毒物分析第五章課件

第五章毒物分析常用方法-免疫分析

1959年Berson等建立放射免疫分析(RadioImmunoassay,RIA)，是一種將同位素放射測量與免疫原理相結(jié)合的分析方法。用于微量分析，檢測限達(dá)到pg級(1×10-12g)。1971年Engvall等在RIA的基礎(chǔ)上,建立酶標(biāo)免疫分析(Enzyme-LabledImmunoassay,EIA)。用酶標(biāo)代替放射性同位素標(biāo)記。無放射危害，操作方便、安全。

1，基本原理免疫分析的本質(zhì)是抗原(Antigen,Ag)-抗體(Antibody,Ab)的競爭結(jié)合反應(yīng)。將純化的待測物質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)品作為抗原,免疫動物，使其產(chǎn)生特異性抗體，然后根據(jù)Ag與其標(biāo)記物（*Ag：標(biāo)記抗原）對Ab的特異性競爭結(jié)合的程度測定Ag的含量。

2023/7/101新疆醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院藥分/分析教研室由于Ag和*Ag對Ab具有同等的親和力，因此在免疫反應(yīng)中，當(dāng)*Ag，Ab濃度恒定，并且[*Ag]＞[Ab]時(shí)，若加入Ag將發(fā)生以下反應(yīng)：2023/7/102新疆醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院藥分/分析教研室設(shè)：F/B=1:1

2*Agt+2Agt+2Ab→*Agf+Agf+*AgAb+AgAb2023/7/103新疆醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院藥分/分析教研室在系列試管中加入規(guī)定量*Ag、Ab，再依次加入已知不等量Ag，培育后分離Agf與AgAb，測定放射活性。以B/F或F/B作縱座標(biāo)，對Agt作圖。據(jù)此可測定未知Ag濃度。2023/7/104新疆醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院藥分/分析教研室RIA標(biāo)準(zhǔn)曲線

待測物濃度(Ag,conc.)與所測得的反應(yīng)計(jì)量值(*Ag-Ab)呈反比

2023/7/105新疆醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院藥分/分析教研室

2.2，標(biāo)記

⑴、放射性同位素標(biāo)記通常半抗原先與酪氨酸偶合，然后標(biāo)記。目前最常用的放射性同位素是碘-125（半衰期60天，含量：95﹪，能量低：約40KeV）。或3H標(biāo)記Ag。能譜儀檢測（3H標(biāo)記，用液閃測定）。

⑵、酶標(biāo)免疫分析用特異性酶作標(biāo)記，例如嗎啡用蘋果酸脫氫酶(malatedehy-drogenase,MD)標(biāo)記，形成嗎啡-MD。測定時(shí)被測嗎啡與嗎啡-MD競爭性結(jié)合嗎啡抗體。由于嗎啡-MD結(jié)合愈多其活性愈小，測定底物濃度即可計(jì)算分析物含量。2023/7/107新疆醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院藥分/分析教研室

名稱來源分子量底物測定方法溶菌酶雞蛋清14000細(xì)胞壁比色法葡萄糖淀粉酶酵母淀粉比色法辣根過氧化物酶辣根40000H2O2/5-氨基水楊酸比色法b-半乳糖苷酶大腸桿菌51800鄰硝基酚比色法、熒光法2023/7/108新疆醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院藥分/分析教研室2.3、抗體產(chǎn)生

抗體的產(chǎn)生是RIA的關(guān)鍵，通常用50-100mg抗原加佐劑混合后給家兔、豚鼠或羊等動物全身多點(diǎn)皮下注射（或腳底、皮內(nèi)、肌肉等）。注射適當(dāng)次數(shù)后取血做滴度測定。由于純化抗體困難，因此用抗血清(Antisera)代替。2.4、標(biāo)準(zhǔn)曲線制備

放射免疫分析A，根據(jù)待測樣品的最低濃度及滴度曲線，選定Ab稀釋度，在一系列試管中加入等量的*Ag及抗血清。然后加入不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)Ag進(jìn)行培育（在pH7.4磷酸鹽-三羥甲基氨基甲烷緩沖液中，37℃進(jìn)行）；B，通過活性炭、硅藻土或凝膠柱使*Agf及*AgAb分離。C，清液測定放射活性，以B/F或F/B對Ag濃度作圖。2023/7/109新疆醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院藥分/分析教研室3、應(yīng)用3.1、放射免疫分析

尿中D9-THC(四氫大麻酚)的測定：檢測限15mg/L，誤差±4%。吸食后尿中排出高峰在2-6hr，持續(xù)排出24hr。藥物靈敏度藥物靈敏度嗎啡100pg咖啡因30pg巴比妥30pg箭毒5pg洋地黃毒甙2ng氯丙嗪5ng2023/7/1010新疆醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院藥分/分析教研室

3.2、酶免疫分析

⑴、血、尿中苯丙胺的測定：溶菌酶標(biāo)記，檢測樣品僅需0.05ml，檢測限40ng，誤差±0.02mg/L。⑵、血、尿中嗎啡的測定：溶菌酶標(biāo)記，檢測限0.5mg/ml2023/7/1011新疆醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院藥分/分析教研室1.空白試驗(yàn):空白試驗(yàn)是在實(shí)行一個(gè)檢測方法時(shí),除了不加入已知欲檢測物以外,其他所用檢驗(yàn)材料,溶劑,試劑,器皿,設(shè)備,操作步驟等等都完全與所作檢驗(yàn)中的相同;也稱為空白對照試驗(yàn).

2.毒性作用:生物體受到一定量的毒物作用而引起功能性和器質(zhì)