熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)(共3篇)

1/1熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)(共3篇)熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)第1篇轉(zhuǎn)錄因子的DNA結(jié)合域和順式作用元件實(shí)現(xiàn)共價(jià)結(jié)合，從而對(duì)基因的表達(dá)起抑制或增強(qiáng)的調(diào)控作用。熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)就是檢測(cè)轉(zhuǎn)錄因子與目的基因啟動(dòng)子區(qū)DNA相互作用的一種檢測(cè)方法。

熒光素酶（Luciferase）：是能夠催化底物氧化發(fā)光的一類酶的統(tǒng)稱。

熒光素酶的種類很多，其中應(yīng)用較為廣泛的是螢火蟲熒光素酶（Fireflyluciferase，F(xiàn)LUC）和海腎熒光素酶（Renillaluciferase，RLUC）

在ATP、Mg2+、O2存在的條件下，蟲熒光素在蟲熒光素酶的催化下氧化發(fā)光，發(fā)光顏色為黃綠色。

Luciferase報(bào)告基因系統(tǒng)是以熒光素（luciferin）為底物來檢測(cè)螢火蟲熒光素酶（fireflyluciferase）活性的一種報(bào)告系統(tǒng)。熒光素酶可以催化luciferin被氧化成oxyluciferin的反應(yīng)，在luciferin被氧化的過程中會(huì)發(fā)出生物熒光，然后可以通過儀器測(cè)定luciferin氧化過程中釋放的生物熒光。

例如，我們想要研究某個(gè)轉(zhuǎn)錄因子是否能與某一靶啟動(dòng)子片段有作用。

（1）在質(zhì)粒中，將靶啟動(dòng)子（或其他要研究的基因調(diào)控元件）插入到熒光素酶報(bào)告基因前方，構(gòu)建成報(bào)告基因質(zhì)粒。

（2）將可以表達(dá)要檢測(cè)的轉(zhuǎn)錄因子的質(zhì)粒與報(bào)告基因質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染細(xì)胞，如果此轉(zhuǎn)錄因子能夠激活靶啟動(dòng)子，則熒光素酶基因就會(huì)表達(dá)，熒光素酶的表達(dá)量與轉(zhuǎn)錄因子的作用強(qiáng)度成正比。

（3）加入特定的熒光素酶底物，熒光素酶與底物反應(yīng)，產(chǎn)生熒光，通過檢測(cè)熒光的強(qiáng)度可以測(cè)定熒光素酶的活性，從而判斷轉(zhuǎn)錄因子是否能與此靶啟動(dòng)子片段有作用。

同時(shí)，為了減少內(nèi)在的變化因素（如：培養(yǎng)細(xì)胞的數(shù)目和活力的差別，細(xì)胞轉(zhuǎn)染和裂解的效率等)對(duì)實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)確性的影響，將帶有海腎熒光素酶基因(Rinillaluciferase的質(zhì)粒(pRL-TK)作為對(duì)照質(zhì)粒與報(bào)告基因質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染細(xì)胞，提供轉(zhuǎn)錄活力的內(nèi)對(duì)照，使測(cè)試結(jié)果不受實(shí)驗(yàn)條件變化的干擾。

在測(cè)量過程中，當(dāng)加入熒光素酶檢測(cè)試劑Ⅱ(LARII)時(shí)產(chǎn)生螢火蟲熒光信號(hào)，這樣先測(cè)量螢火蟲熒光素酶報(bào)告基因。定量螢火蟲熒光強(qiáng)度之后，再在同一樣品中加入Stop&Glo?試劑，將上述反應(yīng)淬滅，并同時(shí)啟動(dòng)海腎熒光素酶反應(yīng)，同時(shí)進(jìn)行第二次測(cè)量

熒光素酶報(bào)告基因的優(yōu)點(diǎn)

◆蛋白不需要翻譯后加工，所以一旦翻譯立即產(chǎn)生報(bào)告活性。

◆在所有的化學(xué)發(fā)光反應(yīng)中，它的光產(chǎn)物具有最高的量子效率，因而非常靈敏。另外，在宿主細(xì)胞及檢測(cè)試劑中均檢測(cè)不到背景發(fā)光。

◆高效，檢測(cè)快速，每個(gè)樣品只需幾秒鐘。

熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)第2篇熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)是以熒光素（luciferin）為底物來檢測(cè)螢火蟲熒光素酶（FireflyLuciferase）活性的一種報(bào)告系統(tǒng)。熒光素酶可以催化luciferin氧化成oxyluciferin，在luciferin氧化的過程中，會(huì)發(fā)出生物熒光（bioluminescence），可通過熒光測(cè)定儀設(shè)備測(cè)定luciferin氧化過程中釋放的生物熒光，常應(yīng)用于miRNA靶基因驗(yàn)證及啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄活性調(diào)控等方向研究。

利用熒光素酶與底物結(jié)合發(fā)生化學(xué)發(fā)光反應(yīng)的特性，把感興趣的基因轉(zhuǎn)錄的調(diào)控元件克隆在螢火蟲熒光素酶基因的上/下游，構(gòu)建成熒光素酶報(bào)告質(zhì)粒。然后轉(zhuǎn)染細(xì)胞，適當(dāng)刺激或處理后裂解細(xì)胞，測(cè)定熒光素酶活性。通過熒光素酶活性的高低判斷刺激前后或不同刺激對(duì)感興趣的調(diào)控元件的影響。

雙熒光素酶通常是指螢火蟲熒光素酶和海腎熒光素酶。螢火蟲熒光素酶是從甲蟲（Photinuspyralis）中分離得到，分子量為61kDa；海腎熒光素酶（RenillaLuciferase）則是從海腎（Renillareniformis）中分離，分子量為36kDa。

熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)第3篇·Day1種細(xì)胞于24孔板

·Day2病毒感染（根據(jù)實(shí)驗(yàn)加入一定量的miRNA-Ctrl/miRNA-OE）

·Day3Report質(zhì)粒轉(zhuǎn)染（以24孔板一個(gè)孔為例，實(shí)驗(yàn)時(shí)可配置成Mix逐孔加入以減少誤差）:

25ulopti-MEM+300ngplasmid+10ngpRL-CMV

25ulopti-MEM+lip20XX

6h后換液

（實(shí)驗(yàn)分組可參考下圖，每個(gè)組可以設(shè)置3個(gè)重復(fù)孔）

·Day4雙報(bào)告基因檢測(cè)

（1）1XcoldPBS清洗一遍，加入80-100ullysisbuffer（buffer用量可以根據(jù)細(xì)胞量進(jìn)行調(diào)整）；

（2）在搖床上冰上被動(dòng)裂解30min；

（3）4℃，120XXrpm離心10min；

（4）吸取上清10ul于luciferase專用96孔板；

（5）依次加入50ulFir