植物表達(dá)載體構(gòu)建與遺傳

關(guān)于植物表達(dá)載體構(gòu)建與遺傳第1頁，講稿共36頁，2023年5月2日，星期三

植物基因工程

植物基因工程以植物為對象，將從不同生物中分離到的基因，經(jīng)酶切連接構(gòu)成重組DNA分子，然后轉(zhuǎn)入受體植物細(xì)胞使新基因在受體細(xì)胞內(nèi)整合、表達(dá)，獲得新的植物類型，再生植株通過無性或有性增殖將外源基因遺傳給后代。

第2頁，講稿共36頁，2023年5月2日，星期三植物基因工程的作用與意義

植物基因工程能順利地在不同物種間進(jìn)行基因轉(zhuǎn)移，因此育種學(xué)家可根據(jù)意愿改造植物的一些性狀，在較短時(shí)間內(nèi)使獲得高產(chǎn)、優(yōu)質(zhì)、抗逆性強(qiáng)的作物新品種成為現(xiàn)實(shí)。

第3頁，講稿共36頁，2023年5月2日，星期三

植物基因工程主要研究內(nèi)容

1)

目的基因的克隆與分離；

2)

植物表達(dá)載體構(gòu)建；

3)

建立適宜的遺傳轉(zhuǎn)化再生體系；

4)

遺傳化即轉(zhuǎn)基因；

5)

轉(zhuǎn)化細(xì)胞或植物的篩選；

6)

轉(zhuǎn)化植株檢測；

7)

轉(zhuǎn)基因植物環(huán)境釋放的安全評價(jià)。

第4頁，講稿共36頁，2023年5月2日，星期三一、植物表達(dá)載體構(gòu)建

第5頁，講稿共36頁，2023年5月2日，星期三

構(gòu)建植物表達(dá)載體的目的

構(gòu)建植物表達(dá)載體的主要目的是將目的基因進(jìn)行修飾改造，使其轉(zhuǎn)入受體植物后的表達(dá)符合目的需要。

第6頁，講稿共36頁，2023年5月2日，星期三

分離獲得的目的基因往往不具有完整的基因結(jié)構(gòu)，而只是表達(dá)產(chǎn)物的可讀框（ORF：openreadingFrame）；還需加上啟動子和終止子。

第7頁，講稿共36頁，2023年5月2日，星期三

如果分離到的目的基因擁有完整的基因結(jié)構(gòu)（即擁有啟動子、表達(dá)產(chǎn)物的開放閱讀框和終止子），因基因的表達(dá)特點(diǎn)不符合要求也需進(jìn)行修飾改造；有些基因例外，如C4光合代謝途徑的一些關(guān)鍵酶基因只能用原基因的所有完整結(jié)構(gòu)才有可能達(dá)到目的。

第8頁，講稿共36頁，2023年5月2日，星期三

啟動子（promoter）

啟動子是位于基因的5’端外測，緊挨轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)一段非編碼的核苷酸序列，它的功能是引導(dǎo)RNA聚合酶同基因的正確部位相結(jié)合；第9頁，講稿共36頁，2023年5月2日，星期三

終止子（terminator）

終止子是在基因3’端下游外測與終止密碼相鄰的一段核苷酸序列，具有轉(zhuǎn)錄終止信號的功能。

第10頁，講稿共36頁，2023年5月2日，星期三一）影響構(gòu)建植物表達(dá)載體的主要因素

1)目的基因的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)；

2)轉(zhuǎn)化受體植物類型與種類；

3)轉(zhuǎn)化方法；

4)轉(zhuǎn)入受體植物的表達(dá)要求；

5)植物表達(dá)載體類型；

6)選擇適宜的啟動子與終止子；

7)選擇性標(biāo)記基因及報(bào)告基因；第11頁，講稿共36頁，2023年5月2日，星期三(二）構(gòu)建植物表達(dá)載體的一些基本知識與實(shí)驗(yàn)技能

從事植物表達(dá)載體構(gòu)建工作主要是進(jìn)行各種質(zhì)粒的提取、純化、酶切、相關(guān)DNA片段的回收、連接、轉(zhuǎn)化與驗(yàn)證等，需要一些分子生物學(xué)相關(guān)的知識和實(shí)驗(yàn)技能。第12頁，講稿共36頁，2023年5月2日，星期三第13頁，講稿共36頁，2023年5月2日，星期三

常用的基本技能：

1)大腸桿菌、農(nóng)桿菌的培養(yǎng)、繼代與保存；

2)大腸桿菌、農(nóng)桿菌中的質(zhì)粒小量提取、大腸桿菌中質(zhì)粒大量提取與純化；

3)各種質(zhì)粒載體的酶切，回收；

4)大腸桿菌與農(nóng)桿菌感受態(tài)細(xì)胞的制備；

5)相關(guān)酶切DNA片段的連接與轉(zhuǎn)化；

6)PCR引物設(shè)計(jì)與檢測。

第14頁，講稿共36頁，2023年5月2日，星期三

進(jìn)行植物表達(dá)載體構(gòu)建時(shí)，根據(jù)所選載體的內(nèi)切酶位點(diǎn)進(jìn)行準(zhǔn)確設(shè)計(jì)是工作的關(guān)鍵；但是這種僅僅基于分子生物學(xué)常識的設(shè)計(jì)不一定能保證成功，還有許多未知因素影響實(shí)驗(yàn)工作，能及時(shí)發(fā)現(xiàn)問題及并進(jìn)行再次的合理設(shè)計(jì)有助于加快工作進(jìn)度。

第15頁，講稿共36頁，2023年5月2日，星期三三）植物表達(dá)載體構(gòu)建實(shí)例

第16頁，講稿共36頁，2023年5月2日，星期三1、質(zhì)粒

構(gòu)建含不同啟動子的植物表達(dá)載體，用到pUCpepc、pSCL0041、pUC19、pBI121四個(gè)不同的質(zhì)粒。

第17頁，講稿共36頁，2023年5月2日，星期三1）pUCpepc:為pUC19克隆載體，經(jīng)XbaI內(nèi)切酶位點(diǎn)插入甘蔗C4Ppc基因，抗性為Amp，由張木清研究員提供。

2）pBI121：植物表達(dá)載體，內(nèi)含gus和nptII基因,啟動子為35S,終止子為nospoly(A)，由本所陳平華博士提供。

第18頁，講稿共36頁，2023年5月2日，星期三3)pUC19:克隆載體，用于構(gòu)建含2x35S啟動子和35Spoly(A)載體，從華美公司購買。

4)pSCL0041植物表達(dá)載體:在左右邊界內(nèi)含有hyg和帶內(nèi)含子的gus基因，且各自帶有35S啟動子和35Spoly(A)、nospoly(A)。外源基因的啟動子為2x35S，終止子為35Spoly(A)

。

第19頁，講稿共36頁，2023年5月2日，星期三2、工具酶

1）限制性內(nèi)切酶;

2）T4DNA連接酶;

3）RNaseA;

4）CAIP;

5)TaqDNA聚合酶

;第20頁，講稿共36頁，2023年5月2日，星期三第21頁，講稿共36頁，2023年5月2日，星期三第22頁，講稿共36頁，2023年5月2日，星期三第23頁，講稿共36頁，2023年5月2日，星期三第24頁，講稿共36頁，2023年5月2日，星期三第25頁，講稿共36頁，2023年5月2日，星期三第26頁，講稿共36頁，2023年5月2日，星期三第27頁，講稿共36頁，2023年5月2日，星期三第28頁，講稿共36頁，2023年5月2日，星期三第29頁，講稿共36頁，2023年5月2日，星期三二、植物遺傳轉(zhuǎn)化研究進(jìn)展

第30頁，講稿共36頁，2023年5月2日，星期三1、遺傳轉(zhuǎn)化效率

轉(zhuǎn)化效率因轉(zhuǎn)化再生體系與之相結(jié)合的轉(zhuǎn)化方法，造成許多作物的轉(zhuǎn)化植株出現(xiàn)嵌合體與育性問題，導(dǎo)致遺傳轉(zhuǎn)化效率比較低。

第31頁，講稿共36頁，2023年5月2日，星期三

從理論上講，一個(gè)好的遺傳轉(zhuǎn)化體系應(yīng)能解決嵌合體及育性問題。即受體再生系統(tǒng)要再生效率高、再生植株可育且不受基因型影響；另外，兩者相互較好地匹配。

第32頁，講稿共36頁，2023年5月2日，星期三

而實(shí)際上，由于多種因素的影響如轉(zhuǎn)化方法要高效、被轉(zhuǎn)化的部位與可轉(zhuǎn)化再生部相同等問題至今仍未能很好解決。

第33頁，講稿共36頁，2023年5月2日，星期三

農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化技術(shù)比較簡單，但轉(zhuǎn)化有基因型依賴、質(zhì)粒與菌株特異性。

第34頁，講稿共36頁，2023年5月2日，星期三