六味地黃丸對自殺基因系統(tǒng)殺傷肝癌細(xì)胞增效作用的量效關(guān)系

六味地黃丸對自殺基因系統(tǒng)殺傷肝癌細(xì)胞增效作用的量效關(guān)系六味地黃丸對自殺基因系統(tǒng)殺傷肝癌細(xì)胞增效作用的量效關(guān)系

：杜標(biāo)炎，張愛娟，譚宇蕙，易華，吳映雅，郭玉榮

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六味地黃丸對自殺基因系統(tǒng)殺傷肝癌細(xì)胞增效作用的量效關(guān)系

字2024A014；環(huán)境合格證號NO0010470］，由廣州中醫(yī)藥高校試驗(yàn)動(dòng)物中心供應(yīng)。

14GCV殺傷敏感性及GCV工作濃度的確定［10］大鼠肝癌細(xì)胞CBRH7919/tk-和CBRH7919/tk+鋪96孔培育板；在鋪板24h后加入梯度濃度GCV，MTT法測定細(xì)胞對GCV的敏感性，確定GCV的工作濃度為392μmol/L。

15六味地黃丸含藥血清和空白血清的制備及血清對細(xì)胞生長的影響［10］16只SD大鼠隨機(jī)分為2組，空白血清組灌胃生理鹽水，六味地黃丸含藥血清組灌胃六味地黃丸（32g·kg-1·d-1），制備4d和8d血清

，-70℃冰箱保存?zhèn)溆谩Ｓ^測空白血清和含藥血清對細(xì)胞生長的影響，結(jié)果表明血清能在肯定程度上促進(jìn)細(xì)胞增殖，但當(dāng)血清濃度高于體積分?jǐn)?shù)20%時(shí)細(xì)胞形態(tài)消失變化，故試驗(yàn)時(shí)采納對細(xì)胞生長影響較小的體積分?jǐn)?shù)10%以下的血清濃度。

16自殺基因系統(tǒng)聯(lián)合六味地黃丸含藥血清對肝癌細(xì)胞的殺傷效應(yīng)將大鼠肝癌細(xì)胞CBRH7919/tk+和CBRH7919/tk-按1∶9的細(xì)胞數(shù)混合，作為自殺基因tk/GCV系統(tǒng)作用的細(xì)胞；沒有自殺基因系統(tǒng)的試驗(yàn)組，其作用細(xì)胞均為tk-細(xì)胞，按3×103個(gè)/孔鋪96孔板，分為空白血清組、GCV加空白血清組、10%tk+/GCV加空白血清組、含藥血清組、GCV加含藥血清組及10%tk+/GCV聯(lián)合含藥血清組；灌胃8d含藥血清又再分為低劑量組（25%含藥血清+75%空白血清）、中劑量組（5%含藥血清+5%空白血清）和高劑量組（10%含藥血清），共設(shè)12組，每組6個(gè)復(fù)孔；灌胃4d含藥血清則分為低劑量組（5%含藥血清+5%空白血清）和高劑量組（10%含藥血清），共設(shè)9組，每組6個(gè)復(fù)孔；血清濃度均為體積分?jǐn)?shù)。用完全培育基培育24h后，加入相應(yīng)空白血清和含藥血清，孵育12h，再加入終濃度392μmol/L的GCV，培育60h后，以MTT法檢測細(xì)胞活性。

17統(tǒng)計(jì)學(xué)分析和協(xié)同性分析采納SPSS115統(tǒng)計(jì)軟件，多組間兩兩比較用OneWayANOVA,LSD法。協(xié)同性分析用金正均Q值法推斷［13］，Q=試驗(yàn)聯(lián)合藥效R’（A+B）/理論聯(lián)合藥效R（A+B），理論聯(lián)合藥效R（A+B）=RA+RB-RA×RB，RA、RB為單獨(dú)用藥藥效。Q＜085則推斷為拮抗作用；085≤Q＜115則推斷為相加作用；Q≥115則推斷為協(xié)同作用。

2結(jié)果

21自殺基因系統(tǒng)聯(lián)合六味地黃丸含藥血清（4d）對肝癌細(xì)胞的殺傷效應(yīng)空白血清組、含藥血清組、GCV加空白血清組、GCV加含藥血清組細(xì)胞均未顯示明顯的細(xì)胞毒性，表明在試驗(yàn)條件下血清和GCV對腫瘤細(xì)胞的生長無明顯影響。自殺基因系統(tǒng)10%tk+/GCV加空白血清組及10%tk+/GCV聯(lián)合不同濃度的含藥血清組均具有顯著殺傷作用（與空白血清組比較，Ｐ＜００５），表明自殺基因系統(tǒng)具有生物學(xué)功能；10%tk+/GCV系統(tǒng)聯(lián)合5%、10%含藥血清組的細(xì)胞存活率均顯著低于10%tk+/GCV加空白血清組（Ｐ＜００５或Ｐ＜００1）及相對應(yīng)的含藥血清組，聯(lián)合組的實(shí)際抑制率均顯著高于理論抑制率，Q值分別為116、149，均大于115，說明其相互作用具有協(xié)同性，且隨著含藥血清濃度的增高Q值增大，協(xié)同作用增加。結(jié)果見表1。

22自殺基因系統(tǒng)聯(lián)合六味地黃丸含藥血清（8d）對肝癌細(xì)胞的殺傷效應(yīng)10%tk+/GCV自殺基因治療系統(tǒng)聯(lián)合25%、5%、10%濃度的含藥血清，細(xì)胞存活率均顯著低于含藥血清組與10%tk+/GCV加空白血清組（Ｐ＜００５或Ｐ＜００1）。聯(lián)合組的實(shí)際抑制率均顯著高于理論抑制率，Q值分別為086、120、142。但25%的含藥血清聯(lián)合組的Q值在085~115之間，為相加作用；而5%、10%濃度聯(lián)合組均Q＞115，說明其增效作用具有協(xié)同性，且隨著含藥血清濃度的增高協(xié)同作用增加。結(jié)果見表2。表1自殺基因系統(tǒng)聯(lián)合六味地黃丸含藥血清（4d）對肝癌細(xì)胞的殺傷效應(yīng)表2六味地黃丸含藥血清（8d）聯(lián)合10%tk+/GCV系統(tǒng)對CBRH7919作用的殺傷效應(yīng)

3爭論

自殺基因治療之所以能成為惡性腫瘤基因治療的研

六味地黃丸對自殺基因系統(tǒng)殺傷肝癌細(xì)胞增效作用的量效關(guān)系

究熱點(diǎn)和最有應(yīng)用前景的腫瘤基因治療方法，是由于自殺基因治療存在旁殺傷效應(yīng)（或稱為旁觀者效應(yīng)）的獨(dú)特機(jī)制。所謂旁殺傷效應(yīng)是指導(dǎo)入了自殺基因的腫瘤細(xì)胞加入前體藥物后，不僅自身被殺死，其鄰近未導(dǎo)入自殺基因的細(xì)胞也被殺死的現(xiàn)象［1-2］。旁殺傷效應(yīng)形成機(jī)制的假說主要包括［14］：（1）“縫隙連接”機(jī)制；（2）免疫介導(dǎo)機(jī)制；（3）“細(xì)胞凋亡”機(jī)制；（4）介質(zhì)機(jī)制；（5）抗腫瘤血管生成等。由于在整體水平基因轉(zhuǎn)染效率很低，同時(shí)病毒載體的使用也帶來了肯定的毒副作用，故自殺基因療法存在旁殺傷效應(yīng)這一獨(dú)特的作用機(jī)制具有很多優(yōu)勢，如能削減對高轉(zhuǎn)染率的要求，削減載體過量引起的毒副作用等。但在目前的狀況下，由于體內(nèi)轉(zhuǎn)染效率較低等緣由，使腫瘤自殺基因治療的效果仍不非常令人滿足。以增加旁殺傷效應(yīng)為目標(biāo)的聯(lián)合治療是目前腫瘤自殺基因治療的討論熱點(diǎn)之一?，F(xiàn)有中藥方藥藥理作用的討論結(jié)果提示：中藥方藥有可能針對自殺基因旁殺傷效應(yīng)的機(jī)制，通過增加自殺基因旁殺傷效應(yīng)對腫瘤自殺基因療法產(chǎn)生協(xié)同作用。我們前期的動(dòng)物在體試驗(yàn)討論表明，自殺基因療法聯(lián)合滋陰補(bǔ)腎中藥名方六味地黃丸能更有效地抑制小鼠移植性肝癌的生長［9］。初步的體外試驗(yàn)結(jié)果也表明，自殺基因療法聯(lián)合滋陰補(bǔ)腎中藥名方六味地黃丸含藥血清在自殺基因系統(tǒng)殺傷肝癌細(xì)胞時(shí)發(fā)揮協(xié)同作用［10］。本試驗(yàn)結(jié)果顯示：在大鼠血清總濃度為10%的條件下，六味地黃丸灌胃4d的含藥血清在50%、10%含藥血清濃度下，與自殺基因系統(tǒng)聯(lián)合作用的抑制率為2151%、2878%，較單純自殺基因系統(tǒng)的抑制率1449%分別提高了702%、1429%；六味地黃丸灌胃8d的含藥血清，在25%、50%、10%濃度下，與自殺基因系統(tǒng)聯(lián)合作用的抑制率為2666%、3214%、3089%，較單純自

殺基因系統(tǒng)的抑制率2193%分別提高了47%、102%、90%，呈現(xiàn)劑量依靠關(guān)系。結(jié)果表明六味地黃丸能增加自殺基因療法對肝癌細(xì)胞的殺傷效應(yīng)。我們還比較了4d含藥血清和8d含藥血清的增效作用效果，結(jié)果顯示無顯著性差異，提示灌胃4d含藥血清即可滿意試驗(yàn)要求。

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六味地黃丸對自殺基因系統(tǒng)殺傷肝癌細(xì)胞增效作用的量效關(guān)系

［10］杜標(biāo)炎,張愛娟,譚宇蕙,等.自殺基因系統(tǒng)聯(lián)合六味地黃丸對肝癌細(xì)胞殺傷的協(xié)同作用［J］.廣州中醫(yī)藥高校學(xué)報(bào),2024,25(4):319.

［11］杜標(biāo)炎,譚宇蕙,吳映雅,等.逆轉(zhuǎn)錄病毒載體介導(dǎo)HSV1tk/GCV腫瘤自殺基因治療系統(tǒng)的構(gòu)建［J］.廣州中醫(yī)藥高校學(xué)報(bào),2024,21(5):395.

［12］譚宇蕙,吳映雅,杜標(biāo)炎,等.大鼠肝癌細(xì)胞HSVt