋白質(zhì)的電泳技術(shù)。

將等電點不同的蛋白質(zhì)混合物加入有pH值梯度的凝膠介質(zhì)中，在電場內(nèi)經(jīng)過一段時間后，各組分將分別聚焦在各自等電點相應(yīng)的pH值位置上，最后，樣品的各組分在各自的等電點聚焦成一條清晰而穩(wěn)定的窄帶。

06-05凈電荷與PH的關(guān)系曲線

第一向分離等電聚焦電泳本文檔共70頁；當(dāng)前第29頁；編輯于星期日\11點30分等電聚焦電泳進(jìn)行過程中等電聚焦電泳結(jié)束后（－）（－）高pH高pH低pH低pH本文檔共70頁；當(dāng)前第30頁；編輯于星期日\11點30分

等電聚焦原理蛋白質(zhì)是兩性分子，在不同的pH環(huán)境中可以帶正電荷、負(fù)電荷或不帶電荷。對每個蛋白質(zhì)來說都有一個特定的pH，此時蛋白質(zhì)的靜電荷為零，此pH值即該蛋白質(zhì)的等電點(pI)。將蛋白質(zhì)樣品加載至pH梯度介質(zhì)上進(jìn)行電泳時，它會向與其所帶電荷相反的電極方向移動。在移動過程中，蛋白分子可能獲得或失去質(zhì)子，并且隨著移動的進(jìn)行，該蛋白所帶的電荷數(shù)和遷移速度下降。當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)遷移至其等電點pH位置時，其凈電荷數(shù)為零，在電場中不再移動。聚焦是一個與pH相關(guān)的平衡過程：蛋白質(zhì)以不同的速率靠近并最終停留在它們各自的pI值；在等電聚焦過程中，蛋白質(zhì)可以從各個方向移動到它的恒定位點。本文檔共70頁；當(dāng)前第31頁；編輯于星期日\11點30分

等電聚焦的特點優(yōu)點：1.有很高的分辨率，可將等電點相差0.01～0.02PH單位的蛋白質(zhì)分開；2.一般電泳由于受擴(kuò)散作用的影響，隨著時間和所走距離加長，區(qū)帶越走越寬，而電聚焦能抵消擴(kuò)散作用，時間越長，聚焦的區(qū)帶就越集中，越狹窄，因而提高了分辨率；3.由于這種電聚焦作用，不管樣品加在什么部位，都可聚焦到其等電點處，很稀的樣品也可進(jìn)行分離；4.可直接測出蛋白質(zhì)的等電點，其精確度可達(dá)0.01PH單位。本文檔共70頁；當(dāng)前第32頁；編輯于星期日\11點30分缺點：1.電聚焦要求用無鹽溶液，而在無鹽溶液中蛋白質(zhì)可能發(fā)生沉淀，2.樣品中的成分必需停留于其等電點，不適用于在等電點時發(fā)生沉淀或變性的蛋白質(zhì)本文檔共70頁；當(dāng)前第33頁；編輯于星期日\11點30分等電聚焦電泳三種系統(tǒng)

根據(jù)第一向等電聚焦條件的不同，可將2DE分為三種系統(tǒng)：1.

第一種系統(tǒng)：是在聚丙烯酰胺凝膠中進(jìn)行，在外加電場作用下,兩性電解質(zhì)在管膠內(nèi)建立pH梯度，隨著聚焦時間的延長，pH梯度不穩(wěn)，易產(chǎn)生陰極漂移,同時重復(fù)性差，上樣量低；2.第二種系統(tǒng)：第一向電泳,IPG通過immobiline共價偶聯(lián)于丙烯酰胺產(chǎn)生固定的pH梯度，該系統(tǒng)PH梯度穩(wěn)定，不依賴于外加電場，無論是重復(fù)性和上樣量均優(yōu)于第一種系統(tǒng)；3.第三種是非平衡PH梯度電泳，主要用于分離堿性蛋白質(zhì)，電泳展開時間相對比較短。本文檔共70頁；當(dāng)前第34頁；編輯于星期日\11點30分固相pH梯度等電聚焦電泳技術(shù)

固相pH梯度等電聚焦是80年代建立起來的一種等電聚焦技術(shù)。固相pH梯度等電聚焦比傳統(tǒng)等電聚焦具有更高的分辨率，更大的上樣量，其分辨率可達(dá)到0.001pH，是目前分辨率最高的電泳方法之一。本文檔共70頁；當(dāng)前第35頁；編輯于星期日\11點30分固相pH梯度的建立固相pH梯度等電聚焦技術(shù)的突破要歸功于Immobilines試劑（AmershamPharmaciaBiotech,APB）的基礎(chǔ)上開發(fā)的固相pH梯度（IPG）技術(shù)。Immobilines（固相試劑）是一系列性質(zhì)穩(wěn)定的具有弱酸弱堿性質(zhì)的丙烯酰胺衍生物，與丙烯酰胺和甲叉雙丙烯酰胺有類似的聚合行為。每個分子都有一個單一的酸性或堿性緩沖基團(tuán)與丙烯酰胺單連，其結(jié)構(gòu)式為：

其中R包含羧基或叔氨基團(tuán)，分子一端的雙鍵可以在聚合過程中共價鍵合鑲嵌到聚丙烯酰胺介質(zhì)中,所以它是固相的，即使是在電場中也不會漂移。分子另一端的R基團(tuán)為弱酸或弱堿性的緩沖基團(tuán)，利用緩沖體系滴定終點附近一段pH范圍就可形成近似線性的分布在pH3～10范圍的緩沖體系。

本文檔共70頁；當(dāng)前第36頁；編輯于星期日\11點30分所以固相pH梯度與載體兩性電解質(zhì)pH梯度的區(qū)別在于前者的分子不是兩性分子，在凝膠聚合時候便形成pH梯度，不隨環(huán)境電場條件的改變而改變，后者是兩性分子，在電場中遷移到自己的等電點后才形成pH梯度。本文檔共70頁；當(dāng)前第37頁；編輯于星期日\11點30分固相pH梯度聚丙烯酰胺凝膠基質(zhì)結(jié)合緩沖基團(tuán)

本文檔共70頁；當(dāng)前第38頁；編輯于星期日\11點30分在固相pH梯度的發(fā)展中，為了改善結(jié)果，簡化操作，把IPG膠灌到塑料支持膜上形成商品化的固定干膠條，即IPG膠條。固定干膠條（immobilinePHgradients,IPG）的概念：膠條由基質(zhì)和聚丙烯酰胺形成一個整體，PH梯度的產(chǎn)生是由酸性和堿性基團(tuán)與聚丙烯酰胺以梯度式共價鍵連接而形成。即使在電場中，它也是“固相”的。本文檔共70頁；當(dāng)前第39頁；編輯于星期日\11點30分不同pH范圍膠條不同長度、多種窄pH范圍膠條可選，尤其是1個pH范圍pH7-11NL堿性膠條本文檔共70頁；當(dāng)前第40頁；編輯于星期日\11點30分寬pH、窄pH范圍膠條寬pH梯度膠條應(yīng)用: 整個蛋白圖譜窄pH梯度膠條應(yīng)用: 提高分辨率 增加樣品上樣量 檢測分析更多蛋白pH345678910456789本文檔共70頁；當(dāng)前第41頁；編輯于星期日\11點30分提高分辨率:斑點顯現(xiàn)IPG4-7IPG5-6IPG4-7MouseliverproteinsFromA.G?rgetal.(1999)本文檔共70頁；當(dāng)前第42頁；編輯于星期日\11點30分不同長度的膠條7cm11cm

13cm18cm24cm本文檔共70頁；當(dāng)前第43頁；編輯于星期日\11點30分小尺寸膠條的電泳時間短，可用于優(yōu)化樣品制備等預(yù)實驗；而大尺寸膠條的電泳時間長，用于對復(fù)雜樣品進(jìn)行更為徹底的分析并鑒定出感興趣蛋白。本文檔共70頁；當(dāng)前第44頁；編輯于星期日\11點30分線形與非線形膠條linear(L)nonlinear(NL)由于生物體中大部分蛋白等電點在pH4-8之間，線性寬pH范圍的膠條可以在同一塊膠上顯示樣品中絕大多數(shù)蛋白，但大量的蛋白點都集中在膠條的中間，兩端的蛋白點較少，從而造成中間部分的分辨率低。非線性膠條將pH4-8之間的距離相對拉大，而兩端pH范圍的距離相對縮短，因此可以較好的分離大部分pH4-8的蛋白質(zhì)。本文檔共70頁；當(dāng)前第45頁；編輯于星期日\11點30分IPGIEF中pH梯度的選擇常用方法：先寬后窄，先線性后非線性，先短后長，預(yù)試驗確定。本文檔共70頁；當(dāng)前第46頁；編輯于星期日\11點30分Immobiline?干膠條的特性1.可重復(fù)性2.無梯度漂移,真正的平衡方法3.可分離酸性和堿性蛋白4.容納蛋白樣本量更多5.水平和垂直SDS凝膠中都能使用6.允許樣本水化上樣7.機(jī)械強(qiáng)度和尺寸穩(wěn)定8.易操作9.易于對樣本跟蹤標(biāo)記本文檔共70頁；當(dāng)前第47頁；編輯于星期日\11點30分IPG膠條的水化商品化的膠條使用前是以干膠條的形式和塑料支持薄膜粘在一起，加樣前需要先撕去薄膜在重泡漲液中泡脹，使其重性水化膨脹成凝膠，其中孔徑擴(kuò)張至最大，使樣品能夠充分進(jìn)入凝膠內(nèi)，完成上樣。重胞脹液的成分是：8mol/L

urea，2%CHAPS，18mmol/LDTT,0.5%IPGBuffer,痕量溴酚藍(lán).重泡脹在等電聚焦盤內(nèi)進(jìn)行。泡脹的實質(zhì)：是讓樣品能完全以可溶性的形式進(jìn)入IPG內(nèi)，從而能進(jìn)行接下來的IEF。重泡脹時間：至少10h,12-16小時，泡脹不充分會影響相對分子量較高的蛋白質(zhì)的吸收。本文檔共70頁；當(dāng)前第48頁；編輯于星期日\11點30分等電聚焦實驗步驟一．

加樣品水化1.用樣品溶解緩沖液溶解樣品。蛋白質(zhì)上樣濃度不要超過10mg/ml，否則會造成蛋白質(zhì)的集聚或沉淀。2.吸取適量(見表)含有樣品的水化液放入標(biāo)準(zhǔn)型膠條槽中，為確保樣品充分進(jìn)入膠條中，不要加入過量的水化液。本文檔共70頁；當(dāng)前第49頁；編輯于星期日\11點30分IPG膠條所需水化液體積膠條長度（cm)每條需水化液體積（ul)712511200132501835024450本文檔共70頁；當(dāng)前第50頁；編輯于星期日\11點30分3.從酸性端（尖端）一側(cè)剝?nèi)PG膠條的保護(hù)膜，膠面朝下，先將IPG膠條尖端(陽性端)朝標(biāo)準(zhǔn)型膠條槽的尖端方向放入膠條槽中，慢慢下壓膠條，并前后移動，避免生成氣泡，最后放下IPG膠條平端(陰極)，使水化液浸濕整個膠條，并確保膠條的兩端與槽的兩端的電極接觸。4.IPG膠條上覆蓋適量ImmobilineDryStrip覆蓋油，蓋上蓋子。5.將標(biāo)準(zhǔn)型膠條槽的尖端背面電極與IPGphor儀器的陽極平臺接觸；膠條槽的平端背面電極與IPGphor儀器的陰極平臺接觸。6.設(shè)置IPGphor儀器運行參數(shù)：IPG膠條水化的電壓，溫度和時間；等電聚焦電泳時的梯度電壓和溫度。本文檔共70頁；當(dāng)前第51頁；編輯于星期日\11點30分本文檔共70頁；當(dāng)前第52頁；編輯于星期日\11點30分聚焦時間的優(yōu)化理論上講，要獲得最好的圖譜質(zhì)量和重復(fù)性所需最佳時間是IEF分離達(dá)到穩(wěn)定態(tài)所需的時間。聚焦時間太短，會導(dǎo)致水平和垂直條紋的出現(xiàn)。過度聚焦雖然不會導(dǎo)致蛋白質(zhì)向陰極漂移，但會因為活性水轉(zhuǎn)運而導(dǎo)致過多水在IPG膠表面滲出（電滲）而造成蛋白圖譜變性，在膠條堿性端產(chǎn)生水平條紋以及蛋白丟失。最佳時間的確定需要根據(jù)不同蛋白樣品、上樣量、pH范圍和膠條長度通過經(jīng)驗來確定。本文檔共70頁；當(dāng)前第53頁；編輯于星期日\11點30分等電聚焦電壓設(shè)置低壓水化：50V-12h緩慢升壓除鹽：100V-1h，200V-1h，500V-1h，1000V-1h，1000-10000V-1h高壓聚焦：10000V-10h低壓維持：500V-nh等電聚焦的電壓上升分為三個階段：1.首先加上一個比較低的電壓，去除膠條中過多的鹽離子；2.然后開始加高電壓，電壓上升的模式為緩慢上升；3.最后是持續(xù)高壓，電壓上升的模式為快速上升。本文檔共70頁；當(dāng)前第54頁；編輯于星期日\11點30分IEF的基本條件Stemp1Stemp2Stemp3totalvoltageTimeVolt-HoursRamp25020min－－－Linear400040002hr－－－－－－10,000V-hrLinearRapid5hr14,000V-hr7cmStemp1Stemp2Stemp3totaltotalStemp1Stemp2Stemp311cm17cm25025080001000010000800020min20min2.5hr2.5hr－－－－－－－－－－－－－－－－－－20,000V-hr40,000V-hr～30,000V-hr～50,000V-hr5.3hr7hrLinearLinearLinearLinearRapidRapid本文檔共70頁；當(dāng)前第55頁；編輯于星期日\11點30分TheIPGphor?Platform本文檔共70頁；當(dāng)前第56頁；編輯于星期日\11點30分兩維間的平衡一維結(jié)束后可馬上進(jìn)行二維電泳，也可保存在兩片塑料膜間于-80℃保存數(shù)月。但在二維電泳前一定要進(jìn)行膠條的平衡，以便于被分離的蛋白質(zhì)與SDS完整結(jié)合，從而在SDS中電泳能順利進(jìn)行。平衡過程會導(dǎo)致蛋白丟失約5%-25%，還會使分辨率降低，平衡30min,蛋白帶變寬40%，縮短平衡時間可以減少擴(kuò)散，但時間太短時蛋白質(zhì)沒有被SDS充分包裹，容易產(chǎn)生水平條紋。同時會減少向第二向的轉(zhuǎn)移，所以平衡時間要充分長（至少2×10min),但不要超過2×15min。本文檔共70頁；當(dāng)前第57頁；編輯于星期日\11點30分IPG膠條的平衡—兩步平衡目的：是使蛋白質(zhì)與SDS充分的相互作用，使蛋白質(zhì)根據(jù)

分子量大小而進(jìn)行第二向遷移。

SDS電泳前,采用兩步平衡法平衡母液:1.2%SDS；2.50mMTris-HClpH8.8；

3.6Murea,30%glycerol；

甘油和尿素降低電內(nèi)滲作用，有利于蛋白從第一向到

第二向的轉(zhuǎn)移。

本文檔共70頁；當(dāng)前第58頁；編輯于星期日\11點30分

第一步平衡在平衡液中加入DTT，使變性的非烷基化的蛋白處于還原狀態(tài)；第二步平衡步驟中加入碘乙酰胺，使蛋白質(zhì)巰烷基化，防止它們在電泳過程中重新氧化，碘乙酰胺并且能使殘留的DTT烷基化(銀染過程中，去除多余的DTT,DTT會導(dǎo)致點拖尾”pointstreaking”)。將IPG膠條輕輕潤洗，并去除多余的平衡緩沖液，然后放入第二向SDS膠中。本文檔共70頁；當(dāng)前第59頁；編輯于星期日\11點30分第二向分離

SDS電泳

雙向電泳的第二向是將IPG膠條中經(jīng)過第一向分離的蛋白轉(zhuǎn)移到第二向SDS凝膠上，根據(jù)蛋白相對分子質(zhì)量或分子量(MW)大小與第一相垂直的分離。原理：低離子強(qiáng)度時，SDS主要以單體形式存在，此時它可以與蛋白質(zhì)結(jié)合生成蛋白質(zhì)-SDS復(fù)合物。當(dāng)SDS單體濃度大于1mmol/L時，它與多數(shù)蛋白質(zhì)的結(jié)合比為1.4gSDS/g蛋白質(zhì)。由于SDS帶有大量負(fù)電荷，從而掩蓋了不同蛋白質(zhì)間電荷的差異，使所有蛋白質(zhì)都帶有相同密度的負(fù)電荷，于是蛋白質(zhì)間