第五章動(dòng)物細(xì)胞工程制藥演示文稿

第五章動(dòng)物細(xì)胞工程制藥演示文稿本文檔共108頁(yè)；當(dāng)前第1頁(yè)；編輯于星期三\12點(diǎn)23分優(yōu)選第五章動(dòng)物細(xì)胞工程制藥本文檔共108頁(yè)；當(dāng)前第2頁(yè)；編輯于星期三\12點(diǎn)23分RobertHooke及其制作的顯微鏡第一節(jié)概述本文檔共108頁(yè)；當(dāng)前第3頁(yè)；編輯于星期三\12點(diǎn)23分Leeuwenhoek首次觀察到了活的細(xì)胞本文檔共108頁(yè)；當(dāng)前第4頁(yè)；編輯于星期三\12點(diǎn)23分德國(guó)植物學(xué)家Schleiden和動(dòng)物學(xué)家Schwann創(chuàng)立了細(xì)胞學(xué)說(shuō)1885年Roux用生理鹽水成功培養(yǎng)雞胚組織1907年Harrison成功培養(yǎng)了離體的蛙胚神經(jīng)組織，并觀察到神經(jīng)細(xì)胞突起的生長(zhǎng)過(guò)程。開(kāi)創(chuàng)現(xiàn)代細(xì)胞培養(yǎng)的新紀(jì)元。本文檔共108頁(yè)；當(dāng)前第5頁(yè)；編輯于星期三\12點(diǎn)23分細(xì)胞工程是以細(xì)胞為單位，按人們的意志，應(yīng)用細(xì)胞生物學(xué)、分子生物學(xué)等理論和技術(shù)，有目的地進(jìn)行精心設(shè)計(jì)，精心操作，使細(xì)胞的某些遺傳特性發(fā)生改變，從而達(dá)到改良或產(chǎn)生新品種的目的，以及使細(xì)胞增加或重新獲得產(chǎn)生某種特定產(chǎn)物的能力，從而在離體條件下進(jìn)行大量培養(yǎng)、增殖，并提取出對(duì)人類有用的產(chǎn)品。本文檔共108頁(yè)；當(dāng)前第6頁(yè)；編輯于星期三\12點(diǎn)23分二、動(dòng)物細(xì)胞的化學(xué)組成和代謝動(dòng)物細(xì)胞的化學(xué)組成

無(wú)機(jī)成分：水、無(wú)機(jī)鹽

有機(jī)成分：蛋白質(zhì)、糖類、脂類、核酸動(dòng)物細(xì)胞的代謝

糖，脂肪和蛋白質(zhì)的代謝分為三個(gè)降解階段（大分子降解為小分子，小分子代謝產(chǎn)生三個(gè)主要的中間產(chǎn)物，中間產(chǎn)物進(jìn)入三羧酸循環(huán)）本文檔共108頁(yè)；當(dāng)前第7頁(yè)；編輯于星期三\12點(diǎn)23分三、動(dòng)物細(xì)胞的生理特點(diǎn)細(xì)胞的分裂周期長(zhǎng)：一般12~48h細(xì)胞生長(zhǎng)需貼附于基質(zhì)，并有接觸抑制現(xiàn)象接觸抑制現(xiàn)象：指細(xì)胞在生長(zhǎng)過(guò)程中達(dá)到相互接觸時(shí)停止分裂的現(xiàn)象。正常二倍體細(xì)胞的生長(zhǎng)壽命是有限的:時(shí)間長(zhǎng)短決定于細(xì)胞來(lái)源的種族和年齡

原代培養(yǎng)

有限細(xì)胞系

無(wú)限細(xì)胞系（連續(xù)細(xì)胞系）本文檔共108頁(yè)；當(dāng)前第8頁(yè)；編輯于星期三\12點(diǎn)23分動(dòng)物細(xì)胞對(duì)周圍環(huán)境十分敏感

對(duì)理化因素敏感：如滲透壓、pH、離子強(qiáng)度、剪切力、微量元素等。動(dòng)物細(xì)胞對(duì)培養(yǎng)基的要求高必需氨基酸、維生素、無(wú)機(jī)鹽、微量元素、葡萄糖、細(xì)胞生長(zhǎng)因子、貼壁因子等。動(dòng)物細(xì)胞對(duì)蛋白質(zhì)的合成途徑和修飾功能與細(xì)菌不同

本文檔共108頁(yè)；當(dāng)前第9頁(yè)；編輯于星期三\12點(diǎn)23分動(dòng)物細(xì)胞生產(chǎn)藥物缺點(diǎn)：培養(yǎng)條件高、成本貴、產(chǎn)量低優(yōu)點(diǎn)：分泌胞外、收集純化方便，較完善的翻譯后修飾，與天然產(chǎn)品一致本文檔共108頁(yè)；當(dāng)前第10頁(yè)；編輯于星期三\12點(diǎn)23分第三節(jié)生產(chǎn)用動(dòng)物細(xì)胞的要求和獲得一、生產(chǎn)用動(dòng)物細(xì)胞的要求二、生產(chǎn)動(dòng)物細(xì)胞的獲得三、基因工程細(xì)胞的構(gòu)建和篩選四、常用生產(chǎn)用動(dòng)物細(xì)胞的特性五、細(xì)胞庫(kù)的建立本文檔共108頁(yè)；當(dāng)前第11頁(yè)；編輯于星期三\12點(diǎn)23分一、生產(chǎn)用動(dòng)物細(xì)胞的要求只有從正常組織中分離的原代細(xì)胞才能用來(lái)生產(chǎn)生物制品，如雞胚細(xì)胞、兔腎細(xì)胞等二倍體細(xì)胞，即使經(jīng)過(guò)多次傳代也可用于生產(chǎn)，如WI-38，2BS細(xì)胞等用異倍體傳代細(xì)胞生產(chǎn)重組基因產(chǎn)品，如t-PA、EPO、Ⅷ因子等按照FDA對(duì)細(xì)胞株的要求，控制最終產(chǎn)品中DNA殘留量本文檔共108頁(yè)；當(dāng)前第12頁(yè)；編輯于星期三\12點(diǎn)23分二、生產(chǎn)用動(dòng)物細(xì)胞的獲得原代細(xì)胞：直接取自動(dòng)物組織、器官，經(jīng)過(guò)粉碎、消化而獲得的細(xì)胞懸液。如雞胚細(xì)胞、原代兔腎細(xì)胞或鼠腎細(xì)胞、淋巴細(xì)胞等用原代細(xì)胞生產(chǎn)生物制品常需要大量的動(dòng)物，費(fèi)錢費(fèi)力本文檔共108頁(yè)；當(dāng)前第13頁(yè)；編輯于星期三\12點(diǎn)23分二倍體細(xì)胞系：原代細(xì)胞經(jīng)過(guò)傳代、篩選、克隆，從多種細(xì)胞成分的組織中挑選并純化出某種具有一定特征的細(xì)胞株由于該類細(xì)胞壽命有限，一般從動(dòng)物的胚胎組織中獲取。如WI-38、MRC-5、2BS等本文檔共108頁(yè)；當(dāng)前第14頁(yè)；編輯于星期三\12點(diǎn)23分轉(zhuǎn)化細(xì)胞系：失去了正常細(xì)胞的特點(diǎn)，獲得了無(wú)限增殖的能力轉(zhuǎn)化細(xì)胞系具有無(wú)限生命力，常常倍增時(shí)間較短，對(duì)培養(yǎng)條件和生長(zhǎng)因子等要求較低，更適于大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)。如Namalwa、CHO、BHK-21、Vero細(xì)胞等本文檔共108頁(yè)；當(dāng)前第15頁(yè)；編輯于星期三\12點(diǎn)23分融合細(xì)胞系細(xì)胞融合：指兩個(gè)或兩個(gè)以上的細(xì)胞合并成一個(gè)細(xì)胞的過(guò)程目前常用的融合方法有：仙臺(tái)病毒融合法、聚乙二醇融合法、電融合法本文檔共108頁(yè)；當(dāng)前第16頁(yè)；編輯于星期三\12點(diǎn)23分仙臺(tái)病毒融合法（很少使用）融合過(guò)程：病毒加入兩種細(xì)胞（4℃），附膜，細(xì)胞凝聚37℃，病毒與細(xì)胞膜反應(yīng)，細(xì)胞膜被破壞兩細(xì)胞連接部穿通，周邊連接部修復(fù)細(xì)胞融合本文檔共108頁(yè)；當(dāng)前第17頁(yè)；編輯于星期三\12點(diǎn)23分聚乙二醇（PEG）融合法常用相對(duì)分子量為1000，濃度為50%，pH在8.0~8.2時(shí)融合率可達(dá)100%目前主要用于產(chǎn)生單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞的制備本文檔共108頁(yè)；當(dāng)前第18頁(yè)；編輯于星期三\12點(diǎn)23分電融合法：在短時(shí)間的強(qiáng)電場(chǎng)作用下，細(xì)胞膜發(fā)生可逆性的電擊穿，使相鄰細(xì)胞的細(xì)胞膜發(fā)生繼發(fā)性融合。優(yōu)點(diǎn)：操作簡(jiǎn)單，無(wú)化學(xué)毒性、對(duì)細(xì)胞損傷小、融合同步、融合率高，可在顯微鏡下直接觀察決定因素：電場(chǎng)強(qiáng)度、脈沖寬度、溫度、緩沖液的性質(zhì)（pH、離子強(qiáng)度、滲透壓）本文檔共108頁(yè)；當(dāng)前第19頁(yè)；編輯于星期三\12點(diǎn)23分重組工程細(xì)胞系可采用基因工程的手段構(gòu)建各種工程細(xì)胞本文檔共108頁(yè)；當(dāng)前第20頁(yè)；編輯于星期三\12點(diǎn)23分三、基因工程細(xì)胞的構(gòu)建和篩選1.真核細(xì)胞基因表達(dá)載體的構(gòu)建病毒載體：如牛痘病毒、腺病毒、反轉(zhuǎn)率病毒、桿

狀病毒等質(zhì)粒載體：穿梭質(zhì)粒載體本文檔共108頁(yè)；當(dāng)前第21頁(yè)；編輯于星期三\12點(diǎn)23分用桿狀病毒做載體的優(yōu)點(diǎn)該病毒基因組是雙鏈DNA，容易進(jìn)行重組；插入7~8kb的DNA不影響正常病毒粒子的形成；多角體蛋白和病毒粒子的形成無(wú)直接關(guān)系，因此用外源基因更換多角體蛋白基因，仍能形成有感染力的病毒粒子；多角體蛋白基因有非常強(qiáng)的啟動(dòng)子，產(chǎn)生的蛋白質(zhì)可占全部蛋白質(zhì)的20~30%；用光學(xué)顯微鏡可看到多角體，容易以此為標(biāo)記物來(lái)挑選陽(yáng)性克?。蝗绻眉倚Q桿狀病毒，還可在蠶體直接表達(dá)外源基因。本文檔共108頁(yè)；當(dāng)前第22頁(yè)；編輯于星期三\12點(diǎn)23分構(gòu)建質(zhì)粒載體一般含有如下基本成分：允許載體在細(xì)菌體內(nèi)擴(kuò)增的質(zhì)粒序列。含有能使基因轉(zhuǎn)錄表達(dá)的調(diào)控元件。能用以篩選出外源基因已整合的選擇標(biāo)記。僅適用于密切相關(guān)的突變細(xì)胞株，如tk基因顯性作用基因，如neo基因有時(shí)還帶有選擇性增加拷貝數(shù)的擴(kuò)增系統(tǒng)。本文檔共108頁(yè)；當(dāng)前第23頁(yè)；編輯于星期三\12點(diǎn)23分2.基因載體的導(dǎo)入和高效表達(dá)工程細(xì)胞株的篩選

融合法化學(xué)法物理法病毒法細(xì)胞融合法DNA-磷酸鈣沉淀法電穿孔法重組逆轉(zhuǎn)錄病毒介導(dǎo)法脂質(zhì)體介導(dǎo)法DEAE-葡聚糖法顯微注射法重組DNA病毒介導(dǎo)法原生質(zhì)融合法染色體介導(dǎo)法基因槍法多瘤病毒樣顆粒介導(dǎo)法微細(xì)胞介導(dǎo)法鬼影紅細(xì)胞介導(dǎo)法DNA導(dǎo)入動(dòng)物細(xì)胞的常用方法本文檔共108頁(yè)；當(dāng)前第24頁(yè)；編輯于星期三\12點(diǎn)23分磷酸鈣沉淀法：將溶解的DNA加在Na2HPO4中，逐漸加入CaCl2溶液，當(dāng)Na2HPO4和CaCl2形成沉淀，DNA包裹在沉淀中，形成DNA-磷酸鈣共沉淀物，當(dāng)沉淀物與細(xì)胞表面接觸時(shí)，通過(guò)吞噬作用將DNA導(dǎo)入胞內(nèi)。優(yōu)點(diǎn)：方法簡(jiǎn)單，可進(jìn)行共轉(zhuǎn)化本文檔共108頁(yè)；當(dāng)前第25頁(yè)；編輯于星期三\12點(diǎn)23分電穿孔法：借助電穿孔儀產(chǎn)生的高壓脈沖電場(chǎng)，使細(xì)胞膜出現(xiàn)瞬時(shí)可逆性的小孔，外源DNA沿小孔進(jìn)入細(xì)胞。特點(diǎn)：轉(zhuǎn)化效率較高，但進(jìn)入的DNA拷貝數(shù)較低本文檔共108頁(yè)；當(dāng)前第26頁(yè)；編輯于星期三\12點(diǎn)23分如何篩選工程細(xì)胞？依靠構(gòu)建載體內(nèi)的選擇標(biāo)記采用相應(yīng)的篩選系統(tǒng)：如用HAT（次黃嘌呤、氨基喋呤、胸腺嘧啶）選擇系統(tǒng)，篩選tk+、hgprt+的轉(zhuǎn)化細(xì)胞；用G418（Geneticin）選擇系統(tǒng)，篩選neor的轉(zhuǎn)化細(xì)胞。對(duì)選出的細(xì)胞進(jìn)行克隆和亞克隆使其純化。利用擴(kuò)增系統(tǒng)，不斷增加其基因拷貝數(shù)，獲得高效表達(dá)而穩(wěn)定的工程細(xì)胞株。本文檔共108頁(yè)；當(dāng)前第27頁(yè)；編輯于星期三\12點(diǎn)23分四、常用生產(chǎn)用細(xì)胞的特性（1）WI-38：1961年來(lái)源于女性高加索人正常胚肺組織的二倍體細(xì)胞系。

該細(xì)胞是成纖維細(xì)胞，能產(chǎn)生膠原，培養(yǎng)基用BME（Eagle’sbasalmedium）加小牛血清，pH控制在7.2。細(xì)胞的倍增時(shí)間為24h，有限壽命為50代，上世紀(jì)60年代被廣泛用于制備疫苗。本文檔共108頁(yè)；當(dāng)前第28頁(yè)；編輯于星期三\12點(diǎn)23分（2）BHK-21：1961年從5只生長(zhǎng)1天的地鼠幼鼠的腎臟中分離的?，F(xiàn)在廣泛采用的是1963年用單細(xì)胞分離的方法經(jīng)13次的克隆的細(xì)胞。

成纖維細(xì)胞，2n=44。通常用的培養(yǎng)基為DMEM培養(yǎng)基，添加7%胎牛血清。過(guò)去多用于增殖病毒，包括多瘤病毒、口蹄疫病毒和狂犬病疫苗，現(xiàn)在已被用于構(gòu)建工程細(xì)胞。本文檔共108頁(yè)；當(dāng)前第29頁(yè)；編輯于星期三\12點(diǎn)23分（3）Vero：

1962年來(lái)源于正常的成年非洲綠猴腎。

是貼壁依賴的成纖維細(xì)胞，2n=60，高倍體率為1.7%，可持續(xù)地進(jìn)行培養(yǎng)。通常用的培養(yǎng)基為199培養(yǎng)基，添加5%胎牛血清。該細(xì)胞可支持多種病毒的增殖，包括脊髓灰質(zhì)炎、狂犬病病毒，已被批準(zhǔn)用于人體。本文檔共108頁(yè)；當(dāng)前第30頁(yè)；編輯于星期三\12點(diǎn)23分（4）Namalwa：1972年來(lái)源于肯尼亞患有Burkitt淋巴瘤的病人體中，后在瑞典構(gòu)建的一株人的類淋巴母細(xì)胞。

該細(xì)胞有2.8%的高倍體率，多數(shù)細(xì)胞有12~14條標(biāo)記染色體，單條X染色體，無(wú)Y染色體。通常用的培養(yǎng)基為RPMI1640，添加7%胎牛血清。用于大規(guī)模生產(chǎn)-干擾素。本文檔共108頁(yè)；當(dāng)前第31頁(yè)；編輯于星期三\12點(diǎn)23分五、細(xì)胞庫(kù)的建立用于生產(chǎn)的工程細(xì)胞必須建立兩個(gè)細(xì)胞庫(kù)：1.原始細(xì)胞庫(kù)（mastercellbank，MCB）2.生產(chǎn)用細(xì)胞庫(kù)（manugacture’sworkingcellbank，MWCB），或稱工作細(xì)胞庫(kù)（workingcellbank，WCB）。本文檔共108頁(yè)；當(dāng)前第32頁(yè)；編輯于星期三\12點(diǎn)23分

原始細(xì)胞庫(kù)是單一來(lái)源的均質(zhì)的細(xì)胞，對(duì)于二倍體細(xì)胞應(yīng)該是群體倍增水平盡可能低的細(xì)胞。貯存時(shí)須有該細(xì)胞的詳細(xì)檔案，包括：該細(xì)胞系的歷史：來(lái)源、年齡和性別、細(xì)胞分離的方法、所用的培養(yǎng)材料等；該細(xì)胞系的特性：形態(tài)、生長(zhǎng)的特性、種源的特性等；對(duì)各種有害因子檢查的結(jié)果。本文檔共108頁(yè)；當(dāng)前第33頁(yè)；編輯于星期三\12點(diǎn)23分生產(chǎn)用細(xì)胞庫(kù)：從原始細(xì)胞庫(kù)來(lái)，或從單一安瓿來(lái)，或從多個(gè)安瓿在融化即刻混合在一起的，然后經(jīng)培養(yǎng)擴(kuò)增到一定數(shù)量后，再分裝儲(chǔ)存形成的細(xì)胞庫(kù)。生產(chǎn)用細(xì)胞庫(kù)也必須建立檔案，而且需要進(jìn)行無(wú)菌性和無(wú)細(xì)胞交叉污染的檢查，生產(chǎn)時(shí)需確定其最高使用的傳代數(shù)。本文檔共108頁(yè)；當(dāng)前第34頁(yè)；編輯于星期三\12點(diǎn)23分第四節(jié)動(dòng)物細(xì)胞的培養(yǎng)條件和培養(yǎng)基培養(yǎng)成功必備條件：所有與細(xì)胞接觸的設(shè)備、器材和溶液，都必須保持絕對(duì)無(wú)菌，避免細(xì)胞外微生物的污染必須有足夠的營(yíng)養(yǎng)供應(yīng)，絕對(duì)不可有有害的物質(zhì)，避免即使是極微量的有害離子的摻入保證有適量的氧氣供應(yīng)需要隨時(shí)清除細(xì)胞代謝中產(chǎn)生的有害產(chǎn)物有良好的適于生存的外界環(huán)境及時(shí)分種，保持合適的細(xì)胞密度本文檔共108頁(yè)；當(dāng)前第35頁(yè)；編輯于星期三\12點(diǎn)23分一、動(dòng)物細(xì)胞的培養(yǎng)條件器材的清洗和消毒水質(zhì)pH滲透壓溫度空氣本文檔共108頁(yè)；當(dāng)前第36頁(yè)；編輯于星期三\12點(diǎn)23分1.器材的清洗和消毒（1）器材的清洗：浸泡（3%磷酸三鈉）刷洗泡酸（重鉻酸鉀、硫酸、水）沖洗（自來(lái)水、蒸餾水、去離子水）（2）器材的消毒滅菌：

物理方法：如紫外線、干熱、濕熱、過(guò)濾化學(xué)方法：如化學(xué)消毒劑、抗生素本文檔共108頁(yè)；當(dāng)前第37頁(yè)；編輯于星期三\12點(diǎn)23分2.水質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng)的水必須進(jìn)行特殊的處理，才能使用。除微生物、有毒元素、金屬離子、熱原質(zhì)當(dāng)前處理水質(zhì)的方法有：蒸餾、離子交換、電滲透、反滲透、中空纖維過(guò)濾等本文檔共108頁(yè)；當(dāng)前第38頁(yè)；編輯于星期三\12點(diǎn)23分3.pH動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)的最適pH為7.2~7.4，低于6.8或高于7.6會(huì)對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生不利影響，嚴(yán)重時(shí)可引起細(xì)胞退變甚至死亡。培養(yǎng)基應(yīng)具有一定的緩沖能力，必須加入緩沖系統(tǒng)：如HEPES、Na2HPO4/

NaH2PO4緩沖系統(tǒng)、NaHCO3/CO2緩沖系統(tǒng)等本文檔共108頁(yè)；當(dāng)前第39頁(yè)；編輯于星期三\12點(diǎn)23分4.滲透壓細(xì)胞必須生活在等滲環(huán)境中，大多數(shù)培養(yǎng)細(xì)胞對(duì)滲透壓有一定耐受性。最理想的滲透壓為290~300mOsm/kg為調(diào)整培養(yǎng)液的滲透壓，一般采用加減NaCl的方法：1mg/mlNaCl---32mOsm/kg在細(xì)胞培養(yǎng)操作中，為保持合適的滲透壓和pH，一般都使用平衡鹽溶液（BBS），由無(wú)機(jī)鹽和葡萄糖組成。本文檔共108頁(yè)；當(dāng)前第40頁(yè)；編輯于星期三\12點(diǎn)23分5.溫度動(dòng)物細(xì)胞最佳培養(yǎng)溫度：37±0.5℃昆蟲細(xì)胞最佳培養(yǎng)溫度：27℃溫度過(guò)高：細(xì)胞退變甚至死亡溫度過(guò)低：降低代謝和生長(zhǎng)速度，影響產(chǎn)量本文檔共108頁(yè)；當(dāng)前第41頁(yè)；編輯于星期三\12點(diǎn)23分6.空氣方瓶和轉(zhuǎn)瓶培養(yǎng)時(shí)，保持瓶?jī)?nèi)有足夠的空間，即培養(yǎng)的液體量不超過(guò)總體積的30%。采用生物反應(yīng)器需通氣，采用不同比例的O2、N2、CO2和空氣。本文檔共108頁(yè)；當(dāng)前第42頁(yè)；編輯于星期三\12點(diǎn)23分無(wú)毒、無(wú)污染體外生長(zhǎng)的細(xì)胞對(duì)微生物及一些有害有毒物質(zhì)沒(méi)有任何抵抗能力，因此培養(yǎng)基應(yīng)達(dá)到：無(wú)化學(xué)物質(zhì)污染無(wú)微生物污染（如細(xì)菌、真菌、支原體、病毒等）無(wú)對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生損傷作用的生物活性物質(zhì)污染（如抗體、補(bǔ)體）對(duì)于天然培養(yǎng)基，污染主要來(lái)源于取材過(guò)程及生物材料本身，應(yīng)當(dāng)嚴(yán)格選材，嚴(yán)格操作對(duì)于合成培養(yǎng)基，污染主要來(lái)源于配置過(guò)程，配制所用的水、器皿應(yīng)十分潔凈，配置后應(yīng)嚴(yán)格過(guò)濾除菌。本文檔共108頁(yè)；當(dāng)前第43頁(yè)；編輯于星期三\12點(diǎn)23分二、動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)基的種類和組成1.天然培養(yǎng)基指來(lái)自動(dòng)物體液或利用組織分離提取的一類培養(yǎng)基，如血漿凝塊、血清、淋巴液、胚胎浸液以及羊水、腹水等。缺點(diǎn)：成分復(fù)雜，制作過(guò)程復(fù)雜，組分不穩(wěn)定，批間差異大，來(lái)源有限，不適于大量培養(yǎng)和生產(chǎn)的需要，逐漸為合成培養(yǎng)基所替代。本文檔共108頁(yè)；當(dāng)前第44頁(yè)；編輯于星期三\12點(diǎn)23分2.合成培養(yǎng)基優(yōu)點(diǎn)：成分明確，組分穩(wěn)定，可大量生產(chǎn)供應(yīng)其組成大致如下：氨基酸：是細(xì)胞合成蛋白質(zhì)的原料。所有細(xì)胞都需要12種必需氨基酸：纈、亮、異亮、蘇、賴、色、苯丙、蛋、組、酪、精、胱。此外還需要谷氨酰胺，它在細(xì)胞代謝過(guò)程中有重要作用，所含的氮是核酸中嘌呤和嘧啶合成的來(lái)源，同樣也是合成三、二、一磷酸酰苷所需要的基本物質(zhì)。本文檔共108頁(yè)；當(dāng)前第45頁(yè)；編輯于星期三\12點(diǎn)23分維生素：主要是形成酶的輔酶、輔基，維持細(xì)胞生命活動(dòng)的低分子活性物質(zhì)。脂溶性（A、D、E、K），水溶性維生素（C、B1、B2、B12、生物素、葉酸、膽堿）等都是常用的成分。糖類:培養(yǎng)中的細(xì)胞可以進(jìn)行有氧與無(wú)氧酵解，六碳糖是主要能源。此外六碳糖也是也是合成某些氨基酸、脂肪、核酸的原料。細(xì)胞對(duì)葡萄糖的吸收能力最高，半乳糖最低。本文檔共108頁(yè)；當(dāng)前第46頁(yè)；編輯于星期三\12點(diǎn)23分無(wú)機(jī)鹽：保持細(xì)胞的滲透壓，緩沖pH的變化，并積極參與細(xì)胞的代謝。細(xì)胞生長(zhǎng)除需Na、K、Ca、Mg、N、P等基本元素，還需要Fe、Cu、Zn、Mn等微量元素。其它成分：有些合成培養(yǎng)基中還加有核酸的前體、氧化還原劑等。一般都需要加入5~10%的小牛血清。

除了以上與細(xì)胞生長(zhǎng)有關(guān)的物質(zhì)以外，培養(yǎng)基中一般還要加入一種pH指示劑酚紅。當(dāng)溶液酸性時(shí)pH＜6.8呈黃色，當(dāng)溶液堿性時(shí)pH＞8.4呈紅色。本文檔共108頁(yè)；當(dāng)前第47頁(yè)；編輯于星期三\12點(diǎn)23分血清的主要成分血清是由血漿去除纖維蛋白而形成的，血清中含有各種血漿蛋白、多肽、脂肪、碳水化合物、生長(zhǎng)因子、激素、無(wú)機(jī)物等本文檔共108頁(yè)；當(dāng)前第48頁(yè)；編輯于星期三\12點(diǎn)23分血清的種類小牛血清：取自出生10-30天的小牛新牛血清：取自出生24h之內(nèi)的新生牛胎牛血清：取自剖腹產(chǎn)的胎牛，血清中所含的抗體、補(bǔ)體等對(duì)細(xì)胞有害的成分最少。本文檔共108頁(yè)；當(dāng)前第49頁(yè)；編輯于星期三\12點(diǎn)23分血清的外觀好的血清應(yīng)該是透明清亮，土黃色或棕黃色，無(wú)沉淀或極少沉淀，比較粘稠。如血清渾濁、不透明、含許多沉淀物，說(shuō)明血清污染或血清中的蛋白質(zhì)變性。若血清呈棕紅色，說(shuō)明血清中的血紅蛋白含量太高，取材時(shí)有溶血現(xiàn)象。搖晃時(shí)感覺(jué)液體稀薄，說(shuō)明血清中摻入的生理鹽水太多。本文檔共108頁(yè)；當(dāng)前第50頁(yè)；編輯于星期三\12點(diǎn)23分血清的作用機(jī)制提供有利于細(xì)胞生長(zhǎng)增殖所需的各種生長(zhǎng)因子和激素提供有利于細(xì)胞貼壁所需的貼附因子和伸展因子提供可識(shí)別金屬、激素、維生素和脂質(zhì)的結(jié)合蛋白提供細(xì)胞生長(zhǎng)所必需的脂肪酸和微量元素提供良好的pH緩沖系統(tǒng)本文檔共108頁(yè)；當(dāng)前第51頁(yè)；編輯于星期三\12點(diǎn)23分3.無(wú)血清培養(yǎng)基優(yōu)點(diǎn)：提高了細(xì)胞培養(yǎng)的可重復(fù)性，避免了由于血清批次之間差異的影響；減少了由血清帶來(lái)病毒、真菌和支原體等微生物污染的危險(xiǎn)；供應(yīng)充足、穩(wěn)定；細(xì)胞產(chǎn)品容易純化；避免了血清中某些因素對(duì)有些細(xì)胞的毒性；減少了血清中蛋白對(duì)某些生物測(cè)定的干擾，便于實(shí)驗(yàn)結(jié)果的分析。本文檔共108頁(yè)；當(dāng)前第52頁(yè)；編輯于星期三\12點(diǎn)23分無(wú)血清培養(yǎng)基：合成培養(yǎng)基+不同種類的添加劑添加劑大致有以下幾類：激素和生長(zhǎng)因子：

各種激素、生長(zhǎng)因子的功能維持細(xì)胞的功能保持細(xì)胞的狀態(tài)（分化或未分化）使用最多的是胰島素，促進(jìn)糖原和脂肪酸的合成，對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)有刺激作用。無(wú)血清培養(yǎng)基本文檔共108頁(yè)；當(dāng)前第53頁(yè)；編輯于星期三\12點(diǎn)23分結(jié)合蛋白：最經(jīng)常被補(bǔ)充的是鐵傳遞蛋白和白蛋白。為了便于純化，有時(shí)可用硫酸亞鐵、檸檬酸鐵、葡萄糖酸鐵代替鐵傳遞蛋白。貼附和伸展因子：目前多數(shù)無(wú)血清培養(yǎng)基只適用于懸浮細(xì)胞，真正能用以培養(yǎng)貼壁細(xì)胞的很少，也很貴，原因在于它們均缺少必需的貼附和伸展因子。除貼附因子（纖維結(jié)合蛋白、膠原）、多肽生長(zhǎng)因子，有的還添加維生素A酸和重組的小肽，它可與細(xì)胞的受體結(jié)合。其它有利于細(xì)胞生長(zhǎng)的因子和元素：它們包括有消除氧自由基損害的谷胱甘肽，某些微量元素，如硒等。本文檔共108頁(yè)；當(dāng)前第54頁(yè)；編輯于星期三\12點(diǎn)23分如何選擇培養(yǎng)基選擇培養(yǎng)基沒(méi)有一定的標(biāo)準(zhǔn)，有幾點(diǎn)建議可供參考：建立某種細(xì)胞株所用的培養(yǎng)基應(yīng)該是培養(yǎng)這種細(xì)胞首選的培養(yǎng)基。可以查閱參考文獻(xiàn)，或在購(gòu)買細(xì)胞株時(shí)咨詢。根據(jù)細(xì)胞株的特點(diǎn)、實(shí)驗(yàn)的需要來(lái)選擇培養(yǎng)基。用多種培養(yǎng)基培養(yǎng)目的細(xì)胞，觀察其生長(zhǎng)狀態(tài)，可以用生長(zhǎng)曲線、集落形成率等指標(biāo)判斷，根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果選擇最佳培養(yǎng)基，這是最客觀的方法。本文檔共108頁(yè)；當(dāng)前第55頁(yè)；編輯于星期三\12點(diǎn)23分培養(yǎng)細(xì)胞的種類：

原代細(xì)胞培養(yǎng)

傳代細(xì)胞培養(yǎng)培養(yǎng)基不同：

液體培養(yǎng)

固體培養(yǎng)培養(yǎng)容器和方式不同：

靜止培養(yǎng)

旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)

微載體培養(yǎng)

中空纖維培養(yǎng)

固定化培養(yǎng)第五節(jié)動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)的基本方法本文檔共108頁(yè)；當(dāng)前第56頁(yè)；編輯于星期三\12點(diǎn)23分一、細(xì)胞分離離心分離法：主要用于從含有細(xì)胞的體液，如血液、羊水、胸腹水中分離細(xì)胞，800~1000r/min離心5~10min消化分離法：將生物體的組織塊剪碎---用消化液消化，使組織松散成細(xì)胞懸液---用緩沖液洗滌、離心、去除殘留的消化液---獲得所需細(xì)胞本文檔共108頁(yè)；當(dāng)前第57頁(yè)；編輯于星期三\12點(diǎn)23分消化液的用途：取材進(jìn)行原代培養(yǎng)時(shí)需要將組織塊消化解離形成細(xì)胞懸液；傳代培養(yǎng)時(shí)將貼壁細(xì)胞從瓶壁上消化下來(lái)。常用的消化液:胰蛋白酶、乙二胺四乙酸（EDTA）、胰酶-檸檬酸鹽、胰酶-EDTA、膠原酶、鏈酶蛋白酶、木瓜蛋白酶等本文檔共108頁(yè)；當(dāng)前第58頁(yè)；編輯于星期三\12點(diǎn)23分二、細(xì)胞計(jì)數(shù)自動(dòng)細(xì)胞計(jì)數(shù)器計(jì)數(shù)原理：讓一定體積的細(xì)胞懸液流經(jīng)一個(gè)小孔，并在兩個(gè)電極間通過(guò)，此時(shí)通過(guò)的細(xì)胞就會(huì)對(duì)電極間的電流產(chǎn)生干擾而使電壓發(fā)生改變，這樣就會(huì)在電子計(jì)數(shù)器上形成一個(gè)信號(hào)被記錄下來(lái)。優(yōu)點(diǎn)：計(jì)數(shù)速度快缺點(diǎn)：無(wú)法分辨活細(xì)胞和死細(xì)胞，誤將細(xì)胞結(jié)團(tuán)記錄為單個(gè)細(xì)胞，使計(jì)數(shù)值偏低本文檔共108頁(yè)；當(dāng)前第59頁(yè)；編輯于星期三\12點(diǎn)23分血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)本文檔共108頁(yè)；當(dāng)前第60頁(yè)；編輯于星期三\12點(diǎn)23分2.血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)臺(tái)酚藍(lán)染色：死細(xì)胞呈藍(lán)色苯胺黑染色：負(fù)染色法，細(xì)胞本身不染色本文檔共108頁(yè)；當(dāng)前第61頁(yè)；編輯于星期三\12點(diǎn)23分結(jié)晶紫染色細(xì)胞核計(jì)數(shù)法原理：結(jié)晶紫染液屬堿性染料，低滲，有螯合鈣離子的作用，可使細(xì)胞分散解離和破碎，將細(xì)胞核染成藍(lán)色。染色后取樣在血球計(jì)數(shù)板上鏡檢，計(jì)數(shù)細(xì)胞核即細(xì)胞數(shù)。本文檔共108頁(yè)；當(dāng)前第62頁(yè)；編輯于星期三\12點(diǎn)23分MTT染色計(jì)數(shù)法MTT:3-(4，5-二甲基噻唑-2)-2，5-二苯基四氮唑溴鹽，商品名：噻唑藍(lán)。是一種黃顏色的染料。原理：活細(xì)胞內(nèi)的線粒體脫氫酶能將MTT轉(zhuǎn)變?yōu)椴豢扇苄缘淖仙募着H結(jié)晶，可溶于二甲亞砜（DMSO）。MTT結(jié)晶形成的量與細(xì)胞數(shù)成正比。用酶標(biāo)儀在490nm處測(cè)定其吸光值，可間接反映活細(xì)胞數(shù)量。靈敏度高；MTT有致癌性，DMSO極易滲透皮膚本文檔共108頁(yè)；當(dāng)前第63頁(yè)；編輯于星期三\12點(diǎn)23分三、細(xì)胞傳代懸浮細(xì)胞的傳代：加入一倍或幾倍的生長(zhǎng)液，然后分種兩只或多只培養(yǎng)瓶貼壁細(xì)胞的傳代：先消化再分種本文檔共108頁(yè)；當(dāng)前第64頁(yè)；編輯于星期三\12點(diǎn)23分貼壁細(xì)胞傳代的注意事項(xiàng)消化前確定細(xì)胞有無(wú)污染加入消化液量要適當(dāng)，搖動(dòng)時(shí)能蓋滿單層細(xì)胞即可消化時(shí)間不宜過(guò)長(zhǎng)，室溫靜置2-5min終止消化要先去掉消化液，然后加入有血清的培養(yǎng)基分種數(shù)量取決于細(xì)胞數(shù)和細(xì)胞特性，多數(shù)以20-30萬(wàn)個(gè)/ml，每次1傳2或1傳3為宜；已培養(yǎng)過(guò)的瓶子可再次使用，但不要超過(guò)2-3次二倍體細(xì)胞每次傳代時(shí)應(yīng)寫上傳代次數(shù)傳代后每天或隔一天換液，3-5d傳代一次本文檔共108頁(yè)；當(dāng)前第65頁(yè)；編輯于星期三\12點(diǎn)23分四、細(xì)胞的凍存和復(fù)蘇1.細(xì)胞的凍存采用液氮低溫（-196℃）凍存：加保護(hù)劑如甘油和二甲亞砜；冷凍速度以1℃/min的速度下降為宜注意事項(xiàng)：凍存前一天換液培養(yǎng)；細(xì)胞密度以1-2×106個(gè)/ml為宜；凍存用培養(yǎng)基應(yīng)與實(shí)際使用的一致，DMSO過(guò)濾除菌；檢查安踣的密封性；標(biāo)簽要寫上細(xì)胞名稱，編號(hào)和凍存日期。本文檔共108頁(yè)；當(dāng)前第66頁(yè)；編輯于星期三\12點(diǎn)23分2.細(xì)胞的復(fù)蘇（總的要求是快融）注意事項(xiàng)：操作中注意防護(hù)，戴面罩和手套；從液氮中取出后，立即丟入37-40℃溫水的搪瓷杯中，并攪動(dòng)加速融化；用乙醇消毒安踣外表；盡早除去二甲亞砜，離心，換新鮮培養(yǎng)液；隔天觀察細(xì)胞生長(zhǎng)情況，再換液一次。本文檔共108頁(yè)；當(dāng)前第67頁(yè)；編輯于星期三\12點(diǎn)23分一、動(dòng)物細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)的方法二、動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)的操作方式第六節(jié)動(dòng)物細(xì)胞大量培養(yǎng)的方法和操作方式本文檔共108頁(yè)；當(dāng)前第68頁(yè)；編輯于星期三\12點(diǎn)23分一、動(dòng)物細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)的方法依細(xì)胞種類：

原代培養(yǎng)

傳代培養(yǎng)依培養(yǎng)基：

液體培養(yǎng)

固體培養(yǎng)本文檔共108頁(yè)；當(dāng)前第69頁(yè)；編輯于星期三\12點(diǎn)23分依培養(yǎng)容器和方式：

靜止培養(yǎng)、旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)、

攪拌培養(yǎng)、微載體培養(yǎng)

中空纖維培養(yǎng)、

固定床或流化床培養(yǎng)本文檔共108頁(yè)；當(dāng)前第70頁(yè)；編輯于星期三\12點(diǎn)23分從生產(chǎn)實(shí)際分為：

懸浮培養(yǎng)

貼壁培養(yǎng)

貼壁-懸浮培養(yǎng)本文檔共108頁(yè)；當(dāng)前第71頁(yè)；編輯于星期三\12點(diǎn)23分1.懸浮培養(yǎng)懸浮培養(yǎng)：即讓細(xì)胞自由地懸浮于培養(yǎng)基內(nèi)生長(zhǎng)繁殖。適用于一切種類的非貼壁依賴性細(xì)胞（懸浮細(xì)胞），也適用于兼性貼壁細(xì)胞。優(yōu)點(diǎn)：操作簡(jiǎn)便，培養(yǎng)條件比較單一，傳質(zhì)和傳氧較好，容易擴(kuò)大培養(yǎng)規(guī)模，在培養(yǎng)設(shè)備的設(shè)計(jì)和實(shí)際操作中可借鑒細(xì)菌發(fā)酵的經(jīng)驗(yàn)；可連續(xù)收集部分細(xì)胞進(jìn)行移植繼代培養(yǎng)，傳代時(shí)無(wú)需消化分散，免遭酶類、EDTA及機(jī)械損害；細(xì)胞收率高，并可連續(xù)測(cè)定細(xì)胞濃度，還有可能實(shí)現(xiàn)大規(guī)模直接克隆培養(yǎng)。缺點(diǎn)：細(xì)胞體積較小，較難采用灌流培養(yǎng)，細(xì)胞密度較低本文檔共108頁(yè)；當(dāng)前第72頁(yè)；編輯于星期三\12點(diǎn)23分培養(yǎng)過(guò)程中，為確保細(xì)胞呈單顆粒均勻懸浮狀態(tài)，需采用攪拌或氣升式反應(yīng)器，以較低攪拌速度及一定速度通入含5%CO2的無(wú)菌空氣，保持細(xì)胞懸浮狀態(tài)并維持培養(yǎng)液溶解氧和pH。不同細(xì)胞懸浮條件不同。為使細(xì)胞不致凝集、成團(tuán)或沉淀，在配制培養(yǎng)基的基礎(chǔ)鹽溶液中不加鈣和鎂離子。間歇或連續(xù)更換部分培養(yǎng)液，可維持pH值，若使用HEPES緩沖鹽溶液可不必連續(xù)通入含5%CO2的空氣。本文檔共108頁(yè)；當(dāng)前第73頁(yè)；編輯于星期三\12點(diǎn)23分2.貼壁培養(yǎng)貼壁培養(yǎng)：是必須讓細(xì)胞貼附在某種基質(zhì)上生長(zhǎng)繁殖的培養(yǎng)方法。適用于一切貼壁依賴性細(xì)胞，也適用于兼性貼壁細(xì)胞。優(yōu)點(diǎn)：適用的細(xì)胞種類廣，較容易采用灌流培養(yǎng)缺點(diǎn)：操作麻煩，需要合適的貼附材料和足夠的面積，傳代或擴(kuò)大培養(yǎng)時(shí)需先消化，培養(yǎng)條件不易均一，傳質(zhì)和傳氧較差。本文檔共108頁(yè)；當(dāng)前第74頁(yè)；編輯于星期三\12點(diǎn)23分3.貼壁-懸浮培養(yǎng)（假懸浮培養(yǎng)）微載體培養(yǎng)包埋和微囊培養(yǎng)結(jié)團(tuán)培養(yǎng)本文檔共108頁(yè)；當(dāng)前第75頁(yè)；編輯于星期三\12點(diǎn)23分（1）微載體培養(yǎng)微載體培養(yǎng)法：將動(dòng)物細(xì)胞吸附于微載體表面，在培養(yǎng)液中進(jìn)行懸浮培養(yǎng)，使細(xì)胞在微載體表面長(zhǎng)成單層的培養(yǎng)方法，或稱微珠培養(yǎng)法。制備微載體的材料主要有：

葡聚糖明膠玻璃纖維素等本文檔共108頁(yè)；當(dāng)前第76頁(yè)；編輯于星期三\12點(diǎn)23分微載體培養(yǎng)的優(yōu)點(diǎn)：既可創(chuàng)造相當(dāng)大的貼附面積供細(xì)胞貼附生長(zhǎng)增殖，滿足絕大多數(shù)細(xì)胞的基本要求，又由于載體體積很小，比重較輕，在輕度攪拌下即可攜帶細(xì)胞自由懸浮在培養(yǎng)基內(nèi)，充分發(fā)揮了懸浮培養(yǎng)的一切優(yōu)點(diǎn)。本文檔共108頁(yè)；當(dāng)前第77頁(yè)；編輯于星期三\12點(diǎn)23分理想微載體需具備的條件微載體表面性質(zhì)與細(xì)胞有良好的相容性；微載體的材料無(wú)毒性；微載體的材料是惰性材料；材料比重為；粒徑60-250μm（溶脹后），大小均一；具有好的光學(xué)透明性；基質(zhì)的性質(zhì)是軟性的；可耐120℃高溫，便于采用高壓蒸汽滅菌原料充分，制作簡(jiǎn)便，價(jià)格低廉，可反復(fù)使用本文檔共108頁(yè)；當(dāng)前第78頁(yè)；編輯于星期三\12點(diǎn)23分從固體微載體發(fā)展到多孔微載體（porousmicrocarrier）或多孔微球：極大增大了供細(xì)胞貼附的比表面積，同時(shí)適用于懸浮細(xì)胞的培養(yǎng)。本文檔共108頁(yè)；當(dāng)前第79頁(yè)；編輯于星期三\12點(diǎn)23分（2）包埋和微囊培養(yǎng)包埋法：將細(xì)胞包埋于瓊脂、瓊脂糖、膠原及血纖維等海綿狀基質(zhì)中微囊法：由包埋法衍生而來(lái)，將包埋的顆粒經(jīng)液化處理而成為微囊可用于包埋細(xì)胞的載體材料：人工合成的高分子聚合物（聚丙烯酰胺、環(huán)氧樹(shù)脂、聚氨基甲酸酯、聚乙烯醇等）、糖類（如纖維素、瓊脂、瓊脂糖、K-卡拉膠、海藻酸鈣、殼聚糖等）、蛋白質(zhì)（如膠原、明膠、纖維蛋白等）本文檔共108頁(yè)；當(dāng)前第80頁(yè)；編輯于星期三\12點(diǎn)23分包埋或微囊培養(yǎng)法的優(yōu)點(diǎn)包埋或包裹在載體或微囊內(nèi)的細(xì)胞可獲得保護(hù)，避免了剪切力的損害?？梢垣@得較高的細(xì)胞密度，一般都在107-108個(gè)/ml以上。當(dāng)控制微囊膜的孔徑后，可使產(chǎn)品濃縮在微囊內(nèi)，從而有利于下游產(chǎn)物的純化?？刹捎枚喾N生物反應(yīng)器進(jìn)行大規(guī)模培養(yǎng)。本文檔共108頁(yè)；當(dāng)前第81頁(yè)；編輯于星期三\12點(diǎn)23分（3）結(jié)團(tuán)培養(yǎng)利用細(xì)胞本身作為基質(zhì)，相互貼附后，再用懸浮的方法培養(yǎng)，可獲得高密度的細(xì)胞。優(yōu)點(diǎn)：操作簡(jiǎn)便，節(jié)省了用于微載體的成本本文檔共108頁(yè)；當(dāng)前第82頁(yè)；編輯于星期三\12點(diǎn)23分二、動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)的操作方式分批式操作補(bǔ)料-分批（或流加式）操作（細(xì)菌生產(chǎn)中常用）半連續(xù)式操作連續(xù)式操作（個(gè)別情況下用于懸浮細(xì)胞的培養(yǎng)）灌流式操作本文檔共108頁(yè)；當(dāng)前第83頁(yè)；編輯于星期三\12點(diǎn)23分1.分批式操作將細(xì)胞和培養(yǎng)基一次性加入反應(yīng)器內(nèi)進(jìn)行培養(yǎng)，此后細(xì)胞不斷增長(zhǎng)，產(chǎn)物不斷形成和積累，最后將條件培養(yǎng)基，即經(jīng)培養(yǎng)已含有細(xì)胞產(chǎn)物的培養(yǎng)基，或連同細(xì)胞一并取出，培養(yǎng)結(jié)束。先將細(xì)胞和培養(yǎng)基加入反應(yīng)器，待細(xì)胞生長(zhǎng)至一定密度后，向反應(yīng)器內(nèi)加入誘導(dǎo)劑或病毒等，經(jīng)一段時(shí)間作用后，將反應(yīng)物取出。本文檔共108頁(yè)；當(dāng)前第84頁(yè)；編輯于星期三\12點(diǎn)23分2.半連續(xù)式操作定義：當(dāng)細(xì)胞和培養(yǎng)基一起加入反應(yīng)器后，在細(xì)胞增長(zhǎng)和產(chǎn)物形成過(guò)程中，每間隔一段時(shí)間，取出部分培養(yǎng)物，或單純是條件培養(yǎng)基，或連同細(xì)胞、載體一起，然后補(bǔ)充同樣數(shù)量的新鮮培養(yǎng)基，或另加新鮮載體，繼續(xù)培養(yǎng)。優(yōu)點(diǎn)：操作簡(jiǎn)便，生產(chǎn)效率高，可長(zhǎng)期進(jìn)行生產(chǎn)，反復(fù)收獲產(chǎn)品，而且可使細(xì)胞密度和產(chǎn)品產(chǎn)量一直保持在較高的水平。本文檔共108頁(yè)；當(dāng)前第85頁(yè)；編輯于星期三\12點(diǎn)23分3.灌流式操作定義：當(dāng)細(xì)胞和培養(yǎng)基一起加入反應(yīng)器后，在細(xì)胞增長(zhǎng)和產(chǎn)物形成過(guò)程中，不斷地將部分條件培養(yǎng)基取出，同時(shí)不斷地補(bǔ)充新鮮培養(yǎng)基。但細(xì)胞留在反應(yīng)器內(nèi)，使細(xì)胞處于一種不斷的營(yíng)養(yǎng)狀態(tài)。本文檔共108頁(yè)；當(dāng)前第86頁(yè)；編輯于星期三\12點(diǎn)23分細(xì)胞可處在較穩(wěn)定的良好的環(huán)境中，營(yíng)養(yǎng)條件好，有害代謝廢物濃度低；可極大地提高細(xì)胞密度，從而極大地提高了產(chǎn)品產(chǎn)量；產(chǎn)品在罐內(nèi)停留時(shí)間縮短，可及時(shí)收留在低溫下保存，有利于產(chǎn)品質(zhì)量的提高；培養(yǎng)基的比消耗率較低，加之產(chǎn)量質(zhì)量的提高，生產(chǎn)成本明顯降低。灌流式操作的優(yōu)點(diǎn)本文檔共108頁(yè)；當(dāng)前第87頁(yè)；編輯于星期三\12點(diǎn)23分一、動(dòng)物細(xì)胞生物反應(yīng)器的類型二、動(dòng)物細(xì)胞生物反應(yīng)器的檢測(cè)控制系統(tǒng)第七節(jié)動(dòng)物細(xì)胞生物反應(yīng)器本文檔共108頁(yè)；當(dāng)前第88頁(yè)；編輯于星期三\12點(diǎn)23分生物反應(yīng)器必備條件制造生物反應(yīng)器所采用的一切材料，尤其是與培養(yǎng)基、細(xì)胞直接接觸的材料，對(duì)細(xì)胞必須是無(wú)毒性的生物反應(yīng)器的結(jié)構(gòu)必須使之具有良好的傳質(zhì)、傳熱和混合的性能密封性能良好，可避免一切外來(lái)的不需要的微生物的污染對(duì)培養(yǎng)環(huán)境中多種物理化學(xué)參數(shù)能自動(dòng)檢測(cè)和調(diào)節(jié)控制，控制的精確度高，能保持環(huán)境質(zhì)量的均一本文檔共108頁(yè)；當(dāng)前第89頁(yè)；編輯于星期三\12點(diǎn)23分可長(zhǎng)期連續(xù)運(yùn)轉(zhuǎn)容器加工制造時(shí)要求內(nèi)面光滑，無(wú)死角，以減少細(xì)胞或微生物的沉積拆裝、連接和清潔方便，耐高壓蒸汽消毒，便于操作維修設(shè)備成本盡可能低生物反應(yīng)器必備條件本文檔共108頁(yè)；當(dāng)前第90頁(yè)；編輯于星期三\12點(diǎn)23分按規(guī)模大小可分為：實(shí)驗(yàn)室規(guī)模：＜20L，用于培養(yǎng)工藝的研究;中試規(guī)模：20~100L，提供一定量的產(chǎn)品，供純化、臨床前的各種檢測(cè)和臨床觀察，也包括進(jìn)一步的工藝優(yōu)化實(shí)驗(yàn);生產(chǎn)規(guī)模：＞100L，用于生產(chǎn)，提供產(chǎn)品。動(dòng)物生物反應(yīng)器本文檔共108頁(yè)；當(dāng)前第91頁(yè)；編輯于星期三\12點(diǎn)23分一、動(dòng)物細(xì)胞生物反應(yīng)器的類型攪拌罐式生物反應(yīng)器氣升式生物反應(yīng)器透析袋或膜式生物反應(yīng)器中空纖維生物反應(yīng)器固定床或流化床式生物反應(yīng)器本文檔共108頁(yè)；當(dāng)前第92頁(yè)；編輯于星期三\12點(diǎn)23分二、動(dòng)物細(xì)胞生物反應(yīng)器的檢測(cè)控制系統(tǒng)培養(yǎng)過(guò)程中需檢測(cè)的物化參數(shù)：有些需要在線檢測(cè)，如溫度、pH、攪拌速度、溶氧等；有些則需要取樣離線檢測(cè)，如活細(xì)胞數(shù)、氨基酸濃度分析、葡萄糖乳酸和銨離子的檢測(cè)等，有些則需在檢測(cè)后計(jì)算后才能獲得，如細(xì)胞的群體倍增時(shí)間、細(xì)胞的比增長(zhǎng)率、葡萄糖消耗率、乳酸產(chǎn)率、生物反應(yīng)器生產(chǎn)率等。本文檔共108頁(yè)；當(dāng)前第93頁(yè)；編輯于星期三\12點(diǎn)23分

動(dòng)物細(xì)胞對(duì)攪拌引起的剪切力和氣泡很敏感，要保持所需的溶氧很困難，常采用的措施有：改變進(jìn)氣的組成：不同比例的O2、N2、CO2和空氣加大通氣流量適當(dāng)提高轉(zhuǎn)速在反應(yīng)器外通氣加入血紅蛋白適當(dāng)提高罐壓本文檔共108頁(yè)；當(dāng)前第94頁(yè)；編輯于星期三\12點(diǎn)23分一、動(dòng)物細(xì)胞產(chǎn)品常用的純化方法二、動(dòng)物細(xì)胞產(chǎn)品的質(zhì)量要求第八節(jié)動(dòng)物細(xì)胞產(chǎn)品的純化方法和質(zhì)量要求本文檔共108頁(yè)；當(dāng)前第95頁(yè)；編輯于星期三\12點(diǎn)23分下游純化工作費(fèi)錢、難度大成分復(fù)雜：工程細(xì)胞表達(dá)的產(chǎn)品，常常和細(xì)胞內(nèi)容物、培養(yǎng)基成分，特別當(dāng)采用有血清培養(yǎng)基時(shí)小牛血清中的各種蛋白成分都將與產(chǎn)物混雜在一起，這些成分的物化性質(zhì)常常和目的產(chǎn)物非常相似，因此很難將他們分離開(kāi)作用于人體的藥物純度要求高：由于產(chǎn)品多數(shù)用于人體，為防雜質(zhì)對(duì)人體的有害作用，對(duì)產(chǎn)品的純度要求很高本文檔共108頁(yè)；當(dāng)前第96頁(yè)；編輯于星期三\12點(diǎn)23分大多數(shù)動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)的產(chǎn)物產(chǎn)量低，生物活性不穩(wěn)定，因此要求純化過(guò)程中所有的操作都應(yīng)該非常溫和、精細(xì)，包括溶液的溫