細胞生物學40課件2

第一節(jié)細胞形態(tài)結構的觀察方法一、光鏡技術

1、幾種常見光學顯微鏡A普通光學顯微鏡

普通生物顯微鏡由3部分構成，即：①照明系統(tǒng)，包括光源和聚光器；②光學放大系統(tǒng)，由物鏡和目鏡組成，是顯微鏡的主體；③機械裝置，用于固定材料和觀察方便。本文檔共50頁；當前第1頁；編輯于星期二\5點26分本文檔共50頁；當前第2頁；編輯于星期二\5點26分B暗視野顯微鏡

使用特殊的照明方法，使照明光線不直接進入物鏡，只允許被標本反射和衍射的光線進入物鏡，因而視野的背景是黑的，物體的邊緣是亮的。利用這種顯微鏡能見到小至4~200nm的微粒子，分辨率可比普通顯微鏡高50倍。

應用：觀察未經(jīng)染色的活體或膠體粒子。本文檔共50頁；當前第3頁；編輯于星期二\5點26分本文檔共50頁；當前第4頁；編輯于星期二\5點26分

C相差顯微鏡（PCM）1953年獲得諾貝爾物理獎，相差顯微鏡的基本原理是，把透過標本的可見光（直射光和衍射光）的光程差變成振幅差，從而提高了各種結構間的對比度，使各種結構變得清晰可見。

應用：觀察未經(jīng)染色的標本和活細胞。一種介殼蟲的染色體（PCM照片）本文檔共50頁；當前第5頁；編輯于星期二\5點26分在相差顯微鏡下觀察的分裂期細胞變化過程

本文檔共50頁；當前第6頁；編輯于星期二\5點26分

D倒置顯微鏡組成和普通顯微鏡一樣，只不過物鏡與照明系統(tǒng)顛倒，前者在載物臺之下，后者在載物臺之上，用于觀察培養(yǎng)的活細胞，具有相差物鏡。本文檔共50頁；當前第7頁；編輯于星期二\5點26分E熒光顯微鏡

細胞中有些物質，如葉綠素等，受紫外線照射后可發(fā)熒光；另有一些物質本身雖不能發(fā)熒光，但如果用熒光染料或熒光抗體染色后，經(jīng)紫外線照射亦可發(fā)熒光，熒光顯微鏡就是對這類物質進行定性和定量研究的工具之一。本文檔共50頁；當前第8頁；編輯于星期二\5點26分本文檔共50頁；當前第9頁；編輯于星期二\5點26分熒光顯微鏡照片（微管呈綠色、微絲紅色、核藍色）本文檔共50頁；當前第10頁；編輯于星期二\5點26分F微分干涉差顯微鏡（DIC顯微鏡）

能顯示細胞結構的三維立體投影影像，立體感強，用于研究活細胞中較大的細胞器，與錄像設備結合，可觀察活細胞中的顆粒及細胞器的運動。尼康E800熒光DIC顯微鏡本文檔共50頁；當前第11頁；編輯于星期二\5點26分DIC顯微鏡下的硅藻本文檔共50頁；當前第12頁；編輯于星期二\5點26分

G激光共聚焦掃描顯微鏡（LSC顯微鏡）

可改變觀察的焦平面，因而能進行“光學切片”，觀察較厚樣品的內(nèi)部結構。將改變焦點獲得的一系列細胞不同平面上的圖像疊加后，可重構出樣品的三維結構。

激光共聚焦掃描顯微鏡既可以用于觀察細胞形態(tài)，也可以用于細胞內(nèi)生化成分的定量分析、光密度統(tǒng)計以及細胞形態(tài)的測量。本文檔共50頁；當前第13頁；編輯于星期二\5點26分本文檔共50頁；當前第14頁；編輯于星期二\5點26分LCSM照片，藍色為細胞核，綠色為微管本文檔共50頁；當前第15頁；編輯于星期二\5點26分2光鏡標本的制備以石蠟切片為例：材料處理固定脫水包埋切片染色觀察

染色劑：普通染色劑，熒光染色劑本文檔共50頁；當前第16頁；編輯于星期二\5點26分3光鏡技術的應用

A觀察活細胞的形態(tài)結構，生命運動，細胞周期。B細胞器的定位及功能研究。C基因產(chǎn)物與大分子物質的定位及定量。D監(jiān)測細胞代謝活動。

本文檔共50頁；當前第17頁；編輯于星期二\5點26分

例：胞內(nèi)鈣離子濃度的監(jiān)測鈣是通用的第三信使，能特異地選擇性地調節(jié)細胞的活動，因此測定細胞中鈣離子濃度在空間和時間上的變化，對于監(jiān)控許多細胞的生理活動有重要作用。如受精時，卵細胞突然定位地將鈣離子釋放到胞漿中。

鈣指示劑：FuRA－2，水母發(fā)光蛋白等本文檔共50頁；當前第18頁；編輯于星期二\5點26分沙元雙細胞胚中一個細胞的鈣信號引起鈣依賴水母發(fā)光蛋白發(fā)光本文檔共50頁；當前第19頁；編輯于星期二\5點26分羅丹明123染色后顯示的細胞線粒體的定位本文檔共50頁；當前第20頁；編輯于星期二\5點26分二、電鏡技術1、透射電子顯微鏡（TEM）

透射電子顯微鏡以電子束為光源，由于電子束的波長要比可見光和紫外光短得多，并且電子束的波長與發(fā)射電子束的電壓平方根成反比，也就是說電壓越高波長越短，因而使其分辨力大大提高，目前TEM的分辨力可達0.2nm。電子顯微鏡的放大倍數(shù)最高可達近百萬倍、由電子照明系統(tǒng)、電磁透鏡成像系統(tǒng)、真空系統(tǒng)、記錄系統(tǒng)、電源系統(tǒng)等5部分構成。本文檔共50頁；當前第21頁；編輯于星期二\5點26分本文檔共50頁；當前第22頁；編輯于星期二\5點26分本文檔共50頁；當前第23頁；編輯于星期二\5點26分

2掃描電子顯微鏡（SEM）掃描電子顯微鏡（SEM），可用來觀察標本的表面結構。其工作原理是用一束極細的電子束掃描樣品，在樣品表面激發(fā)出次級電子，次級電子的多少與電子束入射角有關，也就是說與樣品的表面結構有關，次級電子由探測體收集，并在那里被閃爍器轉變?yōu)楣庑盘枺俳?jīng)光電倍增管和放大器轉變?yōu)殡娦盘杹砜刂茻晒馄辽想娮邮膹姸?，顯示出與電子束同步的掃描圖像。圖像為立體形象，反映了標本的表面結構。本文檔共50頁；當前第24頁；編輯于星期二\5點26分本文檔共50頁；當前第25頁；編輯于星期二\5點26分人類紅細胞的SEM圖片本文檔共50頁；當前第26頁；編輯于星期二\5點26分花粉的SEM圖片昆蟲卵的SEM圖片本文檔共50頁；當前第27頁；編輯于星期二\5點26分3掃描透射電子顯微鏡（STEM）

是唯一不需要染色、固定而能夠直接觀測單個生物分子的儀器。世界上僅有幾臺。4掃描隧道顯微鏡（STM）

獲1986年諾貝爾物理學獎。可用來顯示晶體表面原子布陣。固態(tài)、液態(tài)和氣態(tài)三態(tài)物質均可進行觀察，能直接觀察生物大分子的原子布陣，也能觀察一些生物結構的原子排列，有助于把生物學研究推進到納米科學水平。本文檔共50頁；當前第28頁；編輯于星期二\5點26分第二節(jié)細胞組分的分析方法一、用超速離心技術分離細胞器與生物大分子及其復合物1、差速離心2、密度梯度離心1）速度沉降主要用于分離密度相近而大小不一的細胞組分。2）等密度沉降主要用于分離不同密度的細胞組分。本文檔共50頁；當前第29頁；編輯于星期二\5點26分

在密度均一的介質中由低速到高速逐級離心，用于分離不同大小的細胞和細胞器,速度逐漸提高，樣品按大小先后沉淀本文檔共50頁；當前第30頁；編輯于星期二\5點26分A：速度沉降B：等密度沉降本文檔共50頁；當前第31頁；編輯于星期二\5點26分二、細胞內(nèi)核酸、蛋白質、酶、糖與脂類等的顯示方法原理：利用一些顯色劑與所檢測物質中一些 特殊基團特異性結合的特征，通過顯色劑在細胞中的定位及顏色的深淺來判斷某種物質在細胞中的分布與含量。本文檔共50頁；當前第32頁；編輯于星期二\5點26分Feulgen反應→DNA

蘇丹Ⅲ→脂類本文檔共50頁；當前第33頁；編輯于星期二\5點26分酶的顯示是通過顯示酶的活性來表明酶的存在，而不是酶的本身。將具有酶活性的組織放入含有一定底物的溶液中孵育，底物經(jīng)酶的作用形成初級反應產(chǎn)物，它再與某種捕捉劑相反應,形成顯微鏡下可視性沉淀,即最終反應產(chǎn)物。

如：細胞內(nèi)酸性磷酸酶的顯示先將切片放入含有酶底物(常用β-甘油磷酸鈉)的溶液中孵育，底物經(jīng)酶的作用，水解并釋放出磷酸；用捕捉劑硝酸鉛與磷酸反應，形成微細的磷酸鉛沉淀，此時，可在電鏡下檢出；如再用硫化銨處理時，磷酸鉛被置換成硫化鉛沉淀，可在光鏡下見到。本文檔共50頁；當前第34頁；編輯于星期二\5點26分

ABA:細胞色素氧化酶活性定位B:ATP酶活性定位本文檔共50頁；當前第35頁；編輯于星期二\5點26分三、特異蛋白抗原的定位與定性

一般說來，發(fā)生在組織細胞內(nèi)的抗原抗體反應是不可見的，但如果事先將某種熒光素、酶、同位素等用生化方法標記在抗體分子上（標記抗體），就能憑借特殊光鏡及電鏡等觀察標本中的熒光現(xiàn)象、酶作用的沉淀物（顏色）、放射線徑跡的有無和部位，由此判斷是否發(fā)生了特異性的抗原抗體反應以及抗原物質的定位分布。本文檔共50頁；當前第36頁；編輯于星期二\5點26分四、細胞內(nèi)特異核酸的定位與定性原位雜交：用標記的核酸探針通過分子雜交確定特異核苷酸序列在染色體上或在細胞中的位置的方法。在顯微與亞顯微水平上的基因定位、特異mRNA表達等研究中起重要作用。光鏡水平的原位雜交技術

（同位素標記或熒光素標記探針）

電鏡水平的原位雜交技術（生物素標記的探針與抗生物素抗體相連的膠體金標記結合）本文檔共50頁；當前第37頁；編輯于星期二\5點26分人類染色體端粒DNA的熒光原位雜交照片本文檔共50頁；當前第38頁；編輯于星期二\5點26分五、放射自顯影技術原理及應用：利用同位素的放射自顯影，對細胞內(nèi)生物大分子進行定性、定位與定量研究；實現(xiàn)對細胞內(nèi)生物大分子進行動態(tài)和追蹤研究。本文檔共50頁；當前第39頁；編輯于星期二\5點26分a：疏松染色質處的RNA轉錄b：骨髓細胞高爾基復合體處的硫酸酯（箭頭處）本文檔共50頁；當前第40頁；編輯于星期二\5點26分六、定量細胞化學分析技術

細胞顯微分光光度術利用細胞內(nèi)某些物質對特異光譜的吸收，測定這些物質如（核酸與蛋白質等）在細胞內(nèi)的含量。

本文檔共50頁；當前第41頁；編輯于星期二\5點26分流式細胞術：

指用流式細胞儀（FCM）對細胞或染色體進行分選或對單個細胞或其它生物微粒進行定量分析的一門技術。

主要應用：用于定量測定細胞中的DNA、RNA或某一特異蛋白的含量； 測定細胞群體中不同時相細胞的數(shù)量； 從細胞群體中分離某些特異染色的細胞； 分離特異染色的染色體。本文檔共50頁；當前第42頁；編輯于星期二\5點26分※細胞分選熒光標記抗體探針＋細胞抗原細胞被標記除去游離抗體稀釋超聲波振蕩器內(nèi)與鞘液混合液滴被激普通細胞：干涉檢測器檢測光激發(fā)熒光標記：干涉檢測器＋細胞熒光檢測器檢測鞘液帶上正電荷負極收集器鞘液帶上負電荷正極收集器※染色體分選同理。用熒光標記的DNA探針同特異染色體結合，使待分選的染色體帶上熒光標記。本文檔共50頁；當前第43頁；編輯于星期二\5點26分用流式細胞計分選細胞示意圖本文檔共50頁；當前第44頁；編輯于星期二\5點26分第三節(jié)細胞培養(yǎng)、細胞工程

與顯微操作技術一、細胞培養(yǎng)二、細胞工程三、顯微操作技術本文檔共50頁；當前第45頁；編輯于星期二\5點26分

高等生物是由多細胞構成的整體，在整體條件下要研究單個細胞或某一群細胞在體內(nèi)的功能活動是十分困難的。但是如果把活細胞拿到體外培養(yǎng)進行觀察和研究