原核生物基因表達(dá)的調(diào)控

關(guān)于原核生物基因表達(dá)的調(diào)控第1頁，講稿共70頁，2023年5月2日，星期三6.1.1DiscoveryofOperon

1961年,F.Jacob&J.Monod提出,此后不斷完善。獲1965年諾貝爾生理學(xué)和醫(yī)學(xué)獎(jiǎng)1940年，Monod發(fā)現(xiàn)：細(xì)菌在含葡萄糖和乳糖的培養(yǎng)基上生長時(shí)，細(xì)菌先利用葡萄糖，葡萄糖用完后，才利用乳糖；在糖源轉(zhuǎn)變期，細(xì)菌的生長會(huì)出現(xiàn)停頓。即產(chǎn)生“二次生長曲線”。文獻(xiàn)：細(xì)胞中存在兩種酶，即組成酶與誘導(dǎo)酶1947年，報(bào)告：“酶的適應(yīng)現(xiàn)象及其在細(xì)胞分化中的意義”FrancisJacob

JacquesMonod

6.1乳糖操縱元第2頁，講稿共70頁，2023年5月2日，星期三1951年，Monod與Jacob合作，發(fā)現(xiàn)兩對(duì)基因：Z基因：與合成β-半乳糖苷酶有關(guān)；I基因：決定細(xì)胞對(duì)誘導(dǎo)物的反應(yīng)。Szilard：I基因決定阻遏物的合成，當(dāng)阻遏物存在時(shí)，酶無法合成，只有有誘導(dǎo)物存在，才能去掉該阻遏物。

Jacob：結(jié)構(gòu)基因旁有開關(guān)基因（操縱基因），阻遏物通過與開關(guān)基因的結(jié)合，控制結(jié)構(gòu)基因的表達(dá)。第3頁，講稿共70頁，2023年5月2日，星期三乙?；D(zhuǎn)移酶半乳糖苷透性酶?-半乳糖苷酶操作位點(diǎn)乳糖操縱元結(jié)構(gòu)調(diào)節(jié)基因第4頁，講稿共70頁，2023年5月2日，星期三操縱元是一種完整的具有特定功能的細(xì)菌基因表達(dá)和調(diào)節(jié)的單位，包括調(diào)節(jié)基因，操縱位點(diǎn)，結(jié)構(gòu)基因，組成一個(gè)控制單元結(jié)構(gòu)基因：產(chǎn)生mRNA,合成蛋白質(zhì)操縱位點(diǎn)promotor,operator：啟動(dòng)子結(jié)合位點(diǎn)調(diào)節(jié)基因：產(chǎn)生調(diào)節(jié)蛋白（與操縱位點(diǎn)結(jié)合）→結(jié)構(gòu)基因不轉(zhuǎn)錄誘導(dǎo)物存在時(shí)，可與阻遏蛋白結(jié)合→結(jié)構(gòu)基因轉(zhuǎn)錄ControlelementStructuralgenes第5頁，講稿共70頁，2023年5月2日，星期三6.1.2酶的誘導(dǎo)現(xiàn)象B-半乳糖苷酶第6頁，講稿共70頁，2023年5月2日，星期三分解底物的酶只有在底物存在時(shí)才出現(xiàn)！無乳糖時(shí)，幾個(gè)B-gal/cell

加入乳糖時(shí)，5000個(gè)再去掉乳糖，lacmRNA下降

乳糖能激發(fā)lacmRNA的合成

乳糖的誘導(dǎo)作用是由酶前體轉(zhuǎn)化而來，還是誘導(dǎo)新酶合成？培養(yǎng)基（35S-aa,無乳糖）→E.coli繁殖→培養(yǎng)基（無35S-aa,加入乳糖）→β-gal(無35S)第7頁，講稿共70頁，2023年5月2日，星期三6.1.3調(diào)控機(jī)理1調(diào)控區(qū)結(jié)構(gòu)lacI,1045bp，獨(dú)立PiP,82bp，－82～＋1O,35bp，－7～＋28lacZYA第8頁，講稿共70頁，2023年5月2日，星期三2.阻遏狀態(tài)第9頁，講稿共70頁，2023年5月2日，星期三3誘導(dǎo)狀態(tài)誘導(dǎo)物誘導(dǎo)作用：在可誘導(dǎo)的操縱元中，加入對(duì)基因表達(dá)有調(diào)節(jié)作用的小分子后，開啟基因的轉(zhuǎn)錄活性第10頁，講稿共70頁，2023年5月2日，星期三4誘導(dǎo)物不是乳糖生成lac誘導(dǎo)物乳糖代謝Allolctose異構(gòu)乳糖別乳糖細(xì)胞內(nèi)β-半乳糖苷酶來源?第11頁，講稿共70頁，2023年5月2日，星期三6.1.4阻遏蛋白的作用機(jī)制1阻遏蛋白結(jié)構(gòu)38KD，4聚體，一個(gè)亞基結(jié)合一個(gè)乳糖分子lacI

組成型轉(zhuǎn)錄

Pi弱啟動(dòng)子，

5－10個(gè)／cell具有二重性阻止轉(zhuǎn)錄（與lacO結(jié)合）開始轉(zhuǎn)錄（與誘導(dǎo)物結(jié)合）第12頁，講稿共70頁，2023年5月2日，星期三

阻遏蛋白的結(jié)構(gòu)域

頭段，-NH2端，lacO結(jié)合區(qū)絞鏈區(qū)

核心段，-COOH，誘導(dǎo)物結(jié)合區(qū)第13頁，講稿共70頁，2023年5月2日，星期三4個(gè)亞基的核心片段接觸形成四聚體第14頁，講稿共70頁，2023年5月2日，星期三第15頁，講稿共70頁，2023年5月2日，星期三

對(duì)稱軸，+11對(duì)稱序列，6bp

阻遏蛋白的結(jié)合位點(diǎn)－－lacO的結(jié)構(gòu)第16頁，講稿共70頁，2023年5月2日，星期三3阻遏蛋白對(duì)RNApol功能的影響阻遏蛋白和RNApol可同時(shí)與DNA結(jié)合

RNApol與啟動(dòng)子結(jié)合的平衡常數(shù)1.9X107

有阻遏蛋白時(shí),2.5X109結(jié)合著的RNApol不能轉(zhuǎn)錄.但加入誘導(dǎo)物后,釋放出阻遏蛋白,變?yōu)殚_放型啟動(dòng)子復(fù)合物.阻遏蛋白實(shí)際上使RNApol貯存在啟動(dòng)子上。這一模式是否存在于其它操縱元系統(tǒng)中？第17頁，講稿共70頁，2023年5月2日，星期三+glucose-glucoseTime(hr)Unitsof-galactosidase+lactoseGlucoseadded6.1.5lacoperon的正調(diào)控

1代謝物阻遏效應(yīng)實(shí)驗(yàn)，在lac＋Glu培養(yǎng)基上

E.coli只利用G，只有G

耗盡時(shí)，才會(huì)利用lac葡萄糖抑制lacmRNA的轉(zhuǎn)錄：

可阻止誘導(dǎo)物引起的阻遏物失活效應(yīng)僅去掉阻遏物并不能啟動(dòng)lac基因表達(dá),有其它因素參與第18頁，講稿共70頁，2023年5月2日，星期三葡萄糖對(duì)lac操縱元表達(dá)的抑制是間接的

乳糖的降解是通過cAMP與CAP結(jié)合起作用的

cAMP:環(huán)化腺苷酸CAP,cataboliteactivatorprotein

由crp編碼CRP,catabolitereceptorprotein第19頁，講稿共70頁，2023年5月2日，星期三第20頁，講稿共70頁，2023年5月2日，星期三2CAP結(jié)合位點(diǎn)CAP為二聚體，45KD，被cAMP激活結(jié)合位點(diǎn)～22bpI-70~-50II-50~-40第21頁，講稿共70頁，2023年5月2日，星期三由于序列的差異，使不同基因受cAMP激活的水平不同結(jié)合位點(diǎn)序列保守第22頁，講稿共70頁，2023年5月2日，星期三3CAP的結(jié)合對(duì)DNA構(gòu)型的影響DNA彎曲彎曲點(diǎn)位于CAP結(jié)合位點(diǎn)二重對(duì)稱的中心彎曲使CAP能與啟動(dòng)子上的RNApol接觸第23頁，講稿共70頁，2023年5月2日，星期三（1）CAP結(jié)合位點(diǎn)與轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)的位置CAP與轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)的距離，相距數(shù)個(gè)整雙螺旋CAP結(jié)合位點(diǎn)在啟動(dòng)子的上下游，都能發(fā)揮作用4

CAP對(duì)轉(zhuǎn)錄的影響第24頁，講稿共70頁，2023年5月2日，星期三（2）基因轉(zhuǎn)錄對(duì)cAMP—CAP系統(tǒng)的依賴性，

與啟動(dòng)子本身的效率有關(guān)cAMP-CAP復(fù)合物的結(jié)合，使位點(diǎn)II附近的富含GC區(qū)域雙螺旋結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性降低，因而-10區(qū)的熔解溫度降低，促進(jìn)開放型啟動(dòng)子復(fù)合物的形成第25頁，講稿共70頁，2023年5月2日，星期三（3）CAP激活轉(zhuǎn)錄的方式CAP直接作用于RNApola亞基缺失RNApola亞基的—C末端時(shí)，失去受CAP激活的能力作用于DNA，改變其結(jié)構(gòu)第26頁，講稿共70頁，2023年5月2日，星期三6.1.6lacoperon的其它問題1.lacoperon的功能是在正負(fù)兩個(gè)調(diào)控體系的協(xié)調(diào)作用(coordinateregulation)下實(shí)現(xiàn)的。阻遏蛋白封閉轉(zhuǎn)錄時(shí)，CAP不發(fā)揮作用；如沒有CAP加強(qiáng)轉(zhuǎn)錄，即使阻遏蛋白從P上解聚仍無轉(zhuǎn)錄活性CAP組成型合成，所以cAMP－CAP復(fù)合物取決于cAMP含量腺苷酸環(huán)化酶位于細(xì)胞膜上，其活性與葡萄糖運(yùn)輸?shù)拿赣嘘P(guān)，因此cAMP－CAP調(diào)控乳糖、半乳糖、阿拉伯糖等糖類代謝有關(guān)的酶降解物敏感型操縱元：只要有葡萄糖存在，這些操縱元就不表達(dá)

第27頁，講稿共70頁，2023年5月2日，星期三2.A基因及其生理功能編碼B-半乳糖苷乙酰基轉(zhuǎn)移酶，使半乳糖苷乙?；Ｔ撁覆粎⑴c乳糖代謝！生理意義：在細(xì)胞中有許多能被半乳糖苷酶降解的半乳糖苷類物質(zhì)，其分解產(chǎn)物不能進(jìn)一步代謝，積累，抑制細(xì)胞生長。半乳糖苷乙?；?，即無毒.所以lacA雖不在乳糖降解中起作用，但可抑制有害物質(zhì)的積累3.lac基因產(chǎn)物數(shù)量，1：0.5：0.2

不同酶的數(shù)量差異,是由于在翻譯水平上的調(diào)節(jié).方式有二:核糖體脫離:多順反子的差別性翻譯

內(nèi)切酶作用:在lacmRNA分子內(nèi)部，a基因比z基因更易受內(nèi)切酶作用第28頁，講稿共70頁，2023年5月2日，星期三Summary第29頁，講稿共70頁，2023年5月2日，星期三第30頁，講稿共70頁，2023年5月2日，星期三SummaryoflacoperonregulationGlucosecAMPLactoseTranscriptionoflacmRNAHighLowPresentlowrateofexpressionHighLowAbsentessentiallynoneLowHighAbsentessentiallynoneLowHighPresenthighrateofexpression第31頁，講稿共70頁，2023年5月2日，星期三6.2Trpoperon生物細(xì)胞中的氨基酸合成，也受操縱元的調(diào)節(jié)。細(xì)胞需要某種氨基酸時(shí)，其基因即表達(dá)，不需要時(shí)基因關(guān)閉，達(dá)到經(jīng)濟(jì)的原則。第32頁，講稿共70頁，2023年5月2日，星期三trpR,阻遏蛋白P，-40~+18O,-21~+1L,+1~+162結(jié)構(gòu)基因t,A下游36bp,不依賴pt’,t下游250bp，依賴p6.2.1基因組成第33頁，講稿共70頁，2023年5月2日，星期三sne298第34頁，講稿共70頁，2023年5月2日，星期三6.2.2Trpoperon的阻遏系統(tǒng)1TrpR四聚體第35頁，講稿共70頁，2023年5月2日，星期三阻遏蛋白＋trp

→有活性的阻遏物SNE299＋trpO→不轉(zhuǎn)錄第36頁，講稿共70頁，2023年5月2日，星期三2阻遏蛋白的結(jié)合位點(diǎn)

trpO-21~+1，反向重復(fù)序列trpP-40~+18活性阻遏物與trpO的結(jié)合與RNApol與啟動(dòng)子的結(jié)合發(fā)生競爭SNE299第37頁，講稿共70頁，2023年5月2日，星期三3阻遏系統(tǒng)主管轉(zhuǎn)錄是否啟動(dòng)，在培養(yǎng)基中有少量Trp時(shí)，mRNA起始合成，但不能自動(dòng)延伸，一般在trpE之前終止轉(zhuǎn)錄

粗調(diào)開關(guān)第38頁，講稿共70頁，2023年5月2日，星期三6.2.3弱化作用

attenuation1弱化子，衰減子，α前導(dǎo)RNA，140bpα第39頁，講稿共70頁，2023年5月2日，星期三弱化子，衰減子，α第40頁，講稿共70頁，2023年5月2日，星期三序列分析發(fā)現(xiàn)，其中4個(gè)片段進(jìn)行配對(duì)，形成不同的二級(jí)結(jié)構(gòu)Terminator第41頁，講稿共70頁，2023年5月2日，星期三

S3122前導(dǎo)肽14aa第42頁，講稿共70頁，2023年5月2日，星期三第43頁，講稿共70頁，2023年5月2日，星期三3轉(zhuǎn)錄弱化作用LackoftrpLackofaminoacyltRNARibosomepauseattrpcodons,occludingsequence1Form2:3hairpinanti-terminator

TranscriptionintotrpEandbeyond第44頁，講稿共70頁，2023年5月2日，星期三HightrpTrpisinsertedatthetrpcodonsTranslatetotheendofleadermessageRibosomeoccludesequence2Terminatetranscriptionat(3:4formterminator)第45頁，講稿共70頁，2023年5月2日，星期三弱化子對(duì)轉(zhuǎn)錄調(diào)控的關(guān)鍵空間結(jié)構(gòu)，10thand11thcodonsencodetrpresidues(rareAA)時(shí)間，核糖體停頓在2個(gè)Trp密碼子上時(shí)，產(chǎn)生延宕，此時(shí)4區(qū)未轉(zhuǎn)錄出來Theleaderpeptideistodeterminertrpavailabilityandtoregulatetranscriptiontermination14–amino-acid(encodedby27-68oftheleaderRNAsummary第46頁，講稿共70頁，2023年5月2日，星期三6.2.4阻遏作用與弱化作用的協(xié)調(diào)

阻遏效率啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄起始頻率在R+和R-相差70倍弱化作用

trp存在時(shí)，約有10％的RNApol僥幸轉(zhuǎn)錄trp操縱子具有雙重調(diào)節(jié)體系？第47頁，講稿共70頁，2023年5月2日，星期三Negative—repressibleoperon可以被最終合成產(chǎn)物所阻遏RPOleadingseq.EDCBAtrp+為什么需要阻遏體系？當(dāng)大量Trp存在時(shí)，阻遏系統(tǒng)起作用。阻遏物與之結(jié)合，阻止先導(dǎo)mRNA合成。

經(jīng)濟(jì)第48頁，講稿共70頁，2023年5月2日，星期三僅有少量trp時(shí)，RNApol啟動(dòng)，但在L.S.處脫落，轉(zhuǎn)錄中斷RPOleadingseq.EDCBA少量trp+不足以結(jié)合

O

位點(diǎn)為什么需要弱化系統(tǒng)？當(dāng)trp濃度低時(shí)，阻遏物從有活性變?yōu)闊o活性，速度極慢，不能很快引發(fā)trp合成。因此需要一個(gè)能快速作出反應(yīng)的系統(tǒng)，以保持培養(yǎng)基中適當(dāng)?shù)腡rp水平,弱化系統(tǒng)恰恰符合此要求。第49頁，講稿共70頁，2023年5月2日，星期三第50頁，講稿共70頁，2023年5月2日，星期三6.2.5正控制系統(tǒng)和負(fù)控制系統(tǒng)1負(fù)控制系統(tǒng)：在沒有調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)存在時(shí)基因表達(dá)，加入調(diào)節(jié)蛋白后基因表達(dá)活性被關(guān)閉阻遏蛋白：負(fù)控制系統(tǒng)中的調(diào)節(jié)蛋白第51頁，講稿共70頁，2023年5月2日，星期三Addsignalmol.OperonoffCo-repressor輔阻遏物Addsignalmol.OperononInducer誘導(dǎo)物(inducibleoperon)(repressibleoperon)負(fù)控誘導(dǎo)負(fù)控阻遏第52頁，講稿共70頁，2023年5月2日，星期三2正控制系統(tǒng)：沒有調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)存在時(shí)基因關(guān)閉,加入這種調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)后基因活性被開啟誘導(dǎo)蛋白第53頁，講稿共70頁，2023年5月2日，星期三6.3基因轉(zhuǎn)錄的時(shí)序調(diào)控概念：原核生物在生長發(fā)育的各個(gè)階段，基因的表達(dá)是按照一定時(shí)間順序進(jìn)行的意義有效利用能源避免不適當(dāng)?shù)谋磉_(dá)，造成的危害途徑亞基的更換（枯草桿菌，E.coli，T4phage）

T7噬菌體生長過程中RNApol的替代噬菌體基因表達(dá)的調(diào)控第54頁，講稿共70頁，2023年5月2日，星期三亞基的更換8.3.1枯草桿菌噬菌體SPO1早中晚基因表達(dá)的轉(zhuǎn)換SPO1，烈性噬菌體如何實(shí)現(xiàn)早中晚基因表達(dá)的轉(zhuǎn)換?通過更換亞基，使SPO1的早中晚基因有條不紊地表達(dá)因子的負(fù)責(zé)識(shí)別啟動(dòng)子的保守序列，是轉(zhuǎn)錄起始唯一需要的因子。許多細(xì)菌能生產(chǎn)多種可取代的因子，以識(shí)別不同的啟動(dòng)子。當(dāng)細(xì)胞從基本的轉(zhuǎn)錄機(jī)制轉(zhuǎn)入各種特定基因表達(dá)時(shí)，需要不同的因子指導(dǎo)RNA聚合酶與各種啟動(dòng)子結(jié)合第55頁，講稿共70頁，2023年5月2日，星期三早期，2‘55，產(chǎn)生gp28gp28

取代

55第56頁，講稿共70頁，2023年5月2日，星期三中期，gp28取代55產(chǎn)生gp33,gp34第57頁，講稿共70頁，2023年5月2日，星期三晚期,gp33,gp34取代

gp28，

55第58頁，講稿共70頁，2023年5月2日，星期三枯草桿菌中每個(gè)因子都能識(shí)別具有特征性的一致序列的一組啟動(dòng)子調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)相互取代的原因，可能是它們與核心酶的親和力所決定的第59頁，講稿共70頁，2023年5月2日，星期三6.4小分子RNA的翻譯調(diào)節(jié)6.4.1干擾mRNA的互補(bǔ)RNAmRNA－interferingcomplementaryRNA1983年，Mizuno,Simon幾乎同時(shí)發(fā)現(xiàn)RNA可作為調(diào)節(jié)因子，與調(diào)節(jié)蛋白一樣，RNA合成后，可擴(kuò)散到靶位點(diǎn)。RNA也可作為調(diào)節(jié)物質(zhì)？！反義RNA，可與mRNA結(jié)合結(jié)合位點(diǎn)是S-D,AUG,部分N端密碼子與RNA形成雙螺旋結(jié)構(gòu)，作為內(nèi)切酶底物與轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物結(jié)合，使轉(zhuǎn)錄提前終止第60頁，講稿共70頁，2023年5月2日，星期三例，Ecoli中外膜蛋白o(hù)mpF的表達(dá)調(diào)控λ噬菌體，cII蛋白抑制晚期基因轉(zhuǎn)錄Tn10中轉(zhuǎn)座酶翻譯的調(diào)節(jié)第61頁，講稿共70頁，2023年5月2日，星期三6.4.2Ecoli中ompF

基因的翻譯調(diào)節(jié)Env，編碼滲透壓感受器的受體蛋白o(hù)mpC低滲時(shí)，ompC關(guān)閉，ompF增加高滲時(shí)，ompC增加，ompF下降ompC與ompF是外膜蛋白，受培養(yǎng)基滲透壓的調(diào)節(jié)第62頁，講稿共70頁，2023年5月2日，星期三第63頁，講稿共70頁，2023年5月2日，星期三RNAi技術(shù)1998年2月，AndrewFire等將單鏈RNA純化后注射線蟲時(shí)發(fā)現(xiàn)，基因抑制