第五章愈傷組織培養(yǎng)

第五章愈傷組織的培養(yǎng)第一節(jié)愈傷組織的誘導和分化第二節(jié)愈傷組織中的形態(tài)發(fā)生第三節(jié)人工種子本文檔共70頁；當前第1頁；編輯于星期三\12點29分第一節(jié)愈傷組織的誘導和分化1愈傷組織的誘導2影響愈傷組織誘導形成的主要因素本文檔共70頁；當前第2頁；編輯于星期三\12點29分愈傷組織(callus)：離體組織或器官進行離體培養(yǎng)時，進行細胞分裂，形成一種高度液泡化的無定形的薄壁細胞。FromembryocultureFromroot1愈傷組織的誘導本文檔共70頁；當前第3頁；編輯于星期三\12點29分本文檔共70頁；當前第4頁；編輯于星期三\12點29分本文檔共70頁；當前第5頁；編輯于星期三\12點29分2愈傷組織的形成從外植體脫分化形成典型的愈傷組織大致可分為三個時期：愈傷組織形成起始期分裂期形成期本文檔共70頁；當前第6頁；編輯于星期三\12點29分2.1起始期：細胞準備進行分裂的時期。外植體的細胞處在靜止狀態(tài)。一些刺激因素(如機械損傷、改變光照強度、增加氧等)和激素的誘導作用，使外植體細胞的合成代謝活動加強，蛋白質和核酸的合成,誘導細胞開始分裂。本文檔共70頁；當前第7頁；編輯于星期三\12點29分起始期細胞內發(fā)生的變化激素的誘導作用，使外植體細胞的合成代謝活動加強，蛋白質和核酸的合成增加,誘導細胞開始分裂。每個細胞的蛋白質總增加量可達200%酶活性增強，氣體交換增加，如氧氣的吸收增加細胞的大小沒有多大改變本文檔共70頁；當前第8頁；編輯于星期三\12點29分2.2分裂期:分裂期：外植體細胞經過誘導以后脫分化，不斷分裂增生子細胞的過程。脫分化：細胞由靜止期進入分裂期，恢復分裂機能本文檔共70頁；當前第9頁；編輯于星期三\12點29分分裂期外植體的特征:細胞分裂快，結構疏松，缺少有組織的結構，維持其不分化的狀態(tài)，顏色淺而透明。本文檔共70頁；當前第10頁；編輯于星期三\12點29分外層細胞在外源激素的作用下，迅速分裂，使得外層細胞數目增加，細胞體積縮小，細胞的核和核仁增大到最大。逐步回到分生組織狀態(tài)。

隨著細胞不斷分裂和生長，細胞總干重、蛋白質和核酸量大大增加，新細胞壁合成極快。細胞分裂快，結構疏松，缺少有組織的結構，維持其不分化的狀態(tài)，顏色淺而透明。細胞的主要表現:本文檔共70頁；當前第11頁；編輯于星期三\12點29分2.3形成期：指在分裂期的末期，細胞內開始出現一系列形態(tài)和生理上的變化，從而使愈傷組織內產生不同形態(tài)和功能的細胞。本文檔共70頁；當前第12頁；編輯于星期三\12點29分細胞分裂部位和方向發(fā)生改變：內部細胞發(fā)生分裂，形成像維管束或類似分生組織，組成的鳥巢狀結構。細胞的體積相對穩(wěn)定，不再減少。出現了各種類型的細胞：如管胞、纖維細胞、薄壁細胞、分生細胞、色素細胞等。生長旺盛的愈傷組織呈乳白色、白色或淺綠色，老化的多轉化為黃色或褐色。細胞特點：本文檔共70頁；當前第13頁；編輯于星期三\12點29分本文檔共70頁；當前第14頁；編輯于星期三\12點29分

RedWhitecallus

GreencallusYellowcallus根據愈傷色澤劃分為：愈傷組織的分類

本文檔共70頁；當前第15頁；編輯于星期三\12點29分

易碎的愈傷堅硬的愈傷

生根的愈傷

滲出粘性多糖的愈傷

根據愈傷質地劃分為：本文檔共70頁；當前第16頁；編輯于星期三\12點29分文心蘭的根（a）莖（b）葉（c）誘導的愈傷組織根據愈傷發(fā)生部位：本文檔共70頁；當前第17頁；編輯于星期三\12點29分胚性愈傷組織表面呈顆粒狀、組織結構緊湊、再生力強。非胚性愈傷組織表面粗糙、組織結構疏松。

根據愈傷難易程度：胚性愈傷組織容易形成胚狀體非胚性愈傷組織誘導率可達100％，胚性愈傷組織誘導率相對較低。本文檔共70頁；當前第18頁；編輯于星期三\12點29分愈傷組織生長周期愈傷組織生長周期為2－4周。在培養(yǎng)基上生長一段時間以后，由于營養(yǎng)物質枯竭，水分散失，或有毒代謝物的積累，導致愈傷組織停止生長，甚至老化變黑、死亡。轉移到新鮮培養(yǎng)基：定期地將它們分成小塊，接種到新鮮的培養(yǎng)基上，可以長期保持旺盛的生長。本文檔共70頁；當前第19頁；編輯于星期三\12點29分第一節(jié)愈傷組織的誘導和分化1愈傷組織的誘導2影響愈傷組織誘導形成的主要因素本文檔共70頁；當前第20頁；編輯于星期三\12點29分（1）不同植物和外植體誘導愈傷組織能力的差異。不同植物種類、同一植物不同器官來源及其生理狀況、年齡的外植體的脫分化（形成愈傷組織）能力有很大差別。煙草、胡蘿卜等植物的脫分化比較容易，禾本科植物的脫分化比較難；花的脫分化比較容易，莖、葉的脫分化比較難；幼嫩組織的脫分化比較容易，成熟的老組織脫分化比較難。2影響愈傷組織誘導形成的主要因素本文檔共70頁；當前第21頁；編輯于星期三\12點29分（2）培養(yǎng)基種類對愈傷組織誘導的影響。誘導愈傷組織常用的培養(yǎng)基為MS和B5。（3）外源激素對愈傷組織誘導的影響---重要因素。（4）培養(yǎng)條件對愈傷組織誘導的影響:

濕度條件、溫度條件、光照條件。本文檔共70頁；當前第22頁；編輯于星期三\12點29分2,4-D和BA濃度對銀膠菊莖段愈傷組織生長的影響處理（2,4-D:BA）愈傷組織形成情況0:0僅有，不生長0:0.1有限的生長，顯綠色0：0.2生長不良0.05:0大塊、綠色，平均直徑為10mm0.05:1生長不良，稍帶褐色0.05:2生長不良，稍帶褐色0.1:0大塊，綠色至淺褐色0.1:0.1大塊，綠色至淺褐色0.1:0.2稍小于0.1:0.1比例，變褐本文檔共70頁；當前第23頁；編輯于星期三\12點29分

各種生長素對黃瓜各外植體愈傷組織誘導的效應（各種生長素濃度為10μmol/L）生長素愈傷組織形成種子下胚軸果皮IBA無愈傷組織形成愈傷組織增殖強IBA濃度為1μmol/L時愈傷組織生長良好NAA無愈傷組織形成所有外植體均產生愈傷組織愈傷組織增殖強2,4-D所有外植體均產生愈傷組織2,4-D濃度為1μmol/L時愈傷組織生長良好愈傷組織增殖強NOA萘氧乙酸無愈傷組織形成愈傷組織增殖中等愈傷組織增殖中等NOP萘氧丙酸無愈傷組織形成愈傷組織增殖中等愈傷組織增殖強愈傷組織增殖強本文檔共70頁；當前第24頁；編輯于星期三\12點29分本文檔共70頁；當前第25頁；編輯于星期三\12點29分第五章愈傷組織的培養(yǎng)第一節(jié)愈傷組織的誘導和分化第二節(jié)愈傷組織中的形態(tài)發(fā)生第三節(jié)人工種子本文檔共70頁；當前第26頁；編輯于星期三\12點29分1愈傷組織形態(tài)發(fā)生方式愈傷組織器官發(fā)生通過體細胞胚胎/胚狀體途徑再生植株第二節(jié)愈傷組織中的形態(tài)發(fā)生本文檔共70頁；當前第27頁；編輯于星期三\12點29分2愈傷組織器官發(fā)生

先不定芽，在莖基部長根先長根后長芽在不同部位分別形成根和芽

本文檔共70頁；當前第28頁；編輯于星期三\12點29分本文檔共70頁；當前第29頁；編輯于星期三\12點29分無機鹽混合物類營養(yǎng)條件有機物類植物激素類天然復合物類外因滲透壓酸堿度影響因子環(huán)境條件濕度溫度光照內因遺傳性生理狀態(tài)

影響愈傷組織器官發(fā)生的因素：

植物激素的作用

外植體自身因素本文檔共70頁；當前第30頁；編輯于星期三\12點29分（1）外植體自身因素（內因）

①母體植株的遺傳基礎被子植物比裸子植物容易，被子植物中茄科、秋海棠科、景天科、苦苣苔科和十字花科植物成功報道最多；無性繁殖植物比有性繁殖植物的容易；同種植物不同品種（基因型）的培養(yǎng)效果不同本文檔共70頁；當前第31頁；編輯于星期三\12點29分②外植體的類型

影響培養(yǎng)的難易：一般生理狀態(tài)年輕，來源于生長活躍或生長潛力大的組織和器官的細胞容易培養(yǎng)。

本文檔共70頁；當前第32頁；編輯于星期三\12點29分例：百合：鱗莖的鱗片分化能力：外層>中層>內層本文檔共70頁；當前第33頁；編輯于星期三\12點29分本文檔共70頁；當前第34頁；編輯于星期三\12點29分

高：有利于根的形成和愈傷組織的形成；適中：有利于根芽的分化；低：有利于芽的形成生長素細胞分裂素＝適宜的植物激素配比在器官分化中有著重要的作用。

（2）植物激素的作用（外因）本文檔共70頁；當前第35頁；編輯于星期三\12點29分蘆薈的植物組織培養(yǎng)過程1234567891011本文檔共70頁；當前第36頁；編輯于星期三\12點29分芽（單芽、叢芽）本文檔共70頁；當前第37頁；編輯于星期三\12點29分1愈傷組織形態(tài)發(fā)生方式愈傷組織器官發(fā)生通過體細胞胚胎/胚狀體途徑再生植株第二節(jié)愈傷組織中的形態(tài)發(fā)生本文檔共70頁；當前第38頁；編輯于星期三\12點29分3.1胚狀體/體細胞胚（embryoid）：指植物細胞、組織或器官的離體培養(yǎng)中，起始于一個非合子細胞，并經過胚胎發(fā)育過程分化出的類似胚一樣的細胞群。經過：球形胚－心形胚－魚雷形胚－成熟胚3體細胞胚發(fā)生途徑本文檔共70頁；當前第39頁；編輯于星期三\12點29分DevelopmentoftheArabidopsisEmbryo本文檔共70頁；當前第40頁；編輯于星期三\12點29分

石龍芮胚狀體發(fā)生的過程

本文檔共70頁；當前第41頁；編輯于星期三\12點29分香蕉心形體細胞胚玫瑰心形體細胞胚本文檔共70頁；當前第42頁；編輯于星期三\12點29分本文檔共70頁；當前第43頁；編輯于星期三\12點29分3.2體細胞胚的產生方式1）直接在器官上發(fā)生2）懸浮培養(yǎng)細胞發(fā)生途徑3）愈傷組織發(fā)生途徑:幼胚、胚和子葉4）單細胞發(fā)生途徑：花藥培養(yǎng)中的小孢子發(fā)育成4）原生質體發(fā)生途徑胚性愈傷組織本文檔共70頁；當前第44頁；編輯于星期三\12點29分1）生長素2）其他植物生長物質的作用3）氨源形態(tài)的影響4）其他培養(yǎng)條件對胚狀體發(fā)生的影響3.3體細胞胚狀體誘導的影響因素本文檔共70頁；當前第45頁；編輯于星期三\12點29分3.4體細胞胚狀體誘導的影響因素1）生長素形成體細胞胚的關鍵是除去或降低培養(yǎng)基中的生長素成分（如2,4-D）。愈傷組織在生長素0.5～1mg/L的培養(yǎng)基上分化形成分生細胞團（稱胚性細胞團）；轉移到生長素含量很低或沒有生長素的培養(yǎng)基上，就能發(fā)育為胚狀體。本文檔共70頁；當前第46頁；編輯于星期三\12點29分原因：2,4-D等生長素可以誘導內源乙烯（Eth）產生；內源Eth不影響愈傷增殖，但抑制愈傷組織進一步分化成胚。乙烯也會導致纖維素酶或（和）果膠酶活性的增強，從而破壞胚性細胞團，使原胚不能發(fā)生組織分化。本文檔共70頁；當前第47頁；編輯于星期三\12點29分2）其他植物生長物質的作用細胞分裂素有利于胚狀體的形成0.1μg·L-1玉米素促進胡蘿卜體細胞胚發(fā)生。GA3、ABA抑制成胚；本文檔共70頁；當前第48頁；編輯于星期三\12點29分3）氨源形態(tài)的影響還原N（NH4+）氧化N（NO3-）有機氮（氨基酸、水解酪蛋白等）野生胡蘿卜葉柄節(jié)段的培養(yǎng)中，只有在含一定數量還原態(tài)氮的培養(yǎng)基時，才能有胚胎發(fā)生，用NH4+

和水解酪蛋白優(yōu)于NO3-

或谷氨酰胺。本文檔共70頁；當前第49頁；編輯于星期三\12點29分4）其他培養(yǎng)條件對胚狀體發(fā)生的影響液體培養(yǎng)適宜pH5-6光照：不需要光或半天光照時間溫度25℃左右本文檔共70頁；當前第50頁；編輯于星期三\12點29分光照強度50-60μEm2s-1光照強度5-10μEm2s-1(圖光對大豆不同品種子葉體細胞胚發(fā)生的影響)本文檔共70頁；當前第51頁；編輯于星期三\12點29分3.4體細胞胚途徑再生植物的優(yōu)點1）數量比不定芽多2）獲得速度快3）結構完整4）胚狀體可制成人工種子，便于運輸和保存；5）胚狀體的有性后代遺傳性更接近母體植株。本文檔共70頁；當前第52頁；編輯于星期三\12點29分第五章愈傷組織的培養(yǎng)第一節(jié)愈傷組織的誘導和分化第二節(jié)愈傷組織中的形態(tài)發(fā)生第三節(jié)人工種子本文檔共70頁；當前第53頁；編輯于星期三\12點29分人工種子是指外面包裹一層有機薄膜的植物胚狀體。

胚狀體或芽：有生命的物質結構。人工胚乳：供胚狀體維持生命力。人工種皮：保護作用。1定義與結構

第三節(jié)人工種子本文檔共70頁；當前第54頁；編輯于星期三\12點29分1）結構完整，體積小，便于貯藏與運輸，可直接播種，易于機械化操作；2）不受季節(jié)限制，不受環(huán)境制約，胚狀體數量多、繁殖快、有利于工廠化生產；人工種子的優(yōu)點:3)有利于繁殖生育周期長、自交不親合、珍貴稀有的一些植物，也可大量繁殖無病毒材料；4)加入抗生素、農藥、菌肥等成分，提高人工種子活力和品質；5)由無性繁殖體系產生胚，固定雜種優(yōu)勢。本文檔共70頁；當前第55頁；編輯于星期三\12點29分2制作人工種子制作過程胚狀體人工胚乳其他物質人工種皮包埋技術本文檔共70頁；當前第56頁；編輯于星期三\12點29分第一步胚狀體誘導1）選取目標植物2）誘導愈傷組織3）愈傷組織增生4）胚狀體誘導本文檔共70頁；當前第57頁；編輯于星期三\12點29分胚狀體同步增殖：DNA合成抑制劑低溫處理調節(jié)滲透壓分離過篩調節(jié)植物激素配比本文檔共70頁；當前第58頁；編輯于星期三\12點29分第二步人工胚乳制作人工胚乳的成分無機鹽混合物碳水化合物：淀粉和糖蛋白質各種附加成分：如固氮細菌、殺蟲劑、殺菌劑、除草劑和植物激素等本文檔共70頁；當前第59頁；編輯于星期三\12點29分第三步人工種皮制作1）包埋介質的選擇：無毒、透氣、保水性好有足夠硬度（不脹大），保證安全（不泄露營養(yǎng)物）包埋材料：瓊脂、瓊脂糖、藻酸鹽、明膠、淀粉、動物膠、角叉膠、刺槐豆膠、阿拉伯樹膠、果膠、蛋白膠、黃芪膠等種類。本文檔共70頁；當前第60頁；編輯于星期三\12點29分2）包埋技術

用褐藻酸鈉等水溶性凝膠經與Ca2+進行離子交換后凝固，用于包埋單個胚狀體。本文檔共70頁；當前第61頁；編