13下游加工過程概論

13下游加工過程概論生物工程系1本課程主要內(nèi)容13生物下游加工過程概論14發(fā)酵液的預(yù)處理和固液分離方法15細(xì)胞破碎16沉淀法17膜分離技術(shù)18溶劑萃取法19雙水相萃取20吸附法21離子交換法22液相色譜法23親和分離技術(shù)24結(jié)晶法25基因工程藥物生產(chǎn)實(shí)例2主要參考書《新編生物工藝學(xué)》，俞俊棠主編，化工出版社，2003《生物分離工程》（第二版），孫彥編著，化工出版社，2005《生物工程下游技術(shù)》（第二版），劉國詮主編，化工出版社，2003《生化分離工程》嚴(yán)希康編著，化工業(yè)出版社《生物分離原理與技術(shù)》歐陽平凱編著，化工業(yè)出版社3成績(jī)

平時(shí)成績(jī)占30%，包括平時(shí)作業(yè)、課堂(提問,點(diǎn)名)等。

期末考試占70%，閉卷考試方法總成績(jī):平時(shí)(30%)+期末(70%)。413.1下游加工過程在生物技術(shù)中的地位下游加工過程是生物工程的一個(gè)重要組成部分.發(fā)酵液、動(dòng)植物細(xì)胞培養(yǎng)液、酶反應(yīng)液和動(dòng)植物組織細(xì)胞與體液等中提取、分離純化、富集生物產(chǎn)品的過程稱為下游加工過程(downstreamprocessing)它由一些化學(xué)工程的單元操作組成,但由于生物物質(zhì)的特性，有其特殊要求，而且其中某些單元操作在一般化學(xué)工業(yè)中應(yīng)用較少。5在發(fā)酵產(chǎn)品的生產(chǎn)中，分離和精制過程所需的費(fèi)用占成本的很大部分。對(duì)傳統(tǒng)發(fā)酵工業(yè)(如抗生素、乙醇、檸檬酸)，分離和精制部分占整個(gè)工廠投資費(fèi)用的60％，對(duì)重組DNA生產(chǎn)蛋白質(zhì)、精制的費(fèi)用可占整個(gè)生產(chǎn)費(fèi)用的80％一90％。6從第一個(gè)基因工程藥物，人胰島素在1982年投產(chǎn)后，人們逐漸認(rèn)識(shí)到下游加工過程的落后有可能會(huì)阻礙生物技術(shù)的發(fā)展，特別是當(dāng)有其他生產(chǎn)方法與其相競(jìng)爭(zhēng)時(shí)。英國政府工業(yè)部，于1983年發(fā)起生物分離計(jì)劃(BIOSEP)，專門研究下游加工過程，有7個(gè)國家、50家公司參加。1987年英國化學(xué)工業(yè)會(huì)召開了專門討論下游加工過程的國際會(huì)議。美國UnitedEngineeringFoundation從1981年開始連續(xù)召開了生物產(chǎn)品回收的會(huì)議。我國也于1989年在濟(jì)南召開了一次專門會(huì)議。人們逐漸取得了共識(shí)；現(xiàn)代生物技術(shù)的發(fā)展是和下游技術(shù)的進(jìn)步緊密相關(guān)的。713.2傳統(tǒng)生化產(chǎn)品和基因工程產(chǎn)品回收方法的比較1.生化產(chǎn)品的類型按用途分類食品類。保健品類。醫(yī)用類產(chǎn)品（1998年，719種）。抗生素112種農(nóng)業(yè)用產(chǎn)品（1998年，36種）。生物試劑類（1998年，975種）。按分子量大小分類Mass<1000D：抗生素、有機(jī)酸、、多肽類等Mass>1000D：酶、抗原、抗體、多肽、蛋白質(zhì)類按發(fā)酵時(shí)目的產(chǎn)物所在的位置分類cell內(nèi)：胰島素、白細(xì)胞介素、干擾素、重組蛋白質(zhì)cell外：抗生素（青霉素、紅霉素）、胞外酶（α-淀粉酶）等

82.傳統(tǒng)生化產(chǎn)品和基因工程產(chǎn)品在提取和精制上的差異傳統(tǒng)生化產(chǎn)品都為小分子(工業(yè)用酶除外，但它們對(duì)純度要求不高、提取方法較簡(jiǎn)單)．其理化性能(如平衡關(guān)系等)數(shù)據(jù)都為已知，因此放大比較有根據(jù)；基因工程產(chǎn)品大多為大分子，必要數(shù)據(jù)缺乏，放大多憑經(jīng)驗(yàn)。9由于第一代基因工程產(chǎn)品都以E.coli作為宿主，表達(dá)產(chǎn)品處于胞內(nèi)，提取前需將細(xì)胞破碎，細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)釋放出來，給提取增加了很多困難；而發(fā)酵液中的產(chǎn)物，濃度較低，雜質(zhì)又多，且一般大分子較小分子不穩(wěn)定(易失活，如對(duì)剪切力)，故提取較困難。大分子(蛋白質(zhì))的分離主要困難在于雜蛋白的分離，由于蛋白質(zhì)都內(nèi)氨基酸所構(gòu)成，所以性質(zhì)相似，分離主要依靠高分辨力的精制方法，如色譜分離等。103. 分離效率的評(píng)價(jià)濃縮率（富積率，concentrationfactor）

原料(Rawmaterial)

分離器

產(chǎn)品(Product)

FW,VW,cT,W,cX,W

廢液(Wastefluid)意義：1）如mT

>1，則目標(biāo)產(chǎn)物得到富積；2）如mT

=mX，則目標(biāo)產(chǎn)物未得到分離純化。

11分離因子(separativefactor)，或分離系數(shù)(separativecoefficient)

意義：A、目標(biāo)產(chǎn)物濃度，雜質(zhì)濃度，則分離因子大，分離效率；B、=1時(shí)，則未分離。故在分離為主要目的時(shí),12回收率(recovery)：純化因子(purificationfactor)

對(duì)于具有生物活性的蛋白質(zhì)或酶，常常用分離前后目標(biāo)產(chǎn)物的比活A(yù)[inU/mg]之比表示目標(biāo)產(chǎn)物的分離純化程度，1313.3生化產(chǎn)品及加工過程的特點(diǎn)1)應(yīng)用面廣。醫(yī)藥衛(wèi)生、環(huán)保、動(dòng)植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)、食品和試劑等2)種類繁多。分子量X0–X000000，結(jié)構(gòu)功能復(fù)雜，生物活性各異。3)目的產(chǎn)物在初始物料中的含量低。青霉素（4.2%）、慶大霉素（0.2%）、干擾素（<50ug/ml）。144)產(chǎn)品價(jià)格與產(chǎn)物濃度呈反比原料中目標(biāo)產(chǎn)物濃度越低，所需能耗越高，分離過程成本越大。155)初始物料成分復(fù)雜,常需多個(gè)步驟,產(chǎn)品總收率低。除少量產(chǎn)物外，還有大量的細(xì)胞及碎片、其他代謝物（幾百上千種）、培養(yǎng)基成分、無機(jī)鹽等。166)生物活性物質(zhì)的穩(wěn)定性低。易變質(zhì)、易失活、易變性，對(duì)溫度、pH值、重金屬離子、有機(jī)溶劑、剪切力、表面張力等非常敏感。7)產(chǎn)品的質(zhì)量要求高，尤其是藥品等。成品青霉素對(duì)其強(qiáng)致敏原---青霉噻唑蛋白必須控制RIA值（放射免疫測(cè)定）小于100（1.5*10-6），蛋白類藥物（雜質(zhì)<2%）、重組胰島素中雜蛋白小于0.01%。1713.4生物技術(shù)下游加工過程的一般流程和單元操作

動(dòng)、植物組織、體液等

胞外產(chǎn)物

提取發(fā)酵液→預(yù)處理→c分離→c破碎→碎片分離→初步純化→精制→制成品培養(yǎng)液

加熱沉淀勻化離心沉淀分子篩無菌過濾酶反應(yīng)液調(diào)pH離心超聲萃取吸附離子超濾絮凝過濾胞溶過濾萃取親和凍干錯(cuò)流過濾研磨錯(cuò)流過濾超濾吸附噴干憎水結(jié)晶電泳發(fā)酵液預(yù)處理細(xì)胞破碎初步純化高度純化1813.6純化方法選擇的基本原則1)盡可能簡(jiǎn)單、低耗、高效、快速。 反面例子----中藥現(xiàn)代化、超臨界萃取； 正面例子2)分離步驟盡可能少，每步收率盡可能高。A)

分離步驟越多，回收率越低；如Y10=0.9510=0.63，Y5=0.955=0.77 B)分離步驟多，設(shè)備投入大，人員物資消耗大，生產(chǎn)周期長(zhǎng)

193)避免相同原理的分離技術(shù)多次重復(fù)出現(xiàn)分子篩和超濾技術(shù)按分子量大小分離，重復(fù)應(yīng)用兩次以上，意義就不大了。4)盡量減少新化合物進(jìn)入待分離的溶液。A)引起新的化學(xué)污染；B)蛋白質(zhì)的變性失活

5)合理的分離步驟次序。原則是：先低選擇性，后高選擇性；先高通量，后低通量；先粗分，后精分；先低成本，后高成本。2013.7純化流程設(shè)計(jì)前應(yīng)了解的信息要掌握的產(chǎn)物物化性質(zhì)，主要包括：(1)、溶解度及影響因素，包括溫度、pH值、有機(jī)溶劑和鹽等；(2)、分子量和分子形狀。對(duì)于高分子物質(zhì)非常有意義；(3)、沸點(diǎn)和蒸汽壓。對(duì)于熱穩(wěn)定的小分子物質(zhì)非常有意義；(4)、極性大?。?5)、分子電荷及影響因素，包括pH值和鹽等；(6)、功能團(tuán)。功能團(tuán)為萃取劑和特異性吸附的選擇提供依據(jù)；(7)、免疫原性。設(shè)計(jì)親和色譜；(8)、穩(wěn)定性及其影響因素，包括溫度、pH值、毒性試劑等(如青霉素低pH不穩(wěn)定)；(9)、分子的淌度及影響因素，包括pH值、離子強(qiáng)度和鹽等；(10)、等電點(diǎn)pI；21成品規(guī)格（或產(chǎn)品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)）表1.3五肽胃泌素的上海市藥品標(biāo)準(zhǔn)（1993年版32頁）指標(biāo)名稱指標(biāo)含量（C37H49N7O9S）97.0-103.0比旋光度-25?~-29?吸收值比A(280nm):A(288nm)=1.12-1.22氨基酸各氨基酸之比為1干燥失重，%0.5

進(jìn)料的組成和物性(1)、目的產(chǎn)物的濃度。高？低？(2)、物料中的與目的產(chǎn)物相近物質(zhì)組成的物理化學(xué)性質(zhì)。(3)、目的產(chǎn)物的定位。是胞內(nèi)還是胞外？(4)、菌種的種類和形態(tài)。(5)、微生物的含量和發(fā)酵液的黏度。22生產(chǎn)規(guī)模

危害性(1)離心產(chǎn)生的氣溶膠、發(fā)酵產(chǎn)生的廢氣、干燥產(chǎn)生的粉塵等。(2)目的產(chǎn)物本身的危害性；抗腫瘤代謝類藥物，類固醇類抗生素，激素類藥物等。(3)試劑危害。萃取試劑CCl4、甲苯、苯、二甲苯、CNBr。(4)微生物的危害。重組DNA工程菌不能任意排放。這一菌種為新的物種，不能排除對(duì)生態(tài)系統(tǒng)和人的危害。分批分離還是連續(xù)純化2313.8非蛋白質(zhì)類雜質(zhì)的去除在純化過程中，三種可能存在的非蛋白質(zhì)類雜質(zhì)需要特別注意，它們是DNA、熱原質(zhì)和病毒。DNA的除去熱原的除去：細(xì)菌內(nèi)毒素病毒的除去2413.9目標(biāo)蛋白質(zhì)的表征和分析方法蛋白質(zhì)在分離、純化過程個(gè)易發(fā)生變化，因此得到的產(chǎn)品應(yīng)與已知標(biāo)準(zhǔn)品對(duì)照，證明為同一物質(zhì)并檢查其純度。為達(dá)此目的，僅用一種分析方法是不夠的，常需用幾種方法。①HPLC選用基于個(gè)同原理的兩種層析系統(tǒng)(如反相層析和離子交換層析)，如只得到單個(gè)對(duì)稱峰則表明純