核酸的分離純化

核酸的分離純化第1頁，課件共85頁，創(chuàng)作于2023年2月DNA和RNA是生物體中最重要的核酸分子，是分子生物學和分子診斷的研究對象DNA和RNA的分離純化是分子生物學研究及分子診斷最基礎的工作第2頁，課件共85頁，創(chuàng)作于2023年2月核酸分離純化的原則:保持核酸一級結構的完整性盡可能提高核酸制品的純度第3頁，課件共85頁，創(chuàng)作于2023年2月核酸分子提取的技術路線I.材料準備II.破碎細胞或包膜－內容物釋放III.核酸分離、純化IV.沉淀或吸附核酸，并去除雜質

V.核酸溶解在適量緩沖液或水中第4頁，課件共85頁，創(chuàng)作于2023年2月第一節(jié)核酸分離純化的設計及原則第二節(jié)基因組DNA的分離純化第三節(jié)質粒DNA的提取與純化第四節(jié)RNA的分離純化第五節(jié)核酸的保存與鑒定第5頁，課件共85頁，創(chuàng)作于2023年2月第一節(jié)核酸分離純化的設計及原則

第6頁，課件共85頁，創(chuàng)作于2023年2月一、材料與方法的選擇二、技術路線的設計三、核酸的鑒定與保存第7頁，課件共85頁，創(chuàng)作于2023年2月（一）材料與方法的選擇

不同的研究目的對核酸的完整性、純度、產量及濃度有不同的要求。需考慮制備核酸所需的時間與成本應選擇安全的試劑與制備方案一、材料與方法的選擇第8頁，課件共85頁，創(chuàng)作于2023年2月

1.保持核酸堿基序列的完整性

2.盡量清除其它分子的污染，保證核酸純度

3.保持核酸的完整性

盡量簡化分離純化步驟，縮短提取時間

盡量避免各種有害因素對核酸的破壞（二）選擇原則一、材料與方法的選擇第9頁，課件共85頁，創(chuàng)作于2023年2月二、技術路線的設計（一）核酸的釋放（二）核酸的分離與純化（三）核酸的濃縮、沉淀與洗滌第10頁，課件共85頁，創(chuàng)作于2023年2月（一）核酸的釋放

DNA和RNA均位于細胞內（病毒除外），因此核酸分離與純化的第一步即是裂解細胞、釋放核酸。第11頁，課件共85頁，創(chuàng)作于2023年2月第12頁，課件共85頁，創(chuàng)作于2023年2月

應該清除的雜質主要包括:1.非核酸的大分子污染物蛋白質、多糖及脂類物質等

2.非需要的核酸分子分離某一核酸分子時，其它核酸皆為雜質

3.加入的有機溶劑和某些金屬離子（二）核酸的分離與純化第13頁，課件共85頁，創(chuàng)作于2023年2月（三）核酸的濃縮、沉淀與洗滌沉淀是濃縮核酸最常用的方法常用的鹽類:醋酸鈉、醋酸鉀、醋酸銨、氯化鈉、氯化鉀及氯化鎂常用的有機溶劑:乙醇、異丙醇和聚乙二醇核酸沉淀常常含有少量共沉淀的鹽，需用70%～75%的乙醇洗滌去除第14頁，課件共85頁，創(chuàng)作于2023年2月三、核酸的鑒定與保存（一）核酸的鑒定（二）核酸的保存第15頁，課件共85頁，創(chuàng)作于2023年2月（一）核酸的鑒定1.濃度鑒定2.純度鑒定3.完整性鑒定第16頁，課件共85頁，創(chuàng)作于2023年2月紫外分光光度法：核酸分子中的堿基具有共軛雙鍵結構，可以吸收紫外線，其最大吸收波長為260nm。

1.濃度鑒定第17頁，課件共85頁，創(chuàng)作于2023年2月

各種堿基的紫外吸收光譜第18頁，課件共85頁，創(chuàng)作于2023年2月

熒光光度法：核酸的熒光染料溴化乙錠嵌入堿基平面后，本身無熒光的核酸在UV激發(fā)下發(fā)出紅色熒光。熒光強度的積分與溶液中核酸的含量呈正比。第19頁，課件共85頁，創(chuàng)作于2023年2月EB與DNA的結合第20頁，課件共85頁，創(chuàng)作于2023年2月第21頁，課件共85頁，創(chuàng)作于2023年2月

紫外分光光度法：主要通過A260與A280的比值來判定有無蛋白質的污染。比值升高或降低均提示制備的核酸純度不佳。

2.純度鑒定第22頁，課件共85頁，創(chuàng)作于2023年2月1.DNA或RNA的定量OD260=1.0相當于50μg/ml雙鏈DNA40μg/ml單鏈DNA（或RNA）20μg/ml寡核苷酸2.判斷核酸樣品的純度DNA純品:OD260/OD280=1.8RNA純品:OD260/OD280=2.0第23頁，課件共85頁，創(chuàng)作于2023年2月熒光光度法：

EB等熒光染料示蹤的核酸電泳可判定核酸制品的純度。第24頁，課件共85頁，創(chuàng)作于2023年2月瓊脂糖凝膠電泳：以EB為示蹤劑的核酸凝膠電泳可判定核酸制品的完整性基因組DNA如果發(fā)生降解，電泳圖呈拖尾狀

3.完整性鑒定第25頁，課件共85頁，創(chuàng)作于2023年2月DNA的降解第26頁，課件共85頁，創(chuàng)作于2023年2月

完整的或降解很少的總RNA電泳圖譜中，三條帶熒光強度應呈特定的比值。沉降系數大，電泳遷移率低，熒光強度高沉降系數小，電泳遷移率高，熒光強度低

第27頁，課件共85頁，創(chuàng)作于2023年2月28S（或23S）RNA的熒光強度一般約為18S（或16S）RNA的2倍，否則提示有RNA的降解若在點樣孔附近有著色條帶，提示可能存在DNA的污染第28頁，課件共85頁，創(chuàng)作于2023年2月第29頁，課件共85頁，創(chuàng)作于2023年2月（二）核酸的保存

1.DNA的儲存2.RNA的儲存第30頁，課件共85頁，創(chuàng)作于2023年2月

溶于TE緩沖液中的DNA在-70℃冰箱可保存數年。

TE的pH為8.0時，DNA的脫氨反應減少，pH低7.0時DNA易變性。

1.DNA的保存第31頁，課件共85頁，創(chuàng)作于2023年2月

2.RNA的保存

RNA溶于H2O或0.3mol/L的NaAc溶液中，-70℃

保存

RNA溶液中加入RNasin或VRC，可延長保存時間用于配置試劑及溶解RNA的H2O均應經DEPC處理第32頁，課件共85頁，創(chuàng)作于2023年2月第二節(jié)真核基因組DNA的分離純化

第33頁，課件共85頁，創(chuàng)作于2023年2月生物體組織細胞玻棒纏繞法酚抽提法基因組DNA粗品PFGE分離特定的DNA片段AGE分離PAGE分離乙醇沉淀洗滌基因組DNA純品精分離粗分離前處理離子交換層析純化有機溶劑抽提細胞裂解蛋白質變性沉淀降解DNA釋放甲酰胺解聚法

哺乳動物基因組DNA分離純化的一般技術路線第34頁，課件共85頁，創(chuàng)作于2023年2月基因組DNA的提取

酚抽提法樣品的準備細胞的裂解蛋白質變性DNA的抽提DNA的沉淀第35頁，課件共85頁，創(chuàng)作于2023年2月血基因組DNA試劑盒酵母基因組DNA試劑盒細菌基因組DNA試劑盒細胞基因組DNA試劑盒第36頁，課件共85頁，創(chuàng)作于2023年2月一、酚抽提法二、甲酰胺解聚法三、玻棒纏繞法四、其它方法五、DNA片段的純化六、DNA片段的回收第37頁，課件共85頁，創(chuàng)作于2023年2月

一、酚抽提法1976年由Stafford及其同事創(chuàng)立，現在使用的是改進的方法以含EDTA、SDS及RNase的裂解緩沖液裂解細胞經蛋白酶K處理后，用pH8.0的Tris飽和酚抽提，獲得DNA粗制品第38頁，課件共85頁，創(chuàng)作于2023年2月第39頁，課件共85頁，創(chuàng)作于2023年2月二、甲酰胺解聚法

1987年Kupiec等報道了甲酰胺解聚法，其中細胞裂解和蛋白質水解步驟同酚抽提法，但不進行酚的抽提。第40頁，課件共85頁，創(chuàng)作于2023年2月

三、玻棒纏繞法玻棒纏繞法是在Bowtell(1987)方法的基礎上經改進而來第41頁，課件共85頁，創(chuàng)作于2023年2月四、其它方法

有些分子診斷技術并不需要高分子量的DNA樣品，因此步驟簡化、操作簡便的DNA快速提取法廣泛使用。

1.異丙醇沉淀法

2.玻璃珠吸附法第42頁，課件共85頁，創(chuàng)作于2023年2月五、DNA片段的純化常用的純化方法：有機溶劑抽提法柱層析法（columnchromatography）第43頁，課件共85頁，創(chuàng)作于2023年2月第44頁，課件共85頁，創(chuàng)作于2023年2月六、DNA片段的回收原則與要求:

1.提高片段的回收率

2.清除回收的DNA樣品中的雜質第45頁，課件共85頁，創(chuàng)作于2023年2月（二）從聚丙烯酰胺凝膠中回收DNA片段（一）從瓊脂糖凝膠中回收DNA片段第46頁，課件共85頁，創(chuàng)作于2023年2月1.二乙基氨基乙基-纖維素膜插片電泳法2.電泳洗脫法3.冷凍擠壓法4.低熔點瓊脂糖凝膠挖塊回收法

（一）從瓊脂糖凝膠中回收DNA片段第47頁，課件共85頁，創(chuàng)作于2023年2月（二）從聚丙烯酰胺凝膠中回收DNA片段標準方法是壓碎與浸泡法。費時但操作簡單，是小片段DNA回收的較好方法。第48頁，課件共85頁，創(chuàng)作于2023年2月第三節(jié)質粒DNA的提取與純化

第49頁，課件共85頁，創(chuàng)作于2023年2月質粒是細菌內獨立于染色體并能自我復制的小環(huán)狀DNA分子其大小范圍從lkb至200kb以上不等已經在形形色色的細菌類群中發(fā)現質粒這些質粒都是獨立于細菌染色體之外進行復制和遺傳的輔助性遺傳單位。質粒是攜帶外源基因進入細菌中擴增或表達的重要媒介物，這種基因運載工具在基因工程中具有極廣泛的應用價值，而質粒的分離與提取則是最常用、最基本的實驗技術。第50頁，課件共85頁，創(chuàng)作于2023年2月第51頁，課件共85頁，創(chuàng)作于2023年2月質粒特性1.分子相對小2.含有高效的自主復制成分3.不相容性4.轉移性5.選擇的標記6.限制性內切酶單一切。第52頁，課件共85頁，創(chuàng)作于2023年2月第53頁，課件共85頁，創(chuàng)作于2023年2月質粒DNA的提取和純化1．細菌的培養(yǎng)

先分離單個菌落，接種到含少量適當抗生素的培養(yǎng)基中擴增，隨著細菌的生長，質粒DNA也在自主復制。質粒DNA的小量制備2-5ml質粒DNA的大量制備500ml{第54頁，課件共85頁，創(chuàng)作于2023年2月2．細菌的收集細胞生長過程中，排出大量代謝產物，為了提高質粒DNA的純度，離心棄上清，細菌沉淀最好用STE或生理鹽水懸浮，漂洗l-2次，離心管壁上的液體也應該仔細去除干凈

第55頁，課件共85頁，創(chuàng)作于2023年2月 堿裂解法 煮沸法

SDS裂解法

Triton-溶菌酶法3．細菌的裂解方法4．質粒DNA的提取

適用于大質粒DNA

不適宜含糖高的菌株如HB101第56頁，課件共85頁，創(chuàng)作于2023年2月二、煮沸裂解法三、SDS裂解法四、其他方法一、堿裂解法五、質粒DNA的純化第57頁，課件共85頁，創(chuàng)作于2023年2月一、堿裂解法

在強堿（pH12.0～12.6）條件下，用SDS破壞細胞壁和裂解細胞，并使細胞的蛋白質與DNA發(fā)生變性，釋放出質粒DNA。第58頁，課件共85頁，創(chuàng)作于2023年2月細胞裂解后，細胞壁、細胞膜的碎片、變性的蛋白質和染色體DNA形成大的復合物當pH調至中性，質粒DNA重新恢復天然的超螺旋結構在高鹽條件下沉淀，經離心分離，質粒DNA保留在上清液中第59頁，課件共85頁，創(chuàng)作于2023年2月第60頁，課件共85頁，創(chuàng)作于2023年2月二、煮沸裂解法

將細菌懸浮于含TritonX-100和溶菌酶的緩沖液中，TritonX-100和溶菌酶能破壞細胞壁，再用沸水浴裂解細胞，并使宿主細胞的蛋白質與DNA變性。第61頁，課件共85頁，創(chuàng)作于2023年2月質粒DNA因結構緊密不會解鏈，當溫度下降后，可重新恢復其天然超螺旋結構通過離心去除變性的蛋白質和染色體DNA,然后回收上清液中的質粒DNA第62頁，課件共85頁，創(chuàng)作于2023年2月三、SDS裂解法將細菌懸浮于等滲的蔗糖溶液中，用溶菌酶和EDTA處理以破壞細胞壁用SDS裂解去壁細胞，溫和釋放質粒到等滲液中用酚/氯仿抽提，乙醇沉淀、洗滌質粒DNA第63頁，課件共85頁，創(chuàng)作于2023年2月由于條件溫和，SDS裂解法特別適用于大質粒DNA（>15kb）的提取。但由于部分質粒DNA會與細胞碎片纏繞在一起而丟失，故產率不高。第64頁，課件共85頁，創(chuàng)作于2023年2月四、其他方法（二）牙簽少量制備法(一)小量一步提取法第65頁，課件共85頁，創(chuàng)作于2023年2月直接將酚/氯仿與細菌培養(yǎng)物混合，然后離心去除大部分蛋白質和染色體DNA，最后從上清液中回收質粒DNA簡單快捷、成本低，提取的質?？捎糜谙拗菩詢惹忻笀D譜分析(一)小量一步提取法第66頁，課件共85頁，創(chuàng)作于2023年2月（二）牙簽少量制備法用牙簽直接挑取生長在瓊脂平板上的細菌菌落制備質粒DNA由于制備的質粒DNA有較多污染，不能用于分子克隆中的酶學反應，但可用于質粒的鑒定第67頁，課件共85頁，創(chuàng)作于2023年2月五、質粒DNA的純化１.CsCl-EB法２.聚乙二醇沉淀法３.柱層析法第68頁，課件共85頁，創(chuàng)作于2023年2月

在過量EB存在的條件下，各種不同密度的物質經離心平衡后得以分開。蛋白質由于密度小而浮于液面RNA密度大而沉于管底各種DNA密度介于蛋白質與RNA之間，處于中部EB-CsCl密度梯度離心法第69頁，課件共85頁，創(chuàng)作于2023年2月第70頁，課件共85頁，創(chuàng)作于2023年2月不同分子構型的DNA與EB的結合能力不同，密度下降也不同，因而可將它們有效分離開。

染色體DNA、開環(huán)質粒DNA等可嵌入更多的EB，因而密度下降較多

閉環(huán)質粒DNA為超螺旋三級結構，EB不易插入而結合量少，密度下降較少

第71頁，課件共85頁，創(chuàng)作于2023年2月第72頁，課件共85頁，創(chuàng)作于2023年2月第四節(jié)真核細胞RNA的分離純化

第73頁，課件共85頁，創(chuàng)作于2023年2月細胞RNA的含量

每個細胞的RNA量約為10-5

μg80%-85%rRNA10%-15%tRNA1%-5%mRNA

其他RNA：hnRNA、snRNA、snoRNA…第74頁，課件共85頁，創(chuàng)作于2023年2月

二、酸性異硫氰酸胍-酚-氯仿一步法

三、商品化試劑單相裂解法

四、mRNA的分離純化一、RNA制備的條件與環(huán)境第75頁，課件共85頁，創(chuàng)作于2023年2月一、RNA制備的條件與環(huán)境RNA易被RNase水解，RNase除細胞內還廣泛存在于人的皮膚、唾液、汗液及周圍的環(huán)境中RNase分子結構中的二硫鍵使其生物學活性非常穩(wěn)定，去除變性劑后，RNase的活性又可恢復第76頁，課件共85頁，創(chuàng)作于2023年2月去除RNase的污染和抑制其活性是RNA制備成功與否的關鍵在總RNA提取分離的最初階段，盡可能地滅活細胞內RNase的活性第77頁，課件共85頁，創(chuàng)作于2023年2月

選擇性地使用RNase的變性劑（如酚、氯仿及強烈的胍類變性劑）使用蛋白酶K使用陰離子去污劑如SDS、十二烷基肌氨酸鈉或脫氧膽酸鈉第78頁，課件共85頁，創(chuàng)作于2023年2月聯合使用RNase的特異抑制劑（如RNasin與DEPC等）能極大地防止內源性RNase對RNA