重組體的選擇與鑒定課件

關(guān)于重組體的選擇與鑒定第1頁，講稿共29頁，2023年5月2日，星期三何為重組體？轉(zhuǎn)化子：在DNA分子克隆中，通常將導(dǎo)入外源DNA分子后能穩(wěn)定存在的受體細(xì)胞稱為轉(zhuǎn)化子；重組體：含有重組DNA分子的轉(zhuǎn)化子；目的重組體：含有外源目的基因的重組體。第2頁，講稿共29頁，2023年5月2日，星期三為什么要對重組子進行選擇與鑒定在轉(zhuǎn)化反應(yīng)中,并非所有的細(xì)胞中都轉(zhuǎn)入重組DNA分子,即使所有的受體細(xì)胞都變?yōu)檗D(zhuǎn)化體,所獲得的轉(zhuǎn)化子仍是多種類型的DNA分子,因為在連接反應(yīng)中會有以下幾種情況發(fā)生:載體和一個或數(shù)個串聯(lián)目的基因連接載體發(fā)生自連目的DNA分子發(fā)生自連未發(fā)生連接反應(yīng)的載體和目的DNA片段第3頁，講稿共29頁，2023年5月2日，星期三為什么要對重組子進行選擇與鑒定因此,在成千上萬個轉(zhuǎn)化子中，真正含有期望的重組DNA分子的比例很少，為了將含有外源DNA的宿主細(xì)胞和不含外源DNA的宿主細(xì)胞分開，以及將含有正確重組子的宿主細(xì)胞和含有其他外源DNA的宿主細(xì)胞分開，就需要設(shè)計出最易于篩選重組子的方案并加以驗證。第4頁，講稿共29頁，2023年5月2日，星期三常用的選擇方法第5頁，講稿共29頁，2023年5月2日，星期三直接選擇法第6頁，講稿共29頁，2023年5月2日，星期三遺傳學(xué)表型篩選方法一—抗藥性篩選分類：（1）抗藥性基因不失活（2）抗藥性基因失活常用的抗藥性選擇標(biāo)記：氨芐青霉素（Amp）、氯霉素（Cm）

卡那霉素（Kan）、四環(huán)素（Tet或Tc）

鏈霉素（Sm或Str）第7頁，講稿共29頁，2023年5月2日，星期三抗藥性基因不失活基本原理：外源基因片段插入載體的位點在抗藥性基之外，不導(dǎo)致抗藥性基因的失活，仍能編碼抗藥性基因產(chǎn)物。含有這種重組子的轉(zhuǎn)化細(xì)胞可以在含有相應(yīng)抗生素的瓊脂平板上生長成菌落，未能接受載體DNA的細(xì)胞因不能生長而被排除。第8頁，講稿共29頁，2023年5月2日，星期三抗藥性基因不失活實驗步驟：（1）培養(yǎng)基中加入千分之一的抗性藥物，再倒平板；（2）將轉(zhuǎn)化后的菌液均勻涂布在平板上；（3）放在37℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)12~16小時；（4）觀察菌落生長情況。第9頁，講稿共29頁，2023年5月2日，星期三抗藥性基因不失活第10頁，講稿共29頁，2023年5月2日，星期三抗藥性基因失活基本原理：如果外源基因片段插入載體的位點在抗藥性基因中間，導(dǎo)致抗藥性基因失活，這個抗藥性標(biāo)志就會失活。檢測外源DNA插入作用的一種通用的方法是插入失活效應(yīng)。第11頁，講稿共29頁，2023年5月2日，星期三抗藥性基因失活例如：非重組的pBR322質(zhì)粒DNA上的四環(huán)素和氨芐青霉素抗性基因都是正常的。帶有這種質(zhì)粒的受體菌可以在加有四環(huán)素和氨芐青霉素的雙抗性平板上生長。但是,如果在該質(zhì)粒的氨芐青霉素抗性基因內(nèi)插入外源片段,就會造成氨芐青霉素抗性基因失活,攜帶這種質(zhì)粒的宿主菌可以在四環(huán)素的平板上生長,而不能在氨芐青霉素抗性平板上生長。第12頁，講稿共29頁，2023年5月2日，星期三抗藥性基因失活第13頁，講稿共29頁，2023年5月2日，星期三抗藥性基因失活注意事項：（1）以Amp、Tc等抗生素作為選擇藥物時，37℃培養(yǎng)時間約12~16h，超過時間視為雜菌（假轉(zhuǎn)化子菌落）。（2）挑選單菌落作為轉(zhuǎn)化子以便進一步實驗驗證。挑的菌落在培養(yǎng)基中震蕩培養(yǎng)。第14頁，講稿共29頁，2023年5月2日，星期三遺傳學(xué)表型篩選方法二

β-半乳糖苷酶顯色法基本原理：許多質(zhì)粒載體具有β-半乳糖苷酶顯色反應(yīng)的檢測功能。

當(dāng)外源DNA插入到它的lacZ基因（編碼β-半乳糖苷酶）上時，可造成β-半乳糖苷酶的失活，就可通過大腸桿菌轉(zhuǎn)化子菌落在添加X-gal-IPTG培養(yǎng)基中的顏色變化鑒別出重組子和非重組子。（X-gal是β-半乳糖苷酶的顯色底物）第15頁，講稿共29頁，2023年5月2日，星期三遺傳學(xué)表型篩選方法二

β-半乳糖苷酶顯色法

舉例：pUC質(zhì)粒：帶有β-半乳糖苷酶基因（lacZ）的調(diào)控序列和β-半乳糖苷酶N端146個氨基酸的編碼序列。這個編碼區(qū)中插入了一個多種限制性核酸酶單一識別位點的多克隆位點，但并沒有破壞lacZ的閱讀框架。大腸桿菌菌株：帶有β-半乳糖苷酶C端部分序列的編碼信息。在各自獨立的情況下，pUC質(zhì)粒和大腸桿菌編碼的β-半乳糖苷酶片段都沒有活性。第16頁，講稿共29頁，2023年5月2日，星期三

遺傳學(xué)表型篩選方法二

β-半乳糖苷酶顯色法當(dāng)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌后,可形成具有酶活性的蛋白質(zhì),它在生色底物X-gal的存在下被IPTG(異丙基-β-D-硫代半乳糖苷）誘導(dǎo)形成藍色菌落。當(dāng)外源片段插入到pUC質(zhì)粒的多克隆位點上后，則會導(dǎo)致讀碼框架改變，表達蛋白失活，因此，在同樣條件下含重組質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化子在生色誘導(dǎo)培養(yǎng)基上只能形成白色菌落。因此，根據(jù)這種β-半乳糖苷酶的顯色反應(yīng)，可將重組質(zhì)粒與自身環(huán)化的載體DNA分開。第17頁，講稿共29頁，2023年5月2日，星期三遺傳學(xué)表型篩選方法二

β-半乳糖苷酶顯色法第18頁，講稿共29頁，2023年5月2日，星期三遺傳學(xué)表型篩選方法二

β-半乳糖苷酶顯色法注意事項：（1）由于被轉(zhuǎn)化的基因產(chǎn)物作用于X-gal需要較長時間，因此，觀察和確定轉(zhuǎn)化子菌落的培養(yǎng)時間可適當(dāng)延長。與37℃溫箱取出后放4℃冰箱幾小時后觀察效果更好；（2）為了防止假陽性需挑菌進一步驗證。第19頁，講稿共29頁，2023年5月2日，星期三間接選擇法第20頁，講稿共29頁，2023年5月2日，星期三依賴于重組子結(jié)構(gòu)特征分析的篩選法之一快速裂解菌落鑒定分子大小基本原理：由于外源片段插入的重組質(zhì)粒與載體大小不同，故可以利用瓊脂糖凝膠電泳將重組體分離出來。第21頁，講稿共29頁，2023年5月2日，星期三依賴于重組子結(jié)構(gòu)特征分析的篩選法之一

快速裂解菌落鑒定分子大小優(yōu)點：直觀快捷，適用于插入片段較大的重組子的篩選。缺點：不能鑒別插入片段大小相近的非目的基因片段。第22頁，講稿共29頁，2023年5月2日，星期三依賴于重組子結(jié)構(gòu)特征分析的篩選方法二

——限制性內(nèi)切酶酶切法基本原理：根據(jù)已知的外源DNA序列的限制酶切圖譜，選擇一兩種內(nèi)切酶切割質(zhì)粒，電泳后比較電泳結(jié)果（DNA的帶數(shù)和長度）?；蛴煤线m的內(nèi)切酶酶切插入片段，再用其它酶酶切這個片段，電泳后比較電泳結(jié)果是否符合預(yù)計的結(jié)果。第23頁，講稿共29頁，2023年5月2日，星期三依賴于重組子結(jié)構(gòu)特征分析的篩選方法二

——限制性內(nèi)切酶酶切法第24頁，講稿共29頁，2023年5月2日，星期三依賴于重組子結(jié)構(gòu)特征分析的篩選方法三

PCR法基本原理：在載體DNA分子中，外源DNA插入位點兩側(cè)的序列多為已知，通過與插入位點兩側(cè)已知序列互補的引物，從單克隆中提取少量質(zhì)粒DNA作為模板進行PCR擴增，瓊脂糖凝膠電泳分析確定是否為重組子。第25頁，講稿共29頁，2023年5月2日，星期三依賴于重組子結(jié)構(gòu)特征分析的篩選方法三

PCR法注意事項：如需檢測插入片段及其方向，則使用載體特異引物和方向插入特異引物或互換。如只需確認(rèn)是否存在插入片段，可用2個插入片段特異引物。

擴增反應(yīng)前在94℃變性兩分鐘，有利于細(xì)菌的裂解，提高PCR產(chǎn)物擴增的成功。第26頁，講稿共29頁，2023年5月2日，星期三依賴于重組子結(jié)構(gòu)特征分析的篩選方法四

菌落雜交篩選主要原理

用體外標(biāo)記基因DNA或相應(yīng)的RNA為探針同轉(zhuǎn)化后的菌落進行原位雜交，篩選含重組DNA的克隆。這個方法可以快速地從數(shù)百個菌落中挑選出含有重組DNA的克隆。該方法的優(yōu)點是通用性比較強，可以用來檢測任何一種插入的DNA序列。這種方法依據(jù)的是核酸分子雜交的原理，而不以插入的DNA序列能否實現(xiàn)基因表達為前提，因此，只要有可利用的標(biāo)記探針就可檢測出重組質(zhì)粒DNA。第27頁，講稿共29頁，2023年5月2日，星期三總