《宏基因組高通量測序技術(shù)應(yīng)用于感染性疾病病原檢測中國專家共識》(2021)要點匯總

本d檔可輯改檢（1點感染性疾病一直備受臨床關(guān)注新型冠狀病毒肺炎全球大流行世界經(jīng)濟和人類健康帶來嚴峻挑戰(zhàn)更讓病原準快速檢測成為關(guān)注泛開展基于高通量測序（也稱新一代測序技術(shù)，NGSNGS技術(shù)用的成染性疾病的病原學(xué)診斷起到?jīng)Q定性作用。然，臨床對NGS應(yīng)用的適應(yīng)證認識不足，送檢存在較大的盲目性和隨意性；操作過程復(fù)雜，缺乏規(guī)范提供檢驗的主體多元而檢測質(zhì)量良莠不齊結(jié)果解釋缺乏可信的標準誤導(dǎo)臨床的案例不鮮限制了該技術(shù)的臨應(yīng)用和普及。一、共識制定過程二、分類和術(shù)語（一）分類宏基因組高通量測序技術(shù)（mNGS）通過對臨床樣本的A或RNA細菌、真菌和寄生蟲。二代和三代測序平臺均可用于該項技術(shù)。按從臨床樣本中提取的核酸類型可以分為宏基因組測序和宏轉(zhuǎn)錄組測序。按照測序模式可以分為單端測序和雙端測序。（二）術(shù)語和定義本d檔可輯改NGS：也稱高通量測序，是一種可以同時對數(shù)數(shù)百萬條DNA分子序列進行讀取的測序技術(shù)。mNGS：m指宏基因組稱元基因組，是中全部生物（人、微基。臨床宏基因組學(xué)：含義與診斷宏基因組學(xué)類似，但應(yīng)用場景更為廣泛。微生物組：指某一個系生態(tài)環(huán)境或特定區(qū)域中微生物的總和。試劑盒基因組：游離脫糖核酸（cfDNA：讀長：文庫：比對：深度：覆蓋率：相對豐度：Q值：標定對照：無模板對照：檢出限（D：本d檔可輯改正常無菌部位：三、mNGS技術(shù)應(yīng)用于感染疾病的適應(yīng)證（一）臨床適應(yīng)證共識1對常規(guī)微生物學(xué)檢查容易明確病原體的感染如尿路感染通過尿培養(yǎng)手段，不建議mNGS。共識2患者表發(fā)熱或發(fā)熱癥病因未明符合不原因發(fā)熱定義，考慮感染或不除外感染，但規(guī)范性經(jīng)驗抗感染治療無效，考慮應(yīng)用常規(guī)技術(shù)檢測的同時，或在其基礎(chǔ)上，開展mNS。識3各種原因?qū)Ъ蔽Ｖ匕Y表現(xiàn)不除感染所致或考慮繼發(fā)或并發(fā)危及生命的嚴重感染建議常規(guī)檢測的同時或在常規(guī)檢測基礎(chǔ)上，開展mNGS。識4免疫受損患者疑似繼發(fā)感染病原學(xué)查未能致病原或/和規(guī)范性經(jīng)驗抗感染治療無效，建議進一步完善常規(guī)病原學(xué)檢測的同時，或在其基礎(chǔ)上，開展mNGS。識5疑似局部感染病原學(xué)診斷未明不則后果嚴危及生命或會導(dǎo)致局部功能不可逆性喪失）時，考慮常規(guī)檢測的同時，或在其上，開展mNGS如炎/潰眼內(nèi)炎急性視網(wǎng)膜壞死等、耳部、喉染、糖尿病足、累及深部組織等情。共識6高度疑似感染性疾病但學(xué)診斷未明確且抗感染治療導(dǎo)管、外科引流或拔去引流管、玻璃體切除、調(diào)整經(jīng)驗抗微生物治療本d檔可輯改方案的同時開展mNS。識7慢性感染或疾病不除外尤其是二者臨床相似、難以鑒別時病情嚴重或抗感染治不佳需要明確病因建議在完善常規(guī)檢測經(jīng)驗治療的同時開展mNGS。共識8除以上共識2～7之外的患者人群，不建議無條件普遍進行mNGS檢測；進行mNGS檢測前請感染病學(xué)和或臨床微學(xué)專家會診。共識9不建議應(yīng)用mNGS技術(shù)評估抗感染治療效果。（二）微生物學(xué)適應(yīng)證共識10針對微生物，考慮出似新發(fā)病原體，或某特殊體，缺乏傳統(tǒng)技術(shù)技術(shù)手段不能確定種屬時建議常同時，或在其基礎(chǔ)上，開展mNGS。共識11臨床表現(xiàn)高度懷疑感疾病而多種傳統(tǒng)技術(shù)反復(fù)不能明確致病微生物但仍高度懷疑微生物所致建議繼續(xù)完善更多檢測技術(shù)的同時或在其基礎(chǔ)上，開展mNGS。識12傳統(tǒng)病原學(xué)檢測的結(jié)果不能解釋臨床表現(xiàn)的全貌或/和抗感染治療的反應(yīng)懷疑同時存在其他病原感染時建議進一步完善更多檢測技術(shù)的同時或在其基礎(chǔ)上，開展mNS。識13感染性疾病的病原體確或高度懷疑某病原體，表現(xiàn)提示該病原體有特殊的毒力表型需要了解其毒力因相關(guān)信息時，可以考慮對感染相應(yīng)進行mNS物種鑒定的同時，采用mNGS檢測毒力基因。本d檔可輯改（三）學(xué)適應(yīng)證共識14感染發(fā)生在正常有微定植的部位，或檢測標本有污染時（如支氣管肺泡灌洗液，建議用mNGS進行耐藥性檢測。共識15感染發(fā)生在正常無微定植的部位且標本采集過染概率低時可以考慮采用mNGS進行物種鑒定的同時檢測耐藥基因并通耐藥表型試驗對耐藥基因進行驗證對有菌種特異性的耐藥性基因，在測序深度足夠時，可以考慮應(yīng)用mNGS檢測獲得性的耐藥基因，預(yù)測耐。（四）流行病學(xué)和感染控制學(xué)證共識16出現(xiàn)某種疾病的聚集病或暴發(fā)，懷疑是微生物的感染性疾病但病原不明且常規(guī)快速檢測無結(jié)果時建議完善常規(guī)檢測的同時或在其基礎(chǔ)上開展mNGS明確病微生物。共識17感染性疾病患者有特殊區(qū)北美地致病性）旅居史，或有特殊職業(yè)工作史（如畜牧業(yè)、屠宰業(yè)、水產(chǎn)業(yè)等，感染病原未明，建議常規(guī)手段檢開展mNGS。四、mNGS的基本流程和管理要求（一）標本采集共識18從正常無位采集mNGS檢測標本，應(yīng)嚴格操作，避量減少污染用于宏基因組RNA測序的標應(yīng)添酸穩(wěn)定mNS標本的運送須防污染防震蕩冷鏈快速運送標本如不能及時，本d檔可輯改應(yīng)保存于低于-70冰箱或液氮（血液標本應(yīng)分離血漿后保存。建議的常用臨床標本采集要求和相關(guān)說明見表1。（二）DNA/RNA取識19建議實驗室的核酸提程、病原體核酸提取試劑經(jīng)過驗證主背景標本提應(yīng)采用經(jīng)過驗證法去除宿主細或核酸整個提取過程有防污染措施包和陽性對照等。（三）建庫和測序共識20建議采用經(jīng)過驗證的進行建庫和測序；建庫慎種擴增方法因為會使正常菌群染病原體的序大難以判斷質(zhì)量的序確保測序原始數(shù)質(zhì)量。（四）生物信息學(xué)分析共識21建議生物信息學(xué)分析應(yīng)進行性能確認和驗證，數(shù)據(jù)庫的優(yōu)化對方法和比對參的優(yōu)化等確報告致病病原體。五、mNGS應(yīng)用于感染性病原診斷的質(zhì)管理保證（一）特殊病原體的DNA/RNA提取技術(shù)要求共識22建議病毒核酸提取應(yīng)病毒核酸的完整性；對于壁較厚的病原體應(yīng)采取常規(guī)方法以外的破壁方法。（二）標本采集、DNA/RNA提取、建庫引入的實驗室污染問題共識23污染既包括標本采集酸提取、建庫測序引入的，也包括生物信息學(xué)分析引入的污染建議實驗室自建有效的防污染策略，本d檔可輯改包括使用背景微生物庫的方法。（三）測序深度對結(jié)果的影響共識24建議實驗室驗證不同、不同感染類型病原體檢需的測序深度。（四信息學(xué)分析結(jié)疑似背景微生物原診斷結(jié)果的響共識25建議實驗室建立自己的背景微生物以控制假陽性結(jié)果。（五）病原診斷閾值的設(shè)定共識26考慮建立mS的診斷閾排除背景微生物的干擾善檢測結(jié)準確性。（六）庫對病原學(xué)診斷的影響共識27建議實驗室驗證自建據(jù)庫中物種的準確性，過據(jù)庫錯誤和不正確的序列并定期更新數(shù)據(jù)庫實驗室應(yīng)盡最大可能完善病毒、真菌生蟲數(shù)據(jù)庫，提高鑒定感性和準確性。六、mNGS應(yīng)用于感染性疾病診斷的性能和標準化共識28對mNGS整個檢測和流程進行性能是其應(yīng)用于臨床的瓶頸建議對感染性疾病常見的“性”物種進行檢出限包容性、抗干擾、精密度和交叉污染、穩(wěn)定性等的驗證。七、mNGS應(yīng)用于感染性疾報告解讀共識29解讀報告考慮如下參測序質(zhì)量（是否去除低復(fù)、低質(zhì)量序列Q2Q0等讀長特異性讀覆蓋率深度、微生物序列的數(shù)據(jù)量、閾值等。共識30本d檔可輯改mNGS檢測中建議結(jié)合不同標本類型與檢出生物的種類有菌部位（如呼吸道、尿液、開放性傷口。確認致病微生物時，應(yīng)考慮檢出微生物是否為感染部位原如腦脊出新型隱球菌，標污染菌與工程菌的影響。共識31血漿樣本對cfDNA進行mNS檢測時，建議從臨床的角度鑒植菌群所致的一過性菌血癥。共識32mNGS報告中常規(guī)容易培養(yǎng)的病原菌，建議臨床醫(yī)師結(jié)合傳統(tǒng)方法，綜合判斷其臨床價值。共識33建議對于在核酸提取中破壁困難的微生物，如桿菌真的并采用其他方法驗證特異引物的PCR或一代測序等分子生物學(xué)檢測，G試驗，GM試驗，曲霉菌IgG抗體或隱球菌莢膜多糖抗原等血清學(xué)試驗。共識34采用mNGS要將耐藥基因定位到具病原體上以明確其臨床即通過對本d檔可輯改mNGS于哪個病原體上質(zhì)粒上還是位于染色體上。共識35mNGS對于新發(fā)或少見病原微生物的檢要價值議解讀報告單前比對數(shù)據(jù)庫的內(nèi)容明確其是否涵蓋少原或新發(fā)病原。高致病性病原微生物，時與臨床聯(lián)系。共識36mNGS結(jié)果為陰性，對于排除感染較好的陰性預(yù)測值。但對于某些病原微生物，如結(jié)核分枝桿菌等，原始樣本中含量較少，或核酸提取困難的病原微生物慮mNGS檢測靈敏度較低性預(yù)測性差，并不一定優(yōu)于PCR等常規(guī)檢測方案。共識37建立mNGS病原診斷值影響因素較多測序流程、各實驗室建立自已的閾值，并在臨床工作中加以驗證。共識38不同病原微生物讀長果判斷的影響：同等條件相同微生物，相同標本，如某一微生物檢出的讀長數(shù)量多，為致病微生菌細菌病毒核酸提取效率存在差［難易程度毒n性菌/n革蘭陽性（不包括分枝需氧放線菌等n，致病力去甚遠因此不能僅僅依靠讀長多