色譜分析導(dǎo)論

*1第六章

色譜分析導(dǎo)論

Introductionto

chromatographanalysis

*2§6-1色譜法概述Generalizationofchromatographanalysis§6-2色譜理論根底Fundamentalofchromatographtheory*3第一節(jié)色譜法概述一、色譜法的特點、分類和作用characteristic,classificationactuationofchromatograph二、氣相色譜別離過程separationprocessofgaschromatograph三、色譜流出曲線與根本術(shù)語Chromatogramandnamewords

generalizationofchromatographanalysis

*4一、色譜法的特點、分類和作用

1.概述混合物最有效的別離、分析方法。俄國植物學(xué)家茨維特〔Tswett)在1906年使用的裝置：色譜原型裝置，如圖。色譜法是一種別離技術(shù)。試樣混合物的別離過程也就是試樣中各組分在稱之為色譜別離柱中的兩相間不斷進(jìn)行著的分配過程。其中的一相固定不動，稱為固定相；另一相是攜帶試樣混合物流過此固定相的流體〔氣體或液體〕，稱為流動相。*5色譜法原理

當(dāng)流動相中攜帶的混合物流經(jīng)固定相時，其與固定相發(fā)生相互作用。由于混合物中各組分在性質(zhì)和結(jié)構(gòu)上的差異，與固定相之間產(chǎn)生的作用力的大小、強弱不同，隨著流動相的移動，混合物在兩相間經(jīng)過反復(fù)屢次的分配平衡，使得各組分被固定相保存的時間不同，從而按一定次序從色譜柱中流出。與適當(dāng)?shù)闹髾z測方法結(jié)合，實現(xiàn)混合物中各組分的別離與檢測。兩相及兩相的相對運動構(gòu)成了色譜法的根底*62.色譜法分類

按流動相的狀態(tài)不同主要分為兩類：(1)氣相色譜：流動相為氣體〔稱為載氣〕。按別離柱不同可分為：填充柱色譜和毛細(xì)管柱色譜；按固定相的不同又分為：氣固色譜和氣液色譜*7(2)液相色譜：流動相為液體〔也稱為淋洗液〕。按固定相的不同分為：液固色譜和液液色譜。離子色譜：液相色譜的一種，以特制的離子交換樹脂為固定相，不同pH值的水溶液為流動相。*8(3)其他色譜方法薄層色譜和紙色譜：比較簡單的色譜方法凝膠色譜法：測聚合物分子量分布。超臨界色譜:CO2流動相。高效毛細(xì)管電泳:九十年代快速開展、特別適合生物試樣分析別離的高效分析儀器。*93.色譜法的特點〔1〕別離效率高復(fù)雜混合物，有機(jī)同系物、異構(gòu)體。手性異構(gòu)體?！?〕靈敏度高可以檢測出μg.g-1(10-6)級甚至ng.g-1(10-9)級的物質(zhì)量?！?〕分析速度快一般在幾分鐘或幾十分鐘內(nèi)可以完成一個試樣的分析。〔4〕應(yīng)用范圍廣氣相色譜：沸點低于400℃的各種有機(jī)或無機(jī)試樣的分析。液相色譜：高沸點、熱不穩(wěn)定、生物試樣的別離分析。缺乏之處：被別離組分的定性較為困難。*10二、色譜別離過程色譜別離過程是在色譜柱內(nèi)完成的。以氣相色譜為例。氣固(液固)色譜和氣液(液液)色譜，兩者的別離機(jī)理不同。氣固(液固)色譜的固定相:多孔性的固體吸附劑顆粒。固體吸附劑對試樣中各組分的吸附能力的不同。氣液(液液)色譜的固定相:由擔(dān)體和固定液所組成。固定液對試樣中各組分的溶解能力的不同。氣固色譜的別離機(jī)理:吸附與脫附的不斷重復(fù)過程；氣液色譜的別離機(jī)理：溶解與揮發(fā)的反復(fù)屢次分配過程。*11氣相色譜別離過程當(dāng)試樣由載氣攜帶進(jìn)入色譜柱與固定相接觸時，被固定相溶解或吸附;隨著載氣的不斷通入，被溶解或吸附的組分又從固定相中揮發(fā)或脫附;揮發(fā)或脫附下的組分隨著載氣向前移動時又再次被固定相溶解或吸附;隨著載氣的流動，溶解、揮發(fā)，或吸附、脫附的過程反復(fù)地進(jìn)行。*12三、色譜流出曲線與術(shù)語1.基線

無試樣通過檢測器時，檢測到的信號即為基線。2.色譜峰當(dāng)某組分從色譜柱流出時，檢測器對該組分的響應(yīng)信號隨時間變化所形成的峰形曲線稱為該組分的色譜峰。3.峰高(h)色譜峰頂?shù)交€的垂直距離。*134.保存值表示試樣中各組分在色譜柱中滯留時間的數(shù)值。〔1〕時間表示的保存值保存時間〔tR〕：組分從進(jìn)樣到柱后出現(xiàn)濃度極大值〔即色譜峰頂值〕時所需的時間；〔動畫〕調(diào)整保存時間〔tR＇〕：tR＇=tR－t0死時間〔t0〕：不與固定相作用的氣體〔如空氣〕的保存時間；*14〔2〕用體積表示的保存值保存體積〔VR〕：VR=tR×F0F0為柱出口處的載氣流量，單位：mL/min。死體積〔V0〕：V0=t0×F0調(diào)整保存體積(VR＇)：VR＇=VR－V0〔動畫〕*155.相對保存值r2，1組分2與組分1調(diào)整保存值之比：r2，1=t′R2/t′R1=V′R2/V′R1相對保存值只與柱溫和固定相性質(zhì)有關(guān)，與其他色譜操作條件無關(guān)，它表示了固定相對這兩種組分的選擇性。所以又稱為選擇因子。*166.區(qū)域?qū)挾扔脕砗饬可V峰寬度的參數(shù)，有三種表示方法：〔1〕標(biāo)準(zhǔn)偏差()：即0.607倍峰高處色譜峰寬度的一半。〔2〕半峰寬(W1/2)：色譜峰高一半處的寬度W1/2=2.354〔3〕峰底寬(Wb)：Wb=4*177.色譜流出曲線的數(shù)學(xué)描述

色譜峰為正態(tài)分布時，色譜流出曲線上的濃度與時間的關(guān)系為：

當(dāng)色譜峰為非正態(tài)分布時，可按正態(tài)分布函數(shù)加指數(shù)衰減函數(shù)構(gòu)建關(guān)系式。*18色譜流出曲線的意義由色譜流出曲線可以實現(xiàn)以下目的：〔1〕根據(jù)色譜峰的數(shù)目，可以判斷試樣中所含組分的最少個數(shù)?！?〕根據(jù)色譜峰的保存值進(jìn)行定性分析?！?〕依據(jù)色譜峰的面積或峰高進(jìn)行定量分析?！?〕依據(jù)色譜峰的保存值以及峰寬評價色譜柱的別離效能。*19選擇內(nèi)容：第一節(jié)色譜法概述generalizationofchromatographanalysis第二節(jié)色譜理論根底fundamentalofchromatographtheory結(jié)束*20第二節(jié)色譜理論根底一、塔板理論platetheory二、速率理論ratetheory三、別離度resolutionfundamentalofchromatographtheory

*21一、塔板理論

〔一〕分配過程

1.分配系數(shù)〔partionfactor〕K組分在固定相和流動相間發(fā)生的吸附、脫附，或溶解、揮發(fā)的過程叫做分配過程。在一定溫度下，組分在兩相間分配到達(dá)平衡時的濃度〔單位：g/mL〕比，稱為分配系數(shù)，用K表示，即：分配系數(shù)是色譜別離的依據(jù)。*22分配系數(shù)K的討論一定溫度下，組分的分配系數(shù)K越大，出峰越慢；試樣一定時，K主要取決于固定相性質(zhì)；同一個組份在不同的固定相上的分配系數(shù)K不同；選擇適宜的固定相可改善別離效果；試樣中的各組分具有不同的K值是別離的根底；某組分的K=0時，即不被固定相保存，最先流出。*232.分配比〔partionradio〕k在實際工作中，也常用分配比來表征色譜分配平衡過程。分配比是指，在一定溫度下，組分在兩相間分配到達(dá)平衡時的質(zhì)量比：1.分配系數(shù)與分配比都是與組分及固定相的熱力學(xué)性質(zhì)有關(guān)的常數(shù)，隨別離柱溫度、柱壓的改變而變化。2.分配系數(shù)與分配比都是衡量色譜柱對組分保存能力的參數(shù)，數(shù)值越大，該組分的保存時間越長。3.分配比可以由實驗測得。分配比也稱：

容量因子(capacityfactor)；容量比(capacityfactor)；*24〔1〕容量因子與分配系數(shù)的關(guān)系式中β為相比，即β=Vm/Vs。填充柱相比：6～35；毛細(xì)管柱的相比：50～1500。容量因子越大，保存時間越長。VM為流動相體積，即柱內(nèi)固定相顆粒間的空隙體積；VS為固定相體積，對不同類型色譜柱，VS的含義不同:氣-液色譜柱：VS為固定液體積；氣-固色譜柱：VS為吸附劑外表容量；*25〔2〕分配比與保存時間的關(guān)系某組分的k值可由實驗測得，等于該組分的調(diào)整保存時間與死時間的比值：〔3〕分配系數(shù)K及分配比k與選擇因子r2,1的關(guān)系如果兩組分的K或k值相等，那么r2,1=1，兩組分的色譜峰必將重合，說明分不開。兩組分的K或k值相差越大，那么別離得越好。因此兩組分具有不同的分配系數(shù)是色譜別離的先決條件。*26根本保存方程可表示為：tR=t0(1+k)假設(shè)載氣流量F0恒定，也可用保存體積表示，那么VR=Vm+KVs這就是色譜根本保存方程。上式說明，色譜柱確定后，Vm和Vs即為定值。由此可見，分配系數(shù)不同的各組分具有不同的保存值，因而在色譜圖上有不同位置的色譜峰?！?〕根本保存方程*27例：用一根固定相的體積為0.148mL，流動相的體積為1.26mL的色譜柱別離A,B兩個組分，它們的保存時間分別為14.4min，15.4min，不被保存組分的保存時間為4.2min，試計算：

〔1〕各組分的容量因子

〔2〕各組分的分配系數(shù)

〔3〕AB兩組分的選擇因子rB,A解：〔1〕kA=(14.4min-4.2min)/4.2min=2.43kB=(15.4min-4.2min)/4.2min=2.67K=kβ=kVm/VsKA=kAVm/Vs=2.43×1.26mL/0.148mL=20.7KB=kBVm/Vs=2.67×1.26mL/0.148mL=22.7(3)rB,A=KB/KA=22.7/20.7=1.10*28色譜理論色譜理論需要解決的問題：色譜別離過程的熱力學(xué)和動力學(xué)問題。影響別離及柱效的因素與提高柱效的途徑，柱效與別離度的評價指標(biāo)及其關(guān)系。組分保存時間為何不同？色譜峰為何變寬？組分保存時間：色譜過程的熱力學(xué)因素控制；〔組分和固定相的結(jié)構(gòu)和性質(zhì),如分配系數(shù)〕色譜峰變寬：色譜過程的動力學(xué)因素控制；〔兩相中的運動阻力，擴(kuò)散〕兩種色譜理論：塔板理論和速率理論；*29塔板理論的假設(shè)：(1)在每一個平衡過程間隔內(nèi)，平衡可以迅速到達(dá)；這一小段間隔的柱長稱為理論塔板高度。(2)將載氣看作成脈動〔間歇〕過程；(3)試樣沿色譜柱方向的擴(kuò)散可忽略；(4)每次分配的分配系數(shù)相同。〔二〕塔板理論-柱別離效能指標(biāo)1.塔板理論〔platetheory〕半經(jīng)驗理論；將色譜別離過程比較作蒸餾過程，將連續(xù)的色譜別離過程分割成屢次的平衡過程的重復(fù)〔類似于蒸餾塔塔板上的平衡過程〕；在每一個塔板上，被別離組分到達(dá)一次分配平衡?！矂赢嫛?30色譜柱長：L，虛擬的塔板間距離〔理論塔板高度〕：H，色譜柱的理論塔板數(shù)：n，那么三者的關(guān)系為：n=L/H理論塔板數(shù)與色譜參數(shù)之間的關(guān)系為：保存時間包含死時間，在死時間內(nèi)不參與分配!單位柱長的塔板數(shù)越多，說明柱效越高。用不同物質(zhì)計算可得到不同的理論塔板數(shù)。*312.有效塔板數(shù)和有效塔板高度組分在t0時間內(nèi)不參與柱內(nèi)分配。需引入有效塔板數(shù)和有效塔板高度：*32例：用一根柱長為1m的色譜柱別離含有A，B，C，D四個組分的混合物，它們的保存時間tR分別為6.4min,14.4min,15.4min,20.7min,其峰底寬Wb分別為0.45min,1.07min,1.16min,1.45min。

試計算：各譜峰的理論塔板數(shù)。解：*333.塔板理論的特點和缺乏(1)當(dāng)色譜柱長度一定時，塔板數(shù)n越大(塔板高度H越小)，被測組分在柱內(nèi)被分配的次數(shù)越多，柱效能那么越高，即使分配系數(shù)只有微小的差異，仍可獲得好的別離效果。所得色譜峰越窄。

(2)不同物質(zhì)在同一色譜柱上的分配系數(shù)不同，用有效塔板數(shù)和有效塔板高度作為衡量柱效能的指標(biāo)時，應(yīng)指明測定物質(zhì)。(3)柱效不能表示被別離組分的實際別離效果，當(dāng)兩組分的分配系數(shù)K相同時，無論該色譜柱的塔板數(shù)多大，都無法別離。(4)塔板理論無法解釋同一色譜柱在不同的載氣流速下柱效不同的實驗結(jié)果，也無法指出影響柱效〔如塔板高度H〕的因素及提高柱效的途徑。*34二、速率理論-影響柱效的因素1956年荷蘭學(xué)者范弟姆特〔VanDeemter)等提出了色譜過程的動力學(xué)理論，他們吸收了塔板理論的概念，并把影響塔板高度的動力學(xué)因素結(jié)合進(jìn)去，導(dǎo)出了塔板高度H與載氣線速度u的關(guān)系。1.速率方程〔也稱范.弟姆特方程式〕H=A+B/u+C·uH：理論塔板高度;u：載氣的線速度(cm/s)減小A、B、C三項可提高柱效；存在著最正確流速；A、B、C三項常數(shù)各與哪些因素有關(guān)？*35A─渦流擴(kuò)散項

A=2λdp

dp：固定相的平均顆粒直徑λ：固定相的填充不均勻因子

固定相顆粒越小dp↓，填充的越均勻，A↓，H↓，柱效n↑。表現(xiàn)在渦流擴(kuò)散所引起的色譜峰變寬現(xiàn)象減輕，色譜峰較窄。對于空心毛細(xì)管柱，A項為零。〔動畫〕*36B/u—分子擴(kuò)散項B=2γDgγ：彎曲因子，空心毛細(xì)管,γ=1；填充柱色譜,γ<1。Dg：試樣組分分子在氣相中的擴(kuò)散系數(shù)〔cm2·s-1〕(1)存在著濃度差，產(chǎn)生縱向擴(kuò)散;(2)擴(kuò)散導(dǎo)致色譜峰變寬，H↑(n↓)，別離變差;(3)分子擴(kuò)散項與流速有關(guān)，流速↓，滯留時間↑，擴(kuò)散↑;(4)擴(kuò)散系數(shù)Dg與組分及載氣的性質(zhì)有關(guān)：Dg∝(M載氣)-1/2；M載氣↑，B值↓。Dg∝〔M組分〕-1〔5〕擴(kuò)散系數(shù)Dg隨柱溫升高而增加。〔動畫〕*37

k為容量因子；Dg、DL為擴(kuò)散系數(shù)。

減小擔(dān)體粒度，選擇小分子量的氣體作載氣，可降低傳質(zhì)阻力。C·u—傳質(zhì)阻力項傳質(zhì)阻力系數(shù)包括氣相傳質(zhì)阻力Cg和液相傳質(zhì)阻力CL系數(shù)即：C=〔Cg+CL〕〔動畫〕*382.載氣流速與柱效——最正確流速載氣流速高時：

傳質(zhì)阻力項是影響柱效的主要因素，流速，柱效。載氣流速低時：

分子擴(kuò)散項成為影響柱效的主要因素，流速,柱效。H-u曲線與最正確流速：由于流速對這兩項完全相反的作用，流速對柱效的總影響使得存在著一個最正確流速值，即速率方程式中塔板高度對流速的一階導(dǎo)數(shù)有零值點。以塔板高度H對應(yīng)載氣流速u作圖，曲線最低點的流速即為最正確流速。*39最正確流速uopt與最小理論塔板高度Hmin*403.速率理論的要點(1)組分分子在柱內(nèi)運行的多路徑與渦流擴(kuò)散、濃度梯度所造成的分子擴(kuò)散及傳質(zhì)阻力使氣液兩相間的分配平衡不能瞬間到達(dá)等因素是造成色譜峰擴(kuò)展，柱效下降的主要原因。(2)通過選擇適當(dāng)?shù)墓潭ㄏ嗔６?、載氣種類、液膜厚度及載氣流速可提高柱效。(3)速率理論為色譜別離和操作條件選擇提供了理論指導(dǎo)。說明了流速和柱溫對柱效及別離的影響。(4)各種因素相互制約，如載氣流速增大，分子擴(kuò)散項的影響減小，使柱效提高，但同時傳質(zhì)阻力項的影響增大，又使柱效下降；柱溫升高，有利于傳質(zhì)，但又加劇了分子擴(kuò)散的影響，選擇最正確條件，才能使柱效到達(dá)最高。*41三、別離度塔板理論和速率理論都難以描述難別離物質(zhì)對的實際別離程度。即柱效為多大時，相鄰兩組份能夠被完全別離。難別離物質(zhì)對的別離度大小受色譜過程中兩種因素的綜合影響：保存值之差──色譜過程的熱力學(xué)因素；區(qū)域?qū)挾醛ぉどV過程的動力學(xué)因素。色譜別離中的四種情況如下圖：*42討論：色譜別離中的四種情況的討論：①柱效較高，△K(分配系數(shù))較大,完全別離；②△K不是很大，柱效較高，峰較窄，根本上完全別離；③柱效較低，△K較大,但別離的不好；④△K小，柱效低，別離效果更差。*43別離度的表達(dá)式：別離度同時反映色譜柱效能和選擇性的一個綜合指標(biāo).定義為相鄰兩組分色譜峰保存值之差與兩個組分色譜峰峰底寬度總和一半的比值。*44R=1.5R=0.75R=1.0響應(yīng)信號保留時間t,min*45R=0.8：兩峰的別離程度可達(dá)89%，有局部重疊；R=1：別離程度98%；R=1.5：達(dá)99.7%〔相鄰兩峰完全別離的標(biāo)準(zhǔn)〕。*46色譜根本別離方程式R的定義并未反映影響別離度的各種因素。也就是說，R未與影響其大小的因素：柱效n、選擇因子和保存因子k聯(lián)系起來。對于相鄰的難別離組分，由于它們的分配系數(shù)K相差小，可合理假設(shè)k1k2=k，W1W2=W。因此可導(dǎo)出R與n、和k的關(guān)系：*47*48討論：〔1〕別離度與柱效的關(guān)系〔柱效因子n)別離度與柱效因子n的平方根成正比，r2,1一定時，增加柱長以增加柱效n，可提高別離度，但組分保存時間增加且峰擴(kuò)展，分析時間長。增加n值得另一方法是減小柱的H值〔2〕別離度與選擇因子r2,1的關(guān)系增大r2,1是提高別離度的最有效方法，計算可知，在相同別離度下，當(dāng)r2,1增加一倍，需要的n有效減小10000倍。增大r2,1的最有效方法是選擇適宜的固定相。*49(3)別離度R分配比k的關(guān)系k增加，別離度R增加，但當(dāng)k>10，那么R的增加不明顯。通常k在2~10之間。改變k的方法有：適當(dāng)增加柱溫(GC)、改變流動相性質(zhì)和組成(LC)以及固定相含量。*50色譜別離中的問題由于分析物組成復(fù)雜，以某一組成的流動相可能使局部待測物得到好的別離，但同時又使其它待測物的別離不令人滿意！實際工作中采用程序升溫〔GC〕和梯度淋洗〔LC〕來解決這個問題。*51分析時間t

分析時間通常指最后一個組分出峰的時間。其值為可見，分析時間與R，，k、H/u等參數(shù)有關(guān)。R增加1倍，分析時間那么是原來的4倍。實際工作中，即要能獲得有效的別離，又要在較短時間內(nèi)完成分析。*52

色譜的定性分析色譜的定性分析〔1〕將物直接和未知物對照進(jìn)行定性〔2〕利用文獻(xiàn)的保存數(shù)據(jù)進(jìn)行定性〔3〕利用經(jīng)驗規(guī)律定性〔4〕與化學(xué)方法結(jié)合定性〔5〕與其它儀器連用進(jìn)行定性色譜的定性分析：是指確定試樣的組成，即確定每個色譜峰代表什么組分。*53色譜的定量分析色譜的響應(yīng)信號：色譜的響應(yīng)信號是峰高或峰面積。一般來說，峰面積的大小不受操作條件如柱溫、流動相的流速、進(jìn)樣速度等條件的影響，從這一點來說，峰面積更適合于定量分析。標(biāo)準(zhǔn)曲線法標(biāo)準(zhǔn)參加法*54請選擇內(nèi)容：第一節(jié)色譜法概述generalizationofchromatographanalysis第二節(jié)色譜理論根底fundamentalofchromatographtheory結(jié)束*55色譜法液相色譜法氣相色譜法氣-液色譜法氣-固色譜法液-固色譜法液-液色譜法*56色譜流出曲線的意義：色譜峰數(shù)=樣品中單組份的最少個數(shù)；色譜保存值——定性依據(jù)；色譜峰高或面積——定量依據(jù)；色譜保存值或區(qū)域?qū)挾取V柱別離效能評價指標(biāo)；色譜峰間距——固定相或流動相選