基因工程原理 柯斯質粒等其他高級載體

第五章柯斯質粒等其他高級載體用于克隆大片段DNA的載體特殊用途的載體1本文檔共41頁；當前第1頁；編輯于星期二\12點24分用于連入更長DNA片段的載體基因組繪圖與測序需要把更長(>18kb)的片段連入載體柯斯質粒(cosmid)Fosmids噬菌體P1載體系統(tǒng)(bacteriophageP1vector)BAC(bacterialartificialchromosome)PAC(P1-derivedartificialchromosome)YAC(Yeastartificialchromosome)Mega-YAC2本文檔共41頁；當前第2頁；編輯于星期二\12點24分3本文檔共41頁；當前第3頁；編輯于星期二\12點24分柯斯質粒載體“柯斯克隆”（cosmidcloning）的理論依據(jù)：在λphage線性DNA分子的每一端都具有彼此互補的單鏈突出序列，即所謂的粘性末端(cos位點)λphage的多連體分子是由cos連接而成的。末端酶(terminase)或叫Ter體系——即λphage具有一種位點特異的切割體系(site-specificcuttingsystem).coscoscoscoscoscos4本文檔共41頁；當前第4頁；編輯于星期二\12點24分柯斯質粒載體中克隆的簡化示意圖5本文檔共41頁；當前第5頁；編輯于星期二\12點24分6本文檔共41頁；當前第6頁；編輯于星期二\12點24分7本文檔共41頁；當前第7頁；編輯于星期二\12點24分柯斯載體的特點第一，具有λ噬菌體的特性。第二，具有質粒載體的持性。第三，具有高容量的克隆能力。第四，具有與同源序列的質粒進行重組的能力。8本文檔共41頁；當前第8頁；編輯于星期二\12點24分柯斯克隆技術的優(yōu)點由于柯斯載體兼具了質粒和λ噬菌體兩方面的特性，提高了克隆外源DNA片段的能力，可達45kb左右，因此對于構建真核生物基因文庫是一種特別有用的克隆載體；應用柯斯質粒作克隆載體，所形成的非重組體的克隆本底比較低，從而提高了篩選具外源DNA的重組體質粒的幾率。9本文檔共41頁；當前第9頁；編輯于星期二\12點24分柯斯克隆技術的缺點由于經(jīng)核酸內切酶切割作用產(chǎn)生的線性的柯斯質粒載體，彼此間會通過分子內重組形成多聚體分子。由于經(jīng)核酸內切酶做局部消化的折合基因組產(chǎn)生出來的DNA片段，在隨后的連接反應中，往往會出現(xiàn)兩個或數(shù)個片段隨機連接在一起的情況。10本文檔共41頁；當前第10頁；編輯于星期二\12點24分

缺點克服辦法

a.堿性磷酸酶的脫磷酸作用為克服上述的局限性，一般是在連接反應之前，先用堿性磷酸酶對線性的柯斯質粒DNA，使之脫磷酸，以阻止它們之間發(fā)生自連。b.電泳分部分離克服上述局限性的另一種較為有效的辦法是，在連接反應前，先將局部消化的DNA進行電泳分部分離，富集大分子量的片段(31-45Kb)，再同線性化的柯斯載體DNA連接。11本文檔共41頁；當前第11頁；編輯于星期二\12點24分Ish-Horowicz-Burke柯斯克隆方案12本文檔共41頁；當前第12頁；編輯于星期二\12點24分13本文檔共41頁；當前第13頁；編輯于星期二\12點24分Bates-Swift柯斯克隆方案柯斯質粒載體c2XB具有兩個被平末端限制酶SmaI分隔開來的cos位點。這些平末端在所用的條件下僅以極低的效率發(fā)生連接，因此可以有效的避免形成多個載體拷貝的重組子14本文檔共41頁；當前第14頁；編輯于星期二\12點24分pWE和sCos系列的現(xiàn)代柯斯質粒特征：對未經(jīng)大小選擇的DNA進行簡單克隆的多克隆位點；在克隆位點旁邊的噬菌體啟動子；克隆位點兩側的單一Not

I,SacI或SfiI位點，可將單一片段插入從載體上切除下來。如果需要向哺乳動物細胞轉移基因，載體上還可以包含編碼顯性選擇標記的哺乳動物表達元件。15本文檔共41頁；當前第15頁；編輯于星期二\12點24分16本文檔共41頁；當前第16頁；編輯于星期二\12點24分柯斯質粒的替代者BAC和PAC17本文檔共41頁；當前第17頁；編輯于星期二\12點24分噬菌體Pl18本文檔共41頁；當前第18頁；編輯于星期二\12點24分BAC系統(tǒng)(細菌人工染色體)19本文檔共41頁；當前第19頁；編輯于星期二\12點24分利用重組酶的體內DNA重組技術20本文檔共41頁；當前第20頁；編輯于星期二\12點24分載體的選擇21本文檔共41頁；當前第21頁；編輯于星期二\12點24分特殊用途載體可用于產(chǎn)生測序所需的單鏈DNA的載體表達載體制備RNA探針的載體最大量合成蛋白質的載體簡化蛋白純化的載體促進表達蛋白溶解的載體促進蛋白外運的載體合而為一：組合了多種特性的載體22本文檔共41頁；當前第22頁；編輯于星期二\12點24分制備RNA探針的載體23本文檔共41頁；當前第23頁；編輯于星期二\12點24分制備RNA探針所用的LITMUS載體的結構和用途24本文檔共41頁；當前第24頁；編輯于星期二\12點24分25本文檔共41頁；當前第25頁；編輯于星期二\12點24分表達載體Thebasesequenceofthe?10and?35regionsoffournaturalpromoters,twohybridpromoters,andtheconsensuspromoter.26本文檔共41頁；當前第26頁；編輯于星期二\12點24分Structureofafactor-independenttranscriptionalterminator.27本文檔共41頁；當前第27頁；編輯于星期二\12點24分影響克隆基因表達的因素28本文檔共41頁；當前第28頁；編輯于星期二\12點24分對插入基因進行可控表達29本文檔共41頁；當前第29頁；編輯于星期二\12點24分克隆到pET載體中的基因表達調控策略30本文檔共41頁；當前第30頁；編輯于星期二\12點24分ControlofclonedgeneexpressionusingtheλcIpromoter31本文檔共41頁；當前第31頁；編輯于星期二\12點24分RegulationofthepBADpromoter.32本文檔共41頁；當前第32頁；編輯于星期二\12點24分簡化蛋白純化的載體Structureofavector(pBAD/His,InvitrogenCorporation)designedfortheexpressionofaclonedgeneasafusionproteincontainingapolyhistidinesequence.33本文檔共41頁；當前第33頁；編輯于星期二\12點24分融合標簽及其抗體34本文檔共41頁；當前第34頁；編輯于星期二\12點24分Purificationofaclonedgeneproductsynthesizedasafusiontothebiotincarboxylasecarrierprotein(tag).35本文檔共41頁；當前第35頁；編輯于星期二\12點24分內含肽，外含肽和蛋白切割36本文檔共41頁；當前第36頁；編輯于星期二\12點24分與內含肽融合合成的克隆基因產(chǎn)物的純化37本文檔共41頁；當前第37頁；編輯于星期二\12點24分促進表達蛋白溶解的載體要減少包涵體的形成，可以