幽門螺桿菌黏唾液酸黏附素疫苗治療小鼠幽門螺桿菌感染

幽門螺桿菌黏唾液酸黏附素疫苗治療小鼠幽門螺桿菌感染【摘要】目的:利用人類幽門螺桿菌()感染的小鼠模型研究唾液酸黏附素疫苗治療感染的作用.方法：把已感染的小鼠分成4組,分別通過灌胃方法給予唾液酸黏附素100μg加霍亂毒素CT2μg、單純唾液酸黏附素100μg、單純CT2μg或PBS,1次/wk,共4次,治療結(jié)束后4wk處死動物,取胃粘膜行半定量細菌培養(yǎng)檢查情況.結(jié)果：治療后各組根除率分別為:唾液酸黏附素加CT組30%、單純唾液酸黏附素組、單純CT組及PBS組根除率均為0%.差異有統(tǒng)計學(xué)意義.未根除的小鼠，唾液酸黏附素加CT組的定植密度明顯低于其它3組.結(jié)論：唾液酸黏附素能夠作為多價治療疫苗的組分之一.

【關(guān)鍵詞】幽門螺桿菌；唾液酸黏附素；克??；免疫；疫苗

ImmunizationtreatmentofHelicobacterpyloriinfectionwiththevaccinecomposedofsialicacidadhesinandCT:Ananimalmodelstudy

【Abstract】AIM:ToinvestigatetheeffectsofthevaccineconsistingofHelicobacterpylori()sialicacidadhesinandcholeratoxin(CT)inthetreatmentofinfectioninainfectedmousemodel.METHODS:TheC57BL/6miceinfectedwithweredividedinto4groups.Themiceofeachgroupwereimmunizedbysialicacidadhesin(100μg)plusCT(2μg),sialicacidadhesin(100μg),CT(2μg),PBSorallyrespectively,onceaweekfor4weeks.Fourweeksafterlasttreatment,allanimalsweresacrificedandstomachbiopsieswerecollectedtodetectbythesemiquantitativebacterialcultureassay.RESULTS:Theeradicationrateofthevaccinegroupwas30%.Theeradicationratesoftheother3groupswereall0%.Thereweresignificantdifferencesintheeradicationrateamongthevaccinationgroupandtheother3controlgroups().Inaddition,thecolonizeddensityofvaccinationgroupwassignificantlylowerthanthatofother3groups().CONCLUSION:Sialicacidadhesincouldbeaneffectivecomponentofmultivalencevaccine.

【Keywords】Helicobacterpylori;sialicacidadhesin;cloning;immune;vaccine

0引言

我們已經(jīng)構(gòu)建了幽門螺桿菌唾液酸黏附素的高效原核表達體系［1-2］，并對其進行了純化及功能研究［3］.現(xiàn)通過建立感染的小鼠模型觀察唾液酸黏附素疫苗治療感染的作用，為多價治療性疫苗的研制奠定基礎(chǔ).

1材料和方法

材料無特定病原體C57BL/6小鼠30只，4wk齡，雄性，質(zhì)量12~13g，飼養(yǎng)條件符合2級動物要求.純化的重組唾液酸黏附素在以前的研究中已經(jīng)制備；其余試劑為國產(chǎn)分析純.的固體培養(yǎng)：取冷凍保存的菌種一環(huán)于固體培養(yǎng)基上連續(xù)劃線接種，2h內(nèi)置厭氧培養(yǎng)箱，37℃微需氧環(huán)境中培養(yǎng)72h，濕度保持95％以上.的菌落呈園形，凸起、光滑、灰白色、半透明，直徑~mm左右.液體培養(yǎng)：取固體培養(yǎng)基上生長的菌落至布氏肉湯中，抽濾瓶抽氣換氣2次以滿足微需氧條件，恒溫振蕩培養(yǎng)120r/min培養(yǎng)48~72h.的鑒定包括菌落形態(tài)、涂片觀察、尿素酶實驗.灌胃用的要求：革蘭氏染色陰性，形態(tài)呈S形、螺旋形、桿狀，暗視野下有活力，不含雜菌，密度約為1012/L.

感染小鼠模型的建立:采用參考文獻［4］方法馴化ss1株，分離可在小鼠胃內(nèi)穩(wěn)定定植的ss1株，固體培養(yǎng)2~3d，菌落經(jīng)鑒定后用布氏肉湯洗下，調(diào)整細菌濃度至1012CFU/L，每只小鼠灌胃mL.所有動物灌胃前禁食12h，禁水4h.灌胃后禁食2h.連續(xù)5次，1wk完成.采用胃管法以確保灌入胃內(nèi).末次灌胃后4wk隨機處死5只小鼠，剖腹取胃，沿縱軸將胃切為3部分，一份行快速尿素酶試驗，一份置40g/L甲醛固定供組織學(xué)檢查，一份細菌培養(yǎng)，檢查是否感染

方法將已鑒定感染的剩余的25只小鼠隨機分成4組：①疫苗組：經(jīng)口喂飼唾液酸黏附素100μg加霍亂毒素2μg；②單純唾液酸黏附素疫苗組：經(jīng)口喂飼唾液酸黏附素100μｇ；③單純霍亂毒素組：經(jīng)口喂飼ＣＴ2μｇ；④PBS組：經(jīng)口喂飼PBS200μg/鼠/次.治療組10只小鼠:后3組為對照組，每組5只小鼠.免疫治療前小鼠禁食12h，禁水4h.每只小鼠先用30g/L碳酸氫鈉100μL灌胃以中和胃酸，10min后分別按上述分組灌胃，30min后再給小鼠提供水和食物.隔周免疫，加強免疫3次，劑量同前.末次免疫后4wk，禁食1d，摘眼球放血處死動物，用750g/L乙醇浸泡小鼠體表5min以上.在超凈工作臺內(nèi)迅速取出胃用于免疫治療后幽門螺桿菌根除的鑒定，方法采用半定量細菌培養(yǎng)法［5］，胃組織稱重后，制成勻漿，用布氏肉湯倍比稀釋后，取200μL涂于固體培養(yǎng)基，菌落計數(shù)后，計算單位胃組織的定植細菌密度.

統(tǒng)計學(xué)處理:采用軟件，計數(shù)資料用χ2檢驗，計量資料的比較采用方差分析，為差異有統(tǒng)計學(xué)意義.

2結(jié)果

經(jīng)尿素酶實驗、組織病理學(xué)檢查及細菌培養(yǎng)證實5只隨機處死的小鼠全部感染細菌培養(yǎng)發(fā)現(xiàn)胃組織的定植密度為105-6/g.胃組織培養(yǎng)為陰性者定為根除，疫苗治療組10例中有3例根除，根除率為30%，其它3組無1例根除，根除率為%.未根除的小鼠，我們進行了定植密度的分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)疫苗治療組的定植密度為×10e-6菌落形成單位/克胃組織，明顯低于其它3組，其差異有統(tǒng)計學(xué)意義口服免疫已感染的恒河猴，大多數(shù)動物胃內(nèi)定植密度減少且胃炎明顯好轉(zhuǎn)［6-7］；免疫治療已成為治療感染最有效、最有前景的方法之一.同時也提示單一尿素酶抗原免疫不能達到最佳的治療效果，為了確保免疫治療效果必須尋找其它有效抗原成分來配制更有效的多價疫苗.在疫苗候選成分的研制過程中，目前采用的基因重組抗原尿素酶、過氧化氫酶、細胞空泡毒素等，基本上著眼于阻斷的毒力因素，而與Hp定植密切相關(guān)的黏附素評價較少.如從黏附素出發(fā)尋找保護性抗原也許是一種有益的嘗試.唾液酸黏附素是近年來研究中新確定的功能蛋白，其相對分子質(zhì)量約17500，能夠結(jié)合含唾液酸的鞘糖脂和胎球蛋白瓊脂糖.在其它病原微生物的研究中如諾瓦克病毒，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)NV能夠與人的唾液相結(jié)合，進一步研究表明，與NV相結(jié)合的唾液中所含的受體廣泛存在于人體的消化道黏膜表面，NV通過與這些受體結(jié)合從而定植于人體，才能進一步發(fā)揮其致病作用，因此，能夠與這些受體相結(jié)合的NV蛋白配體是重要的功能蛋白［8-9］.由此，我們推測唾液酸黏附素這種新的功能蛋白也許在致病作用中也發(fā)揮著同樣重要的作用.從它出發(fā)制備疫苗可能為多價疫苗提供新的組分.動物實驗表明，唾液酸黏附素疫苗的根除率為30%，即使未根除的小鼠，其定植密度也有明顯的降低，可用于治療性疫苗候選抗原.未來的疫苗可能是針對自我防護因素、毒力因素、黏附因素等多種因素所構(gòu)成的多價疫苗，唾液酸黏附素可能在其中發(fā)揮重要的作用.

【參考文獻】

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