小鼠IL12基因轉(zhuǎn)染對(duì)人卵巢癌Skov3細(xì)胞的生長(zhǎng)及細(xì)胞因子的表達(dá)

小鼠IL12基因轉(zhuǎn)染對(duì)人卵巢癌Skov3細(xì)胞的生長(zhǎng)及細(xì)胞因子的表達(dá)【摘要】目的：觀察含小鼠IL12全長(zhǎng)基因的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染到Skov3人卵巢癌細(xì)胞中，在脾細(xì)胞存在的情況下對(duì)腫瘤細(xì)胞的影響及相關(guān)細(xì)胞因子的表達(dá).方法：脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染技術(shù)將基因轉(zhuǎn)染至Skov3人卵巢癌細(xì)胞中，ELISA方法檢測(cè)IL12及INFγ的表達(dá)，MTT方法檢測(cè)對(duì)Skov3卵巢癌細(xì)胞增殖的影響.結(jié)果：轉(zhuǎn)染后48h檢測(cè)到IL12的高表達(dá)，約(473±38)ng/L；而未轉(zhuǎn)染組約13~17ng/L，兩者比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義.在脾細(xì)胞作用下產(chǎn)生INFγ，以作用后24h表達(dá)量高，約(173±18)ng/L，較未轉(zhuǎn)染組高，比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜).轉(zhuǎn)染后癌細(xì)胞免疫組化可見IL12表達(dá)，在脾細(xì)胞的作用下，IL12對(duì)Skov3卵巢癌細(xì)胞有抑制其增殖的作用(P＜).結(jié)論：可以將IL12基因轉(zhuǎn)染至Skov3人卵巢癌細(xì)胞中并表達(dá)IL12，脾細(xì)胞檢測(cè)其活性并有相應(yīng)的細(xì)胞因子產(chǎn)生，對(duì)Skov3細(xì)胞有抑制其增殖作用，從而殺傷卵巢癌細(xì)胞，具有抗腫瘤作用.

【關(guān)鍵詞】白細(xì)胞介素12；卵巢腫瘤；基因治療

0引言

腫瘤生物學(xué)治療的許多細(xì)胞因子中IL12是最有效的［1］.它具有明顯的抗原發(fā)和轉(zhuǎn)移瘤的作用，且毒性遠(yuǎn)比IL2低，成為廣大學(xué)者研究的熱點(diǎn)之一.卵巢惡性腫瘤在盆腔內(nèi)生長(zhǎng)，易于轉(zhuǎn)移而廣泛播散，復(fù)發(fā)率、轉(zhuǎn)移率均較高.楊紅等［2］將β葡萄糖醛酸苷酶基因轉(zhuǎn)入卵巢癌細(xì)胞以探索卵巢癌臨床基因治療.我們將含有小鼠IL12全長(zhǎng)基因的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至Skov3人卵巢癌細(xì)胞中，觀察其表達(dá)情況及其相關(guān)細(xì)胞因子的表達(dá)，評(píng)價(jià)其抗腫瘤效果，探討臨床應(yīng)用的可行性.

1材料和方法

材料人卵巢漿液性乳頭狀囊腺癌Skov3細(xì)胞株用含100mL/L小牛血清的RPMI1640(Gibco公司產(chǎn)品)培養(yǎng)液，在37℃，50mL/LCO2條件下培養(yǎng)，隔天換液，細(xì)胞長(zhǎng)滿單層后用g/L胰蛋白酶消化傳代.含有全長(zhǎng)小鼠IL12質(zhì)粒［PCAGGSIL12(kb)［PCAGGSIL12P35TRESIL12P40］的大腸桿菌；成年KM小鼠2只，購(gòu)于黑龍江省腫瘤研究所實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心；脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑盒Roche公司產(chǎn)品.

方法將已經(jīng)轉(zhuǎn)化質(zhì)粒［PCAGGSIL12(kb)［PCAGGSIL12P35TRESIL12P40］的大腸桿菌菌株加入LB培養(yǎng)基5mL中，置于37℃搖床中24h，傳代過(guò)夜，見培養(yǎng)基較渾濁后進(jìn)行提取，-20℃保存并取25μL質(zhì)粒溶液加入蒸餾水1mL中，分光光度計(jì)260，280nm下觀察A值，得到質(zhì)粒的濃度和純度.DNA濃度公式：c(mg/L)=A260nm/;DNA純度公式：A260nm/A280nm.將Skov3細(xì)胞制成單細(xì)胞懸液，以1×106接種于6孔板中.貼壁后，用不含血清和抗生素的RPMI1640培養(yǎng)液洗板3次，將含有質(zhì)粒和脂質(zhì)體的混合液輕輕混勻放置10min后將混合液加入6孔板中，設(shè)無(wú)小鼠IL12基因的空白質(zhì)粒為對(duì)照.置37℃,50mL/LCO2孵箱中培養(yǎng)，6h后更換含100mL/L胎牛血清的培養(yǎng)液，于孵箱中繼續(xù)培養(yǎng)進(jìn)行轉(zhuǎn)染.收獲不同時(shí)間的培養(yǎng)上清按小鼠IL12ELISA試劑盒說(shuō)明建立標(biāo)準(zhǔn)曲線，于轉(zhuǎn)染后24，48，60h檢測(cè)上清IL12表達(dá)水平.以未轉(zhuǎn)染的Skov3為對(duì)照.

取成年KM小鼠脾臟，制備脾細(xì)胞懸液，加RPMI1640培養(yǎng)液3mL混勻培養(yǎng)，稀釋10倍后細(xì)胞記數(shù)器記數(shù)：C=(A+B+C+D)/4×10×104.吸取轉(zhuǎn)染后48h的上清，加入脾細(xì)胞懸液中，培養(yǎng)0，24，48h，分別檢測(cè)INFγ表達(dá)；收集轉(zhuǎn)染后的Skov3卵巢癌細(xì)胞，將脾細(xì)胞懸液加入其中，共同培養(yǎng)24，48h后，收集上清，檢測(cè)INFγ表達(dá).以未轉(zhuǎn)染的Skov3A值為對(duì)照MTT法檢測(cè)Skov3卵巢癌細(xì)胞抑制率=［/A對(duì)照組］×100%

統(tǒng)計(jì)學(xué)處理：全部數(shù)據(jù)經(jīng)統(tǒng)計(jì)軟件SPSS處理，組間比較用方差分析，為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義.

2結(jié)果

質(zhì)粒濃度=μg/L；DNA純度：A260nm/A280nm=轉(zhuǎn)染后Skov3細(xì)胞光鏡下形態(tài)未見明顯變化.

小鼠IL12的表達(dá)轉(zhuǎn)染后24，48及60hIL12表達(dá)水平分別為75±9，473±38，522±32；而未轉(zhuǎn)染組分別為13±4，16±4，17±6.轉(zhuǎn)染后組IL12表達(dá)水平較未轉(zhuǎn)染組明顯增高，48和60h的表達(dá)有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異.

γ的表達(dá)轉(zhuǎn)染后48h上清與脾細(xì)胞懸液共同培養(yǎng)作用0，24，48h，ELISA方法檢測(cè)得INFγ的表達(dá)水平分別為：±，±，±，其中共同作用24hINFγ表達(dá)水平較高；轉(zhuǎn)染48h后Skov3卵巢癌細(xì)胞中加入脾細(xì)胞懸液，共同培養(yǎng)24，48h后，收集上清檢測(cè)INFγ的表達(dá)，測(cè)得INFγ表達(dá)水平分別為：±，±轉(zhuǎn)染后的Skov3卵巢癌細(xì)胞與脾細(xì)胞共同作用24h后可測(cè)得高水平INFγ的表達(dá).提示轉(zhuǎn)染后Skov3的卵巢癌細(xì)胞持續(xù)分泌的IL12能促進(jìn)效應(yīng)細(xì)胞產(chǎn)生持續(xù)高水平的INFγ表達(dá).脾細(xì)胞與轉(zhuǎn)染后Skov3的卵巢癌細(xì)胞共同作用24h后，A490nm為±，與未轉(zhuǎn)染的Skov3卵巢癌細(xì)胞A490nm±比較有差異；與未轉(zhuǎn)染的Skov3+S作用后的A490nm值±比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義.而TSkov3，Skov3，Skov3+S，Skov3組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義.轉(zhuǎn)染后的Skov3卵巢癌細(xì)胞與脾細(xì)胞共同作用24h后，對(duì)卵巢癌的抑制率為%，表明在脾細(xì)胞存在共同作用下小鼠IL12對(duì)Skov3卵巢癌細(xì)胞的增殖有明顯的抑制作用.

3討論

細(xì)胞因子療法是腫瘤生物療法之一.Yamazaki等［3］將含有鼠IL12基因的質(zhì)粒轉(zhuǎn)導(dǎo)到BCG中，發(fā)現(xiàn)能夠檢測(cè)到IL12,INFγ的高表達(dá)并且增加了BCG的腫瘤殺傷效應(yīng).王克敏等［4］將含有小鼠IL12基因與MHCI基因的質(zhì)粒采用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法轉(zhuǎn)染到肝癌細(xì)胞株中，用ELISA方法測(cè)得上清中小鼠IL12表達(dá)為48ng/L.我們以脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染技術(shù)將含有鼠全長(zhǎng)IL12基因的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染到Skov3卵巢癌細(xì)胞中，脂質(zhì)體作為治療基因載體較病毒載體的優(yōu)點(diǎn)是安全、操作簡(jiǎn)單、轉(zhuǎn)染成功率較高,但轉(zhuǎn)染率較低，因此IL12表達(dá)水平不是特別高，較相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道水平低.

INFγ具有較強(qiáng)的抗腫瘤作用［5-6］,能夠抑制腫瘤生長(zhǎng)，并能抑制機(jī)制轉(zhuǎn)移蛋白酶，從而抑制腫瘤轉(zhuǎn)移.IL12通過(guò)誘導(dǎo)INFγ的產(chǎn)生，抑制腫瘤.

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示在部分效應(yīng)細(xì)胞脾細(xì)胞的存在下，小鼠IL12對(duì)卵巢癌細(xì)胞的抑制殺傷作用，并檢測(cè)了相應(yīng)的效應(yīng)因子的表達(dá)，初步探討了其在卵巢癌細(xì)胞中的抗腫瘤作用.由于細(xì)胞因子間相互作用是一個(gè)復(fù)雜的網(wǎng)絡(luò)，本研究中的細(xì)胞因子種類有限，不能全面解釋IL12的抗卵巢癌作用，尚需繼續(xù)完善.

【參考文獻(xiàn)】

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［2］楊紅，辛?xí)匝?，秦衛(wèi)軍.β葡萄糖醛酸苷酶基因轉(zhuǎn)染人卵巢癌細(xì)胞的生物學(xué)特性［J］.第四軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報(bào),2003,24:1575-1577.

［3］YamazakiM,ZhangR,StrausFH,etal.Effectivegenetherapyformedullarythyroidcarcinomausingrecombinantadenovirusinducingtumorspecificexpressionofinterleukin12［J］.GeneTher,2002,9(1):64-74.

［4］王克敏，夏愛娣，陳詩(shī)書.質(zhì)脂體介導(dǎo)Mil12基因與MHCⅠ基因聯(lián)合對(duì)小鼠試驗(yàn)性肝癌的治療作用［J］.癌癥,2002,21:1041-1046.

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