細(xì)胞培養(yǎng)的個(gè)人體會9

如何做好實(shí)驗(yàn)？

“播下一種習(xí)慣，你將收獲一種性格；播下一種性格，你將收獲一種命運(yùn)”。

威廉.詹姆士個(gè)人體會：題外話：

1、“養(yǎng)成良好的實(shí)驗(yàn)習(xí)慣”。實(shí)驗(yàn)前：查資料，計(jì)劃好，充分準(zhǔn)備。實(shí)驗(yàn)中：認(rèn)真操作，關(guān)鍵點(diǎn)作好記錄。（可寫在草稿本上）。實(shí)驗(yàn)后：整理實(shí)驗(yàn)物品，用過的東西要放回原位，及時(shí)清理垃圾，抽空根據(jù)草稿本詳細(xì)寫下實(shí)驗(yàn)記錄。（寫在實(shí)驗(yàn)記錄本上）

實(shí)驗(yàn)其間，聽從老師和師兄、師姐的安排和管理！本文檔共32頁；當(dāng)前第1頁；編輯于星期二\5點(diǎn)22分

2、“養(yǎng)成獨(dú)立思考、獨(dú)立解決問題的習(xí)慣”全面提高自己的能力，力求能獨(dú)擋一面。遇到問題，首先自己想辦法去解決。3、“養(yǎng)成良好的心態(tài)”“雄心”:有抱負(fù)和理想，做好文章?！昂阈摹保簣?jiān)持?！捌匠Ｐ摹保簭娜莸ǎ煌?，快而不亂.4、“苦干+巧干”

苦干：多練習(xí)，熟能生巧?！白觥鼻筛桑憾嗫偨Y(jié)，掌握規(guī)律。“思”

本文檔共32頁；當(dāng)前第2頁；編輯于星期二\5點(diǎn)22分內(nèi)容提要1.細(xì)胞培養(yǎng)簡介2.細(xì)胞的復(fù)蘇和凍存細(xì)胞的復(fù)蘇細(xì)胞的凍存3.細(xì)胞的換液與傳代個(gè)人方法無菌操作技術(shù)細(xì)胞計(jì)數(shù)和接種本文檔共32頁；當(dāng)前第3頁；編輯于星期二\5點(diǎn)22分體外培養(yǎng)（in

vitro

culture）：是將活體成分或其寄生體內(nèi)取出，放在類似于體內(nèi)生存環(huán)境的體外環(huán)境中，讓其生長和發(fā)育的方法。可分為器官培養(yǎng)、組織培養(yǎng)、細(xì)胞培養(yǎng)三種類型。細(xì)胞培養(yǎng)分為原代培養(yǎng)和傳代培養(yǎng)。體外培養(yǎng)本文檔共32頁；當(dāng)前第4頁；編輯于星期二\5點(diǎn)22分簡化環(huán)境因素、排除了體內(nèi)實(shí)驗(yàn)時(shí)一些復(fù)雜的因素的影響，利于應(yīng)用各種物理、化學(xué)和生物等外界因素探索和提示細(xì)胞生命活動(dòng)的規(guī)律；提供了大量生物性狀相同的細(xì)胞，特別是人的活細(xì)胞材料作為研究對象。經(jīng)濟(jì)、便利，解決了不能用人做實(shí)驗(yàn)的問題。缺點(diǎn)是無法模擬體內(nèi)的情況，結(jié)果有局限性。細(xì)胞培養(yǎng)的特點(diǎn)本文檔共32頁；當(dāng)前第5頁；編輯于星期二\5點(diǎn)22分CO2培養(yǎng)箱細(xì)胞培養(yǎng)基本設(shè)備定期清潔，換水。拿出細(xì)胞及時(shí)關(guān)好門，保持CO2濃度。短時(shí)不用，將光源調(diào)至最小，避免反復(fù)開關(guān)。長時(shí)不用，及時(shí)關(guān)電源。使用注意問題：倒置顯微鏡本文檔共32頁；當(dāng)前第6頁；編輯于星期二\5點(diǎn)22分超凈工作臺使用前紫外照20-30分鐘。使用時(shí)別忘關(guān)紫外，防止灼傷。定期換水，保持干凈的水。使用前檢查水位，不足補(bǔ)充純水。最好細(xì)胞培養(yǎng)專用一個(gè)滅菌鍋。使用注意問題：高壓滅菌鍋本文檔共32頁；當(dāng)前第7頁；編輯于星期二\5點(diǎn)22分培養(yǎng)瓶、培養(yǎng)管、細(xì)胞培養(yǎng)板、藍(lán)蓋瓶、吸管；離心管、細(xì)胞凍存管、1ml、5mlEP管；血細(xì)胞計(jì)數(shù)器；恒溫磁力攪拌器、恒溫水浴振蕩器；刀、剪、鑷解剖用具，200目不銹鋼網(wǎng)；細(xì)胞培養(yǎng)的基本用品本文檔共32頁；當(dāng)前第8頁；編輯于星期二\5點(diǎn)22分本文檔共32頁；當(dāng)前第9頁；編輯于星期二\5點(diǎn)22分大多數(shù)培養(yǎng)基是建立在平衡鹽溶液(BSS)基礎(chǔ)上，添加了氨基酸、維生素和與血清中濃度相似的營養(yǎng)物質(zhì)。選擇培養(yǎng)基很重要，不同細(xì)胞需要適合的培養(yǎng)基。常見的培養(yǎng)基有：DMEM、F12、DMEM/F12、1640等。

基礎(chǔ)培養(yǎng)基本文檔共32頁；當(dāng)前第10頁；編輯于星期二\5點(diǎn)22分一般是從牛的血液中提取，含有豐富的營養(yǎng)養(yǎng)物質(zhì)。常用的胎牛血清（FetalBovineSerum,FBS),使用前分裝50ml離心管，-20℃保存。注意解凍分裝前請混合均勻。

使用時(shí)放在4℃冰箱解凍，需1-2天。血清本文檔共32頁；當(dāng)前第11頁；編輯于星期二\5點(diǎn)22分血清和基礎(chǔ)培養(yǎng)基按一定比例混合，一般配制含10-15%血清的培養(yǎng)基，用于細(xì)胞培養(yǎng)。如取20ml胎牛血清，同時(shí)加入180mlDMEM基礎(chǔ)培養(yǎng)基，即可配成200ml含10%胎牛的DMEM.完全培養(yǎng)基本文檔共32頁；當(dāng)前第12頁；編輯于星期二\5點(diǎn)22分器皿加洗潔精浸泡數(shù)小時(shí)后，用自來水沖洗9次，然后蒸餾水沖洗3次。烘干：洗干凈后烘干。包裝：用牛皮紙或布包裝。消毒前貼上滅菌條，條上寫明日期、物品、所有者。

可重復(fù)利用物品的清洗和滅菌本文檔共32頁；當(dāng)前第13頁；編輯于星期二\5點(diǎn)22分高壓滅菌：包裝好的器皿裝入高壓鍋內(nèi)，121℃，維持30分鐘。

滅菌后烘干：高壓消毒后器皿會被蒸氣打濕，要放入烤箱內(nèi)烘干備用。注意：泡酸（重鉻酸鉀120g：濃硫酸200ml：蒸餾水1000ml）浸泡12小時(shí)。（玻璃器皿第一次洗需要用，以后可以省這一步）。本文檔共32頁；當(dāng)前第14頁；編輯于星期二\5點(diǎn)22分細(xì)胞的復(fù)蘇和凍存

本文檔共32頁；當(dāng)前第15頁；編輯于星期二\5點(diǎn)22分細(xì)胞復(fù)蘇與凍存的原則是“慢凍速融”。復(fù)蘇細(xì)胞時(shí)，速度要快，使之迅速通過細(xì)胞最易受損的－5℃～0℃。凍存細(xì)胞時(shí)，向培養(yǎng)基中加入保護(hù)劑二甲基亞砜（DMSO），可使冰點(diǎn)降低，在緩慢的凍結(jié)條件下，能使細(xì)胞內(nèi)水分在凍結(jié)前透出細(xì)胞外，減少細(xì)胞冰晶的形成。復(fù)蘇與凍存的原則本文檔共32頁；當(dāng)前第16頁；編輯于星期二\5點(diǎn)22分

1、準(zhǔn)備好37℃水浴燒杯。2、將凍存于液氮中的凍存管取出，迅速放入37～40℃水浴中使其在1min內(nèi)融化。3、無菌條件下打開凍存管，取細(xì)胞懸液至離心管中，補(bǔ)加5mL培養(yǎng)液，1600rpm低速離心5min。4、去上清，加入新鮮培養(yǎng)液適量，吹打成細(xì)胞懸液，轉(zhuǎn)入培養(yǎng)瓶中，置37℃培養(yǎng)。復(fù)蘇的標(biāo)準(zhǔn)方法本文檔共32頁；當(dāng)前第17頁；編輯于星期二\5點(diǎn)22分復(fù)蘇前，準(zhǔn)備好含有5mL培養(yǎng)基的培養(yǎng)瓶，放入37℃培養(yǎng)箱。1、準(zhǔn)備好40℃水浴燒杯。2、將凍存于液氮中的凍存管取出，還原保存盒放入液氮中。將取出凍存管迅速放入水浴中，迅速搖晃加速其融化，放在水浴中，5min鐘內(nèi)須完成。3、將凍存管放入15mL離心管（剪去底部的舊離心管）中，1500rpm，離心3min。4、從離心管中取出凍存管，小心吸去上清，從培養(yǎng)箱中取出培養(yǎng)瓶，加入37℃的培養(yǎng)液1mL，吹打30次，轉(zhuǎn)入培養(yǎng)瓶中，置37℃培養(yǎng)。個(gè)人方法本文檔共32頁；當(dāng)前第18頁；編輯于星期二\5點(diǎn)22分1、胰酶消化，加含血清培養(yǎng)基終止，離心。2、去上清，加入凍存液1.5mL，吹打60次，轉(zhuǎn)入凍存管。3、凍存管放入4℃30分鐘--->-20℃60分鐘

--->-80℃16-18小時(shí)(或隔夜)--->投入液氮中。3、或凍存管置于程序降溫盒中，放置-80℃，--->投入液氮中。凍存的個(gè)人方法：附：凍存液個(gè)人配方：培養(yǎng)基：血清：DMSO普通細(xì)胞可用：7份：2份：1份細(xì)胞脆弱可用：5份：4.2份：0.8份本文檔共32頁；當(dāng)前第19頁；編輯于星期二\5點(diǎn)22分細(xì)胞的換液和傳代本文檔共32頁；當(dāng)前第20頁；編輯于星期二\5點(diǎn)22分貼壁期:0.5-4h潛伏期:5-24h對數(shù)生長期:24-96h停止期（衰老期）:96h以上貼壁生長細(xì)胞的生長過程新鮮培養(yǎng)基對數(shù)期停止期（紅）（淡紅略黃）（黃）本文檔共32頁；當(dāng)前第21頁；編輯于星期二\5點(diǎn)22分貼壁生長細(xì)胞的換液全換液：完全吸除瓶內(nèi)舊培養(yǎng)液，向瓶內(nèi)加入約4-6mL培養(yǎng)液。置37℃培養(yǎng)，適合于普通細(xì)胞。半換液：吸除瓶內(nèi)一半的舊培養(yǎng)液，向瓶內(nèi)補(bǔ)加入約3mL培養(yǎng)液。置37℃培養(yǎng)。適合于生長較慢的細(xì)胞。當(dāng)細(xì)胞沒有滿細(xì)胞培養(yǎng)瓶時(shí)，而培養(yǎng)基顏色變成略黃狀態(tài)時(shí)，說明營養(yǎng)消耗不少，環(huán)境酸性較強(qiáng)，為減少其對細(xì)胞損傷，須對細(xì)胞補(bǔ)充新鮮培養(yǎng)基。死細(xì)胞較多時(shí)，需要除掉死細(xì)胞。換液時(shí)機(jī)：換液方法：本文檔共32頁；當(dāng)前第22頁；編輯于星期二\5點(diǎn)22分

細(xì)胞鋪滿瓶底80%，吸除瓶內(nèi)舊培養(yǎng)液，向瓶內(nèi)加入少量約1～2mL消化液（一般含胰蛋白酶、EDTA），輕輕搖動(dòng)培養(yǎng)瓶，使消化液流遍所有細(xì)胞表面；在37℃環(huán)境下孵育1-2min，把培養(yǎng)瓶放置顯微鏡下進(jìn)行觀察，發(fā)現(xiàn)胞質(zhì)回縮、細(xì)胞間隙增大。加入含血清培養(yǎng)基，終止消化，用彎頭吸管吸取瓶內(nèi)培養(yǎng)液，反復(fù)吹打瓶壁細(xì)胞，使之脫落，吹打成細(xì)胞懸液。轉(zhuǎn)入離心管，1000-2000rpm，離心5min。去上清，加入新鮮培養(yǎng)液適量，吹打成細(xì)胞懸液，以1：2或1：3的比例接種在新的培養(yǎng)瓶內(nèi)，置37℃培養(yǎng)。傳代的標(biāo)準(zhǔn)方法本文檔共32頁；當(dāng)前第23頁；編輯于星期二\5點(diǎn)22分

細(xì)胞鋪滿瓶底約80%，吸除舊培養(yǎng)液，向瓶內(nèi)加入600uL胰酶，輕輕搖動(dòng)培養(yǎng)瓶，使消化液流遍細(xì)胞表面；吸除胰酶，在培養(yǎng)箱中孵育1-2min，把培養(yǎng)瓶放置顯微鏡下進(jìn)行觀察，發(fā)現(xiàn)胞質(zhì)回縮、細(xì)胞間隙增大。加入新鮮培養(yǎng)液2mL，吹打成細(xì)胞懸液，以1：2或1：3的比例接種在新的培養(yǎng)瓶內(nèi)（已預(yù)加新鮮培養(yǎng)基3ml)，置37℃培養(yǎng)。

(比標(biāo)準(zhǔn)方法省2步)傳代的個(gè)人方法(消化+機(jī)械吹打）本文檔共32頁；當(dāng)前第24頁；編輯于星期二\5點(diǎn)22分細(xì)節(jié)決定成敗，要注意的細(xì)節(jié)很多。詳細(xì)的內(nèi)容可參考“細(xì)胞培養(yǎng)無菌技術(shù)”PPT、視頻。

無菌操作技術(shù)（關(guān)鍵技術(shù)）個(gè)人體會：特別注意Vulnerableareas，吸管吸取液體時(shí)盡量不接觸瓶口。盡量避免在培養(yǎng)皿和所有瓶口的上方操作。同一根吸管不應(yīng)連續(xù)用于兩個(gè)不同的液體或細(xì)胞系。只要吸管接觸瓶外面任何地方都要丟棄，換新管。本文檔共32頁；當(dāng)前第25頁；編輯于星期二\5點(diǎn)22分常見細(xì)胞污染A:正常B:桿狀細(xì)菌污染C:球狀細(xì)菌污染D:絲狀真菌污染E:酵母污染本文檔共32頁；當(dāng)前第26頁；編輯于星期二\5點(diǎn)22分1號區(qū)5號區(qū)細(xì)胞計(jì)數(shù)1、使用計(jì)數(shù)板人工計(jì)數(shù)2、使用自動(dòng)細(xì)胞計(jì)數(shù)儀電腦計(jì)數(shù)本文檔共32頁；當(dāng)前第27頁；編輯于星期二\5點(diǎn)22分細(xì)胞密度=(1+2+3+4)/4萬個(gè)細(xì)胞每毫升13422本文檔共32頁；當(dāng)前第28頁；編輯于星期二\5點(diǎn)22分合適細(xì)胞密度是實(shí)驗(yàn)成功關(guān)鍵本文檔共32頁；當(dāng)前第29頁；編輯于星期二\5點(diǎn)22分合適的細(xì)胞培養(yǎng)液體積本文檔共32頁；當(dāng)前第30頁；編輯于星期二\5點(diǎn)22分常用細(xì)胞接種密度計(jì)算常見問題：現(xiàn)有4ml細(xì)胞懸液，細(xì)胞計(jì)數(shù)的結(jié)果為110萬個(gè)/ml，現(xiàn)在要接種到96孔板中，若每孔2萬個(gè)細(xì)胞，請問如何配制實(shí)驗(yàn)所需的細(xì)胞懸液?傳統(tǒng)算法：本來是96孔，實(shí)際要多預(yù)留一些，若多算10孔的話，共106孔。1、所需總細(xì)胞數(shù)：2萬X106=212萬2、所需總體積：100ulX106=10.6ml就是說要把212萬個(gè)細(xì)胞放入總體積10.6ml培養(yǎng)基中。需要取212萬除以110萬個(gè)/ml=1.93ml細(xì)胞懸液，補(bǔ)加10.6-1.9