變性梯度凝膠電泳系統(tǒng)介紹

變性梯度凝膠電泳系統(tǒng)介紹變性梯度凝膠電泳法(denaturinggradinentelectrophoresis,DGGE)分析PCR產(chǎn)物，如果突變發(fā)生在最先解鏈的DNA區(qū)域，檢出率可達(dá)100%,檢測(cè)片段可達(dá)1kb,最適圍為100bp-500bp。基本原理基于當(dāng)雙鏈DNA在變性梯度凝膠中進(jìn)行到與DNA變性溫度一致的凝膠位置時(shí)，DNA發(fā)生部分解鏈，電泳遷移率下降，當(dāng)解鏈的DNA鏈中有一個(gè)堿基改變時(shí)，會(huì)在不同的時(shí)間發(fā)生解鏈，因影響電泳速度變化的程度而被分離。由于本法是利用溫度和梯度凝膠遷移率來(lái)檢測(cè)，需要一套專用的電泳裝置，合成的PCR引物最好在5、末端加一段40bp-50bp的GC夾，以利于檢測(cè)發(fā)生于高熔點(diǎn)區(qū)的突變。這個(gè)方法是應(yīng)用最早也是最常用的突變篩查方法之一，在過(guò)去的十年中經(jīng)歷了很大的改進(jìn)。L原理如果DNA雙鏈分子全長(zhǎng)不斷增加溫度或用化學(xué)變性劑處理，兩條鏈就會(huì)開(kāi)始分開(kāi)(解鏈)。首先解鏈的區(qū)域由解鏈溫度較低的堿基組成。GC堿基對(duì)比AT堿基對(duì)結(jié)合得要牢固，因此G.C含量高的區(qū)域具有較高的解鏈溫度。同時(shí)影響解鏈溫度的因素還有相鄰堿基間的吸引力(稱作“堆積”)。解鏈溫度低的區(qū)域，通常位于端部稱作低溫解鏈區(qū)(lowermeltingdomain)。如果端部分開(kāi)，那么雙螺旋就由未解鏈部分束在一起，這一區(qū)域便稱作高溫解鏈(highmeltingdomain)(圖1)。

Ih^tiHiftbng*'Low頑h理(bi如果溫度或變性劑濃度繼續(xù)升高，兩條鏈就會(huì)完全分開(kāi)。變性梯度凝膠電泳法依據(jù)首要的一點(diǎn)是：DNA雙鏈末端一旦解鏈，其在凝膠中的電泳速度將會(huì)極劇下降。Mt'kLulch^ppl^diHf應(yīng)i翎

dtruuurant第二個(gè)根據(jù)是，如果某一區(qū)域首先解鏈，而與其僅有一個(gè)堿基之差的另一條鏈就會(huì)有不同的解鏈溫度，因此將樣品加入含有變性_x第二個(gè)根據(jù)是，如果某一區(qū)域首先解鏈，而與其僅有一個(gè)堿基之差的另一條鏈就會(huì)有不同的解鏈溫度，因此將樣品加入含有變性劑梯度的凝膠進(jìn)行電泳就可將二者分開(kāi)（圖2,1和2道）。最終，如果一雙鏈在其低溫解鏈區(qū)堿基錯(cuò)配（異源雙鏈），而與另一等同的雙鏈相比差別僅在于此，那么，含有錯(cuò)配堿基的雙鏈將在低得多的變性劑濃度下解鏈。事實(shí)上，樣品通常含有突變、正常的同源雙鏈以及配對(duì)的異源雙鏈，后者是在PCR擴(kuò)增加時(shí)產(chǎn)行的。而含有錯(cuò)配的雙鏈（圖2中的3和4道）通?？梢赃h(yuǎn)遠(yuǎn)地與兩個(gè)同源雙鏈（圖2中1和2道）分開(kāi)，這種分離效果使該方法靈敏度很高。為使僅有一個(gè)堿基之差的不同分子取得最好的分離效果，必須先選擇所要研究的DNA范圍以及電泳樣品時(shí)變性劑濃度梯度。這可以按圖2所示的正交變性梯度實(shí)驗(yàn)進(jìn)行經(jīng)驗(yàn)性地解決。變性劑梯度應(yīng)選在曲線斜率大的部分，因?yàn)檫@時(shí)多數(shù)分子處于部分變性狀態(tài)這使得落入低溫解鏈區(qū)的不同分子達(dá)到最佳分離。現(xiàn)在多數(shù)分析是用“GC夾板”（clamp）技術(shù)進(jìn)行的。它是將一段長(zhǎng)度為30-50堿基，富含GC的DNA附加到雙鏈的一端以形成一個(gè)人工高溫解鏈區(qū)。這樣，片段的其他部分就處在低溫解鏈區(qū)從而可以對(duì)其進(jìn)分析。這一技術(shù)使該方法可檢測(cè)的突變比例大大增加，其中許多操作今天已普遍使用。本表僅列出該方法的主要的發(fā)展經(jīng)過(guò)，包括使用異源雙鏈“GC夾板”技術(shù)，PCR及專門(mén)的計(jì)算機(jī)程序等。PCR反應(yīng)技術(shù)的問(wèn)世使非標(biāo)記技術(shù)簡(jiǎn)便了許多。2.DGGE法的優(yōu)缺點(diǎn)優(yōu)點(diǎn)：DGGE的凝膠具有變性劑濃度梯度，可以根據(jù)DNA片段的退火溫度分辨不同片段，分辨率可以達(dá)到一個(gè)堿基DGGE有精密控溫系統(tǒng)，比一般聚丙烯酰胺凝膠電泳具有更高的可重復(fù)性DGGE可以對(duì)環(huán)境樣品DNA的PCR產(chǎn)物進(jìn)行分離進(jìn)而克隆測(cè)序，比一般聚丙烯酰胺凝膠電泳僅僅根據(jù)片段長(zhǎng)短進(jìn)行分離前進(jìn)了一大步。幾乎可以檢出所有突變可將突變分子完好無(wú)損地同野生型分子分開(kāi)用于進(jìn)一步的分析無(wú)須對(duì)引物標(biāo)記可檢測(cè)出象甲基化之類(lèi)的DNA修飾缺點(diǎn)：需要專門(mén)的電泳設(shè)備需要在上游引物前端合成“GC夾板”DGGE的應(yīng)用環(huán)境樣品細(xì)菌、古細(xì)菌、真菌、真核微生物等生物的多樣性分析（土壤、水等樣品，無(wú)需培養(yǎng)，直接提取DNA擴(kuò)增檢測(cè)）；動(dòng)、植物體內(nèi)外共生微生物的檢測(cè)；食品微生物的檢測(cè)；醫(yī)學(xué)領(lǐng)域堿基突變的檢測(cè)，雜合子檢測(cè)等等。變性梯度凝膠電泳系統(tǒng)使用說(shuō)明一、系統(tǒng)儀器組成：電泳控溫槽一臺(tái)、電泳支架兩套（包括玻璃板三副、梳子兩副、夾子16個(gè)）、程控電泳儀一臺(tái)、梯度混合儀（含轉(zhuǎn)子、電源）一套、緩沖液虹吸泵一副。規(guī)格及參數(shù)：1?電泳控溫槽:高溫鋼化玻璃控溫槽：（長(zhǎng)）51cmx（寬）28cmx（高）24cm，總?cè)莘e34L（推薦電泳緩沖液最佳體積21L）。全封閉設(shè)計(jì)，水蒸汽凝結(jié)后會(huì)重新回到槽中，不必補(bǔ)充緩沖液并防止蒸汽擴(kuò)散到實(shí)驗(yàn)室內(nèi)。溫度數(shù)字顯示，加熱器工作、保溫狀態(tài)顯示。加熱器功率1500W,控溫精度：±0.1°C，控溫范圍：室溫至70°C，自動(dòng)過(guò)熱保護(hù)?？烧{(diào)速循環(huán)勻溫水泵，出水口方向及出水量大小可調(diào)。開(kāi)蓋自動(dòng)斷電保護(hù)裝置，開(kāi)蓋后所有電源完全斷開(kāi)，確保安全。開(kāi)蓋后須重新啟動(dòng)電源。儀器可連續(xù)24小時(shí)工作。

2.電泳支架及附件玻璃板：（長(zhǎng)）22cmx（寬）17.7cm。一塊帶有有凹槽，另一塊粘有和梳子同樣厚度有邊條和密封邊條，使用時(shí)將兩塊玻璃對(duì)齊合起，在電泳支架底部放好橡膠條，按圖安裝在支架上，旋緊壓緊螺絲，使玻璃內(nèi)部形成一個(gè)三面密封的槽，灌入去離子水檢查是否有滲漏，不漏可放好待用。梳子標(biāo)準(zhǔn)配置為1mm厚21齒，如需其它規(guī)格可定制。3.電泳儀:功率300W,恒流范圍0-150mA，恒壓范圍0-200V，微腦控制可編程分段定時(shí)定壓。開(kāi)機(jī)后按“轉(zhuǎn)換”鍵，組合“設(shè)時(shí)”“設(shè)分”鍵，可選擇第一時(shí)段或第二時(shí)段的電泳時(shí)間，調(diào)節(jié)旋扭可調(diào)電泳電壓，設(shè)定完成后按啟動(dòng)鍵，秒脈沖顯示燈閃動(dòng)，表示即開(kāi)始工作。時(shí)間顯示為倒計(jì)數(shù)式，兩時(shí)段都減為0后，儀器自動(dòng)關(guān)閉。二、 實(shí)驗(yàn)流程DNA樣品的提取—PCR擴(kuò)增—DGGE電泳—帶型分析—特征條帶的測(cè)序。三、 DGGE過(guò)程1試劑的配制和梯度變性膠的配方40%的凝膠單體（丙烯酰胺/甲叉雙丙烯酰胺：37.5/1）：稱取38.93g丙烯酰胺和1.07g甲叉雙丙烯酰胺，加入去離子水定容至100ml后用0.45pm的濾膜過(guò)濾后裝入棕色瓶4°C保存。100%變性劑：取42ml去離子甲酰胺、42g尿素，用去離子水定容至100ml后用0.45pm的濾膜過(guò)濾后裝入棕色瓶4°C保存。50XTAE緩沖液（Tris2mol/L，冰醋酸1mol/L，EDTA50mmol/L，pH8.0）10%過(guò)硫酸銨溶液（W/V，為保證良好的引發(fā)效果，建議現(xiàn)配現(xiàn)用）TEMED（分析純）梯度變性膠的配方（濃度為8%的變性膠）

---組:份一---__ 變性劑濃度 —60%50%25%0%凝膠單體2.8mL2.8mL2.8mL0.8mL100%變性劑8.4mL7mL3.5mL050XTAE0.28mL0.28mL0.28mL0.08mL雙蒸水2.52mL3.92mL7.42mL3.12mL除引發(fā)劑和催化劑外的總體積14mL14mL14mL4mL灌膠前加入引發(fā)劑：10%過(guò)硫酸銨60|iL60|iL60|iL25|iL灌膠前加入催化劑：TEMED8四L60|iL60|iL5四L梯度變性膠的配方（濃度為6%的變性膠）組份-度 —變性劑濃60%50%25%0%凝膠單體2.1mL2.1mL2.1mL0.6mL100%變性劑8.4mL7mL3.5mL050XTAE0.28mL0.28mL0.28mL0.08mL雙蒸水3.22mL4.62mL8.12mL3.32mL除引發(fā)劑和催化劑外的總體積14mL14mL14mL4mL灌膠前加入引發(fā)劑：10%過(guò)硫酸銨60|iL60|iL60|iL25|iL灌膠前加入催化劑：TEMED8四L60|iL60|iL5四L2梯度變性膠的制作和變性梯度凝膠電泳2.1將兩塊玻璃對(duì)齊放入電泳支架上（帶缺口的玻璃缺口朝上并位于內(nèi)側(cè)），旋緊固定螺絲并夾好夾子。注入去離子水，檢測(cè)是否漏水后倒出去離子水。2.2配制高變性劑濃度凝膠溶液和低變性劑濃度凝膠溶液，在灌膠前加入適量的10%過(guò)硫酸銨溶液和TEMED作為聚合引發(fā)劑和催化劑并充分混勻（膠濃度根據(jù)PCR產(chǎn)物片段長(zhǎng)度選定，一般150-400bp的選用8%的膠，400bp以上的選用6%的膠；變性劑濃度范圍根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道并針對(duì)具體樣品做適當(dāng)調(diào)整，使最終條帶位于變性膠中部。引發(fā)劑和催化劑的具體用量可以根據(jù)氣溫以及實(shí)驗(yàn)人對(duì)聚合速度的要求進(jìn)行調(diào)整，表格中列出的是建議用量）。關(guān)閉梯度混合儀的兩個(gè)閥門(mén)，將高濃度變性劑凝膠溶液加入梯度混合儀靠近出口的一端，將低濃度變性劑凝膠溶液加入另一端，并打開(kāi)磁力攪拌器。2.3先打開(kāi)梯度混合儀出口端閥門(mén)，待液流穩(wěn)定無(wú)氣泡時(shí)將針頭插入兩塊玻璃縫隙中部，接著打開(kāi)梯度混合儀中間閥門(mén)開(kāi)始灌膠。2.4待凝膠灌至距上端1.5cm處時(shí)停止灌膠，加入1mL去離子水液封膠面，待凝膠聚合后，配制不含變性劑的0%凝膠（別忘記加引發(fā)劑和催化劑），用移液器灌膠，插好梳子，待凝膠完全聚合。2.5拔出梳子，將電泳支架放入恒溫電泳槽（已裝入1XTAE緩沖液21L，溫度設(shè)置為60°C，插上電極和緩沖液循環(huán)管，將各個(gè)PCR產(chǎn)物與Loadingbuffer混勻（選用普通的核酸瓊脂糖電泳的10xLoadingbuffer），然后用微量上樣器吸取樣品并