第十一熒光分析法演示文稿

第十一熒光分析法演示文稿2023/6/23本文檔共36頁；當(dāng)前第1頁；編輯于星期六\12點(diǎn)23分2023/6/23優(yōu)選第十一熒光分析法本文檔共36頁；當(dāng)前第2頁；編輯于星期六\12點(diǎn)23分熒光分析法：是基于被測(cè)物質(zhì)的熒光譜線位置及其強(qiáng)度進(jìn)行的分析方法（屬于發(fā)射光譜法）。應(yīng)用對(duì)象：一般是能產(chǎn)生強(qiáng)熒光的分子或某些特定離子本章重點(diǎn)：（1）分子熒光產(chǎn)生的過程（2）熒光與分子結(jié)構(gòu)關(guān)系（3）分子熒光定量方法本文檔共36頁；當(dāng)前第3頁；編輯于星期六\12點(diǎn)23分一、分子熒光與磷光的產(chǎn)生過程1.分子電子能級(jí)與激發(fā)過程分子能級(jí)比原子能級(jí)復(fù)雜；在每個(gè)分子的電子能級(jí)上，都存在振動(dòng)、轉(zhuǎn)動(dòng)能級(jí)。多數(shù)分子常溫時(shí)處在基態(tài)最低振動(dòng)能級(jí)，當(dāng)吸收能量便可發(fā)生能級(jí)間躍遷。為便于說明電子躍遷過程，必須確定電子能級(jí)的多重性用符號(hào)M表示。

M=2S+1，S軌道總自旋量子數(shù)

本文檔共36頁；當(dāng)前第4頁；編輯于星期六\12點(diǎn)23分S為電子自旋量子數(shù)的代數(shù)和(要么為0要么為1)；S=0時(shí)M=1，此時(shí)電子所處的能態(tài)為單重態(tài)用符號(hào)S表示。S=1時(shí)M=3，此時(shí)電子所處的能態(tài)為三重態(tài)用符號(hào)T表示。平行自旋比成對(duì)自旋穩(wěn)定(洪特規(guī)則)，三重態(tài)能級(jí)比相應(yīng)單重態(tài)能級(jí)低；大多數(shù)有機(jī)分子的基態(tài)處于單重態(tài)用S0表示；

本文檔共36頁；當(dāng)前第5頁；編輯于星期六\12點(diǎn)23分電子吸收一定能量由基態(tài)(S0)向激發(fā)態(tài)發(fā)生躍遷若電子方向不改變→產(chǎn)生激發(fā)單重態(tài)(用S1、S2···表示)若電子方向改變→產(chǎn)生激發(fā)三重態(tài)(用T1、T2···表示)激發(fā)態(tài)→基態(tài)：多種途徑和方式(見能級(jí)圖)；速度最快、激發(fā)態(tài)壽命最短的途徑占優(yōu)勢(shì)；本文檔共36頁；當(dāng)前第6頁；編輯于星期六\12點(diǎn)23分2.激發(fā)態(tài)→基態(tài)的能量傳遞途徑電子處于激發(fā)態(tài)是不穩(wěn)定狀態(tài)，返回基態(tài)時(shí)，通過輻射躍遷(發(fā)光)和無輻射躍遷等方式失去能量傳遞途徑輻射躍遷熒光磷光內(nèi)轉(zhuǎn)換外轉(zhuǎn)移振動(dòng)馳預(yù)系間跨越無輻射躍遷激發(fā)態(tài)停留時(shí)間越短、返回速度越快的途徑，發(fā)生幾率最大，發(fā)光強(qiáng)度相對(duì)也越最大；熒光：10-7～10-9

s,第一激發(fā)單重態(tài)的最低振動(dòng)能級(jí)→基態(tài)；磷光：10-4～10s；第一激發(fā)三重態(tài)的最低振動(dòng)能級(jí)→基態(tài)；本文檔共36頁；當(dāng)前第7頁；編輯于星期六\12點(diǎn)23分S2S1S0T1吸收發(fā)射熒光發(fā)射磷光系間跨越內(nèi)轉(zhuǎn)換振動(dòng)弛豫能量l2l1l3

外轉(zhuǎn)換l2T2內(nèi)轉(zhuǎn)換振動(dòng)弛豫本文檔共36頁；當(dāng)前第8頁；編輯于星期六\12點(diǎn)23分（1）振動(dòng)弛豫（VibrationalRelaxation,VR）在液相或壓力足夠高的氣相中，處于激發(fā)態(tài)的分子通過與溶劑分子碰撞而將部分能量以熱的形式傳遞給周圍的溶劑分子，電子則從高振動(dòng)能層返回到低的振動(dòng)能級(jí)的過程，稱為振動(dòng)弛豫。該過程在同一電子能級(jí)內(nèi)進(jìn)行。（2）內(nèi)轉(zhuǎn)換（InternalConversion，IC）對(duì)于具有相同多重度的分子，若較高電子能級(jí)的低振動(dòng)能層與較低電子能級(jí)的高振動(dòng)能層相重疊時(shí)，則電子可在重疊的能層之間通過振動(dòng)耦合產(chǎn)生無輻射躍遷的過程，如S2-S1；T2-T1。該過程在同一類電子能級(jí)相鄰的激發(fā)態(tài)間進(jìn)行。本文檔共36頁；當(dāng)前第9頁；編輯于星期六\12點(diǎn)23分（3）外轉(zhuǎn)換（ExternalConversion，EC）受激分子與溶劑分子或其它分子相互碰撞而失去能量，從而使熒光或磷光強(qiáng)度減弱甚至消失的過程，也稱“熄滅”或“猝滅”。該過程發(fā)生在S1－S0···，T1－S0（4）系間跨躍（IntersystemConversion，ISC）系間跨躍是發(fā)生在兩個(gè)不同多重態(tài)之間的無輻射躍遷，如從S1到T1，該躍遷是禁阻的。然而，當(dāng)不同多重態(tài)的兩個(gè)電子能層有較大重疊時(shí)，處于這兩個(gè)能層上的受激電子的自旋方向發(fā)生變化，即可通過自旋-軌道耦合而產(chǎn)生無輻射躍遷，該過程稱為系間跨躍。發(fā)生在不同多重態(tài)之間本文檔共36頁；當(dāng)前第10頁；編輯于星期六\12點(diǎn)23分（5）熒光發(fā)射電子從第一激發(fā)單重態(tài)最低振動(dòng)能級(jí)（時(shí)間10-9-10-7s）以輻射形式躍遷到基態(tài)各振動(dòng)能級(jí)所產(chǎn)生的光子輻射稱為熒光或熒光發(fā)射。由于各種去活化過程的存在，熒光輻射能通常要比激發(fā)光能量低，即熒光波長(zhǎng)總是大于激發(fā)波長(zhǎng)。（6）磷光發(fā)射電子從第一激發(fā)三重態(tài)的最低振動(dòng)能級(jí)以輻射形式躍遷到基態(tài)的各個(gè)振動(dòng)能級(jí)所產(chǎn)生的光子輻射稱為磷光或磷光發(fā)射。由于三重態(tài)振動(dòng)能級(jí)比單重態(tài)的低，即磷光波長(zhǎng)總是大于熒光波長(zhǎng)。本文檔共36頁；當(dāng)前第11頁；編輯于星期六\12點(diǎn)23分二、熒光的激發(fā)光譜和發(fā)射光譜熒光：光致發(fā)光，照射光波長(zhǎng)如何選擇？1.熒光的激發(fā)光譜（曲線）固定發(fā)射波長(zhǎng)(選最大發(fā)射波長(zhǎng)),通過激發(fā)單色器掃描，以不同激發(fā)光照射熒光物質(zhì)，記錄熒光強(qiáng)度對(duì)激發(fā)光波長(zhǎng)的關(guān)系曲線（圖中曲線I）。激發(fā)光譜曲線的最高處，處于激發(fā)態(tài)的分子最多，發(fā)射的熒光強(qiáng)度最大。本文檔共36頁；當(dāng)前第12頁；編輯于星期六\12點(diǎn)23分2.熒光光譜(發(fā)射光光譜)固定激發(fā)光波長(zhǎng)和強(qiáng)度(選最大激發(fā)波長(zhǎng)),通過發(fā)射單色器掃描，記錄熒光強(qiáng)度與發(fā)射光波長(zhǎng)關(guān)系的曲線(圖中曲線II)。任何熒光都具有兩種特征光譜：激發(fā)光譜與發(fā)射光譜。它們是熒光定性分析的基礎(chǔ)。由于不同物質(zhì)具不同的特征發(fā)射峰，因而使用熒光發(fā)射光譜可用于鑒別熒光物質(zhì)。本文檔共36頁；當(dāng)前第13頁；編輯于星期六\12點(diǎn)23分3.激發(fā)光譜與發(fā)射光譜的關(guān)系（1）Stokes位移激發(fā)光譜與發(fā)射光譜之間的波長(zhǎng)差值。發(fā)射光譜的波長(zhǎng)比激發(fā)光譜的長(zhǎng)，振動(dòng)弛豫消耗了能量。（2）發(fā)射光譜的形狀與激發(fā)波長(zhǎng)無關(guān)電子躍遷到不同激發(fā)態(tài)能級(jí)，吸收不同波長(zhǎng)能量(如能級(jí)圖2,1)，產(chǎn)生不同吸收帶，但均回到第一激發(fā)單重態(tài)的最低振動(dòng)能級(jí)再躍遷回到基態(tài)，產(chǎn)生波長(zhǎng)一定的熒光(如‘2)。（3）鏡像規(guī)則通常熒光發(fā)射光譜與它的吸收光譜（與激發(fā)光譜形狀一樣）成鏡像對(duì)稱關(guān)系。本文檔共36頁；當(dāng)前第14頁；編輯于星期六\12點(diǎn)23分200250300350400450500熒光激發(fā)光譜熒光發(fā)射光譜nm蒽的激發(fā)光譜和熒光光譜本文檔共36頁；當(dāng)前第15頁；編輯于星期六\12點(diǎn)23分二、熒光產(chǎn)生與分子結(jié)構(gòu)關(guān)系1、產(chǎn)生并可觀察到熒光的條件：（1）分子必須具有強(qiáng)的紫外可見吸收結(jié)構(gòu)（內(nèi)因）；（2）吸收特征頻率的光后，應(yīng)可產(chǎn)生具一定量子效率的熒光光量子數(shù)。即量子效率足夠大：可見，凡是使kF增加，使其它去活化常數(shù)降低的因素均可增加熒光量子產(chǎn)率。通常kF由分子結(jié)構(gòu)決定（內(nèi)因），而其它參數(shù)則由化學(xué)環(huán)境和結(jié)構(gòu)共同決定。一般物質(zhì)的熒光量子效率為0～1本文檔共36頁；當(dāng)前第16頁；編輯于星期六\12點(diǎn)23分2.有機(jī)化合物分子結(jié)構(gòu)與熒光關(guān)系（1）躍遷類型：*→的熒光效率高，系間跨越過程的速率常數(shù)小，有利于熒光的產(chǎn)生；（2）共軛效應(yīng)：提高共軛度有利于增加熒光效率并產(chǎn)生紅移（3）剛性平面結(jié)構(gòu)：可降低分子振動(dòng)，減少與溶劑的相互作用，故具有很強(qiáng)的熒光。如熒光素和酚酞有相似結(jié)構(gòu)，熒光素有很強(qiáng)的熒光，酚酞卻沒有。（4）取代基效應(yīng)：給電子基如－NH2、－OH、－OCH3使熒光增強(qiáng)，波長(zhǎng)長(zhǎng)移；吸電子基如－NO2、－F、－Cl使熒光減弱或熄滅。本文檔共36頁；當(dāng)前第17頁；編輯于星期六\12點(diǎn)23分本文檔共36頁；當(dāng)前第18頁；編輯于星期六\12點(diǎn)23分3.影響熒光強(qiáng)度外部因素（1）溫度：對(duì)熒光強(qiáng)度有顯著影響。隨溫度升高熒光強(qiáng)度降低。因?yàn)閮?nèi)、外轉(zhuǎn)換增加、粘度或“剛性”降低）。因此體系降低溫度可增加熒光分析靈敏度（2）溶劑：溶劑極性可增加或降低熒光強(qiáng)度（改變—*及n—*

躍遷的能量）；另外與溶劑作用從而改變熒光物質(zhì)結(jié)構(gòu)來增加或降低熒光強(qiáng)度。（3）酸度：具酸或堿性基團(tuán)的有機(jī)物質(zhì)，在不同pH值時(shí)，其結(jié)構(gòu)可能發(fā)生變化，因而熒光強(qiáng)度將發(fā)生改變；對(duì)無機(jī)熒光物質(zhì)，因pH值會(huì)影響其穩(wěn)定性，因而也可使其熒光強(qiáng)度發(fā)生改變。本文檔共36頁；當(dāng)前第19頁；編輯于星期六\12點(diǎn)23分第十一章

熒光分析法一、熒光強(qiáng)度與濃度關(guān)系二、定量方法第二節(jié)

熒光定量分析方法本文檔共36頁；當(dāng)前第20頁；編輯于星期六\12點(diǎn)23分一、熒光強(qiáng)度與物質(zhì)濃度關(guān)系

熒光強(qiáng)度

F正比于吸收的光量Ia和熒光量子效率：

F=Ia由朗-比耳定律：Ia=I0(1-10-lc)F=I0(1-10-lc)=I0(1-e-2.3lc)濃度很低時(shí)（lc

≤0.05），將括號(hào)項(xiàng)近似處理后：

F

=2.3I0lc

=K×CK—熒光系數(shù)（與物質(zhì)性質(zhì)、激發(fā)波長(zhǎng)、發(fā)射波長(zhǎng)、溶劑、溫度有關(guān)）二、定量方法1、校正曲線法：用已知量的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)經(jīng)過和試樣一樣的處理后，配制成系列標(biāo)準(zhǔn)溶液，在一定的儀器條件下測(cè)定這些本文檔共36頁；當(dāng)前第21頁；編輯于星期六\12點(diǎn)23分Fci溶液的熒光強(qiáng)度，以標(biāo)準(zhǔn)溶液的濃度為橫坐標(biāo)，對(duì)應(yīng)的熒光

強(qiáng)度為縱坐標(biāo)繪制出標(biāo)準(zhǔn)曲線，再在相同條件下測(cè)量未知試樣的熒光強(qiáng)度，在標(biāo)準(zhǔn)曲線上查出試樣的濃度。

在測(cè)定工作曲線時(shí)，常采用系列中某一標(biāo)準(zhǔn)溶液作

為基準(zhǔn)，將空白溶液的熒光強(qiáng)度

讀數(shù)調(diào)至0％，將該標(biāo)準(zhǔn)溶液的

熒光強(qiáng)度讀數(shù)調(diào)至100％或50％，

然后測(cè)定系列中其他標(biāo)準(zhǔn)溶液的

熒光強(qiáng)度。所以熒光強(qiáng)度實(shí)為相

對(duì)值。本文檔共36頁；當(dāng)前第22頁；編輯于星期六\12點(diǎn)23分注意事項(xiàng)

（1）為了使不同時(shí)間所測(cè)得的標(biāo)準(zhǔn)曲線先后一致，每次繪制工作曲線時(shí)最好采用同一種穩(wěn)定的熒光物質(zhì)（硫酸奎寧溶液）來校正儀器的讀數(shù)。（2）另外，在測(cè)量時(shí)標(biāo)準(zhǔn)溶液和試樣溶液的熒光強(qiáng)度，都應(yīng)扣除空白溶液的熒光強(qiáng)度。理想的或者說真實(shí)的空白溶液，原則上應(yīng)當(dāng)具有與未知試樣溶液中除分析物質(zhì)以外的同樣組成，可是對(duì)于實(shí)際遇到的復(fù)雜分析體系，很少有可能獲得這種真實(shí)的空白溶液，在實(shí)驗(yàn)中通常只能采用近似于真實(shí)空白溶液。最簡(jiǎn)單的是溶劑空白。本文檔共36頁；當(dāng)前第23頁；編輯于星期六\12點(diǎn)23分它只能用來校正溶劑中的熒光物質(zhì)，適合于不被熒光雜質(zhì)沾污的熒光化合物的直接測(cè)定。（3）采用試劑空白則更好一些，由于試劑空白除含溶劑之外，還含有與標(biāo)準(zhǔn)及試樣溶液中相同濃度的各種試劑，因而它可以校正試劑中的雜質(zhì)所引起的吸收和發(fā)光，可用于間接測(cè)定法。（4）但這兩種空白都無法校正原已存在于試樣中的基體和沾污物，有時(shí)候可以通過加入某種化合物于試樣溶液中，而這種化合物可特效地猝滅分析物質(zhì)的熒光，從而獲得一種很接近于真實(shí)的空白溶液。如測(cè)VB2時(shí)用連二亞硫酸鈉Na2S2O4本文檔共36頁；當(dāng)前第24頁；編輯于星期六\12點(diǎn)23分2、比較法：如果已知某測(cè)定物質(zhì)的熒光校準(zhǔn)曲線濃度的線性范圍，取已知量的熒光物質(zhì)配成一標(biāo)準(zhǔn)溶液，測(cè)定其熒光強(qiáng)度。然后在同樣條件下測(cè)定試樣溶液的熒光強(qiáng)度，由標(biāo)準(zhǔn)溶液的濃度和兩個(gè)溶液的熒光強(qiáng)度的比值求得試樣中熒光物質(zhì)的含量。3、聯(lián)立方程法（多組分）：依據(jù)就是熒光強(qiáng)度具有加和性（1）當(dāng)混合物中各組分的熒光峰相距頗遠(yuǎn)、彼此干擾很小時(shí)，可分別在不同的發(fā)射波長(zhǎng)測(cè)定各個(gè)組分的熒光強(qiáng)度，然后按單一組分定量方法進(jìn)行定量。（2）若混合物中各組分的熒光峰相近，彼此嚴(yán)重重疊，但本文檔共36頁；當(dāng)前第25頁；編輯于星期六\12點(diǎn)23分它們激發(fā)光譜確有顯著的差別，這時(shí)可選擇不同的激發(fā)波長(zhǎng)進(jìn)行測(cè)定，然后按單一組分進(jìn)行定量。（3）選擇兩波長(zhǎng)時(shí)仍無法達(dá)到混合物各組分的分別測(cè)定，這時(shí)就要進(jìn)行聯(lián)和測(cè)定，解聯(lián)立方程而求得。例如：硫胺熒的激發(fā)峰在385nm，熒光峰在435nm，吡啶硫胺熒激發(fā)峰在410nm，熒光峰在480nm，采用385nm或410nm為激發(fā)峰，測(cè)定混合物的試樣溶液在435nm和480nm的熒光強(qiáng)度F，然后由所測(cè)出的混合物的熒光強(qiáng)度及事先測(cè)定的硫胺熒和吡啶硫胺熒在上述的激發(fā)波長(zhǎng)和發(fā)射波長(zhǎng)下的相應(yīng)熒光系數(shù)而列出下列方程。本文檔共36頁；當(dāng)前第26頁；編輯于星期六\12點(diǎn)23分假設(shè)選擇385nm作為激發(fā)波長(zhǎng)例題：利用連二亞硫酸鈉可熄滅核黃色發(fā)出的熒光來測(cè)定奶粉中的維生素Ｂ２含量。精確稱取0.5000g奶粉，加pH=4.6的HAc~NaAc緩沖液沉淀蛋白質(zhì)，移入50ml溶量瓶中，加水至刻線，搖勻，過濾，取濾液測(cè)得熒光強(qiáng)度Fx=28.5，取出比色皿加入少量的連二亞硫酸鈉，迅速搖勻使維生素B2本文檔共36頁；當(dāng)前第27頁；編輯于星期六\12點(diǎn)23分熒光熄滅，立即再測(cè)熒光強(qiáng)度為Fo=6.20。在另一比色皿中加入24ml被測(cè)維生素B2溶液后再加入濃度為0.2500μg/ml維生素B2標(biāo)準(zhǔn)溶液1ml，測(cè)得熒光強(qiáng)度為F=48.6。計(jì)算奶粉中維生素B2的含量解：選用比較法，設(shè)含量為CX（μg/ml）

28.5-6.20=K?CX48.6-6.20=K?(Cx+△C)=K?(Cx+1×0.2500/25)Cx=0.0111μg/ml，則奶粉中維生素B2含量為0.0111×50/0.5000=0.2775μg/g本文檔共36頁；當(dāng)前第28頁；編輯于星期六\12點(diǎn)23分三、熒光分析法的應(yīng)用(1)無機(jī)化合物的分析與有機(jī)試劑配合物后測(cè)量；可測(cè)量