代謝組學(xué)：基于質(zhì)譜的研究方法課件

代謝組學(xué)：基于質(zhì)譜的研究方法匯報(bào)人：張富昌指導(dǎo)教師：田中民西安交通大學(xué)2014年4月13日實(shí)用文檔內(nèi)容提要一、代謝組學(xué)基本知識(shí)二、GC-MS和LC-MS三、發(fā)現(xiàn)代謝組學(xué)實(shí)用文檔一、代謝組學(xué)基本知識(shí)1、什么是代謝組學(xué)代謝組學(xué)是通過比較對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組的代謝組（metabolomes，某一生物的所有代謝物組分），以尋找其它代謝譜差異的研究方法。這些差異可能與臨床生物標(biāo)志物發(fā)現(xiàn)中研究的某些疾病相關(guān)，也可能與藥物研發(fā)毒理研究中候選藥物攝入后的代謝改變有關(guān)。實(shí)用文檔一、代謝組學(xué)基本知識(shí)2、代謝組學(xué)的一般流程發(fā)現(xiàn)代謝組學(xué)靶向代謝組學(xué)代謝組學(xué)實(shí)用文檔一、代謝組學(xué)基本知識(shí)3、發(fā)現(xiàn)代謝組學(xué)的一般流程鑒定，進(jìn)行代謝譜分析后，測(cè)定這些代謝物的化學(xué)結(jié)構(gòu)代謝譜分析（也稱為差異表達(dá)分析），在一組實(shí)驗(yàn)和對(duì)照樣品中，尋找豐度改變有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的感興趣代謝物解釋，研究流程的最后一步，解釋所發(fā)現(xiàn)的代謝物與生物過程或生物狀態(tài)之間的關(guān)聯(lián)實(shí)用文檔一、代謝組學(xué)基本知識(shí)4、靶向代謝組學(xué)的一般流程靶向代謝組學(xué)分析的重點(diǎn)是采用大量天然和生物變異樣本，驗(yàn)證預(yù)先確認(rèn)的代謝物。需要用分析標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行定量分析。實(shí)用文檔一、代謝組學(xué)基本知識(shí)5、代謝組學(xué)的一般流程實(shí)用文檔二、GC-MS和LC-MS1、質(zhì)譜在代謝組學(xué)中的應(yīng)用質(zhì)譜(MS)因具有廣泛的動(dòng)態(tài)范圍、能進(jìn)行可重現(xiàn)的定量分析，而且能夠分析非常復(fù)雜的生理體液，已被用于代謝組學(xué)的研究中。由于這類樣品的復(fù)雜性，為了盡可能多地檢測(cè)代謝物，在質(zhì)譜分析之前常常還要進(jìn)行分離（氣相色譜、液相色譜或毛細(xì)管電泳）實(shí)用文檔2、代謝組學(xué)中所用的分離技術(shù)氣相色譜(GC)GC要求揮發(fā)性，要用化學(xué)衍生化的樣品液相色譜(LC)不能完全解決代謝組中親水組分的分離問題毛細(xì)管電泳(CE)所用的緩沖液卻不能與質(zhì)譜儀的離子源兼容

親水相互作用色譜(HILIC)二、GC-MS和LC-MS實(shí)用文檔3、代謝組學(xué)的挑戰(zhàn)1、典型的代謝組學(xué)實(shí)驗(yàn)需大量樣品才能得到精確統(tǒng)計(jì)的結(jié)果2、代謝組學(xué)研究通常需要多種技術(shù)；某種類型的樣品往往比其他樣品更適合采用某種特定的分析技術(shù)3、需要高度靈敏和精確的儀器4、強(qiáng)大的軟件工具對(duì)處理實(shí)驗(yàn)所產(chǎn)生的大量數(shù)據(jù)非常重要

處理GC/MS和LC/MS數(shù)據(jù)的色譜解卷積程序、尋找有意義代謝物的一系列統(tǒng)計(jì)分析工具、幫助鑒定代謝物的代謝物數(shù)據(jù)庫，以及最終繪制分子間相互作用網(wǎng)絡(luò)圖的生物信息學(xué)軟件等。二、GC-MS和LC-MS實(shí)用文檔4、GC/MS分析氣相色譜和質(zhì)譜(GC/MS)是分析揮發(fā)性化學(xué)物質(zhì)的有效組合。氣相色譜使用運(yùn)載氣推動(dòng)分析物通過涂漬的熔融石英毛細(xì)管?；诜治鑫镌跉庀嗪兔?xì)管內(nèi)涂層之間的不同分配實(shí)現(xiàn)分離。二、GC-MS和LC-MS實(shí)用文檔4、GC/MS分析電子轟擊電離(EI)是GC/MS最常用的電離技術(shù)，非常耐用而且重現(xiàn)性好，而且不會(huì)受離子抑制的影響簡(jiǎn)單的鑒定方法只需要扣除了背景的EI圖譜，和一個(gè)通用EI譜庫檢索，如NIST譜庫。更有效的鑒定方法是采用包含了預(yù)期的化合物保留時(shí)間和EI圖譜的特定應(yīng)用數(shù)據(jù)庫同時(shí)對(duì)分析物的色譜保留時(shí)間和質(zhì)譜圖進(jìn)行檢索二、GC-MS和LC-MS實(shí)用文檔4、GC/MS分析

EI源的缺點(diǎn)

EI電離經(jīng)常會(huì)導(dǎo)致分子離子的丟失------找不到匹配的EI譜------缺少的分子離子的質(zhì)量信息將使可能的化合物的數(shù)量變得非常龐大因此，GC/MS最適合對(duì)已知的或預(yù)期的代謝物進(jìn)行分析二、GC-MS和LC-MS實(shí)用文檔5、LC/MS分析

液相色譜可以分離無揮發(fā)性和未衍生化的代謝物。因此，LC/MS可以分析的化合物種類范圍比GC/MS更廣電噴霧(ESI)和大氣壓化學(xué)電離(APCI)是LC/MS最常用的兩種電離技術(shù)-----ESI和APCI都可能出現(xiàn)離子抑制，因此共洗脫化合物可能被低估甚至檢測(cè)不到

二、GC-MS和LC-MS實(shí)用文檔5、LC/MS分析

目前沒有可用于LC/MS鑒定的譜庫。但由于LC/MS分析中通常都有分子離子，其質(zhì)量可以用代謝物數(shù)據(jù)庫進(jìn)行檢索，如METLIN數(shù)據(jù)庫Q-TOF可以通過分子離子計(jì)算出經(jīng)驗(yàn)式LC/MS最適合作為未知代謝物研究中的探索方法，或者在多種目標(biāo)代謝物由于揮發(fā)性問題不能用GC/MS進(jìn)行分析時(shí)采用二、GC-MS和LC-MS實(shí)用文檔6、LC/MS、GC/MS分析化合物的范圍二、GC-MS和LC-MS實(shí)用文檔三、發(fā)現(xiàn)代謝組學(xué)1、發(fā)現(xiàn)代謝組學(xué)的概念發(fā)現(xiàn)代謝組學(xué)主要是將對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組的代謝組（某一生物體的全部代謝物）進(jìn)行比對(duì)，以找出其代謝譜的差異。發(fā)現(xiàn)代謝組學(xué)分析一般包括以下幾個(gè)步驟：?代謝譜分析（也稱為差異表達(dá)分析），在一組實(shí)驗(yàn)和對(duì)照樣品中，尋找豐度改變有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的感興趣代謝物?鑒定，進(jìn)行代謝譜分析后，測(cè)定這些代謝物的化學(xué)結(jié)構(gòu)?解釋，研究流程的最后一步，解釋所發(fā)現(xiàn)的代謝物與生物過程或生物狀態(tài)之間的關(guān)聯(lián)實(shí)用文檔三、發(fā)現(xiàn)代謝組學(xué)2、代謝譜分析，尋找有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的代謝物分析重現(xiàn)性對(duì)表達(dá)譜分析至關(guān)重要------分析變異越小，所需的重復(fù)數(shù)就越少代謝譜分析是經(jīng)過復(fù)雜的特征提取，對(duì)已知代謝物進(jìn)行靶向代謝譜分析，以尋找意外的代謝物------代謝物以其分子特征為標(biāo)志表示，包括保留時(shí)間、質(zhì)量或質(zhì)譜圖及豐度在代謝譜分析過程中，并不一定要知道該化合物/代謝物是什么。但為了在不同次的樣品分析之間跟蹤這些化合物，必需要用到其物理性質(zhì)實(shí)用文檔三、發(fā)現(xiàn)代謝組學(xué)3、發(fā)現(xiàn)代謝組學(xué)有以下六個(gè)步驟

1、分析，包括代謝物的分離和檢測(cè)，一般采用GC/MS或LC/MS

2、尋找特征，包括尋找樣品中的所有代謝物。一個(gè)代謝物檢測(cè)不到，就意味著喪失了一次機(jī)會(huì)；因此盡可能多地檢測(cè)出樣品中的代謝物至關(guān)重要實(shí)用文檔三、發(fā)現(xiàn)代謝組學(xué)3、發(fā)現(xiàn)代謝組學(xué)有以下六個(gè)步驟實(shí)用文檔三、發(fā)現(xiàn)代謝組學(xué)

3、數(shù)據(jù)標(biāo)準(zhǔn)化，對(duì)保留時(shí)間和響應(yīng)的漂移給予必要的校正

4、統(tǒng)計(jì)分析，用于發(fā)現(xiàn)樣品組別之間的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異

5、鑒定，GC/MS所得的EI圖譜非常適合進(jìn)行譜庫檢索

6、解釋，一旦代謝物被鑒定出來，就需要通過解釋實(shí)驗(yàn)結(jié)果，推斷其在代謝的生物通路中的地位3、發(fā)現(xiàn)代謝組學(xué)有以下六個(gè)步驟實(shí)用文檔三、發(fā)現(xiàn)代謝組學(xué)4、安捷倫GC/MS在發(fā)現(xiàn)代謝組學(xué)中的應(yīng)用在分析方面：?良好的重現(xiàn)性，以便對(duì)大量樣品進(jìn)行比對(duì)和校正?卓越的可靠性，最大限度地延長(zhǎng)正常運(yùn)行時(shí)間，分析大量樣品?高靈敏度，能夠檢測(cè)復(fù)雜樣品中的低水平代謝物，動(dòng)態(tài)范圍超過6個(gè)數(shù)量實(shí)用文檔三、發(fā)現(xiàn)代謝組學(xué)4、安捷倫GC/MS在發(fā)現(xiàn)代謝組學(xué)中的應(yīng)用在尋找特征方面：安捷倫提供自動(dòng)化質(zhì)譜解卷積和鑒定軟件(AMDIS)進(jìn)行解卷積，該軟件是NIST譜庫檢索軟件包的一部分。AMDIS軟件包設(shè)計(jì)用于：?發(fā)現(xiàn)相關(guān)的協(xié)變離子，用單組分色譜峰表示?從復(fù)雜的GC/MS數(shù)據(jù)中提取出單純組分質(zhì)譜圖?重建用于EI譜庫檢索的質(zhì)譜圖實(shí)用文檔三、發(fā)現(xiàn)代謝組學(xué)4、安捷倫GC/MS在發(fā)現(xiàn)代謝組學(xué)中的應(yīng)用在數(shù)據(jù)標(biāo)準(zhǔn)化和統(tǒng)計(jì)學(xué)分析方面：統(tǒng)計(jì)學(xué)分析軟件需要具備以下功能：?從大樣本組和復(fù)雜的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)中，對(duì)數(shù)據(jù)（包括元數(shù)據(jù)）進(jìn)行輕松輸入、標(biāo)準(zhǔn)化和對(duì)比?發(fā)現(xiàn)復(fù)雜的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)中數(shù)據(jù)間的聯(lián)系—不局限于兩兩對(duì)比?鑒定后能夠通過通路分析進(jìn)行生物學(xué)解釋安捷倫的MassProfiler專業(yè)軟件讓您能夠輕松輸入、標(biāo)準(zhǔn)化、比較并圖形化顯示大樣本組的GC/MS和LC/MS數(shù)據(jù)，從而快速發(fā)現(xiàn)代謝物標(biāo)志物，并支持元數(shù)據(jù)分析。我們用的是SIMCA-P實(shí)用文檔三、發(fā)現(xiàn)代謝組學(xué)4、安捷倫GC/MS在發(fā)現(xiàn)代謝組學(xué)中的應(yīng)用在數(shù)據(jù)標(biāo)準(zhǔn)化和統(tǒng)計(jì)學(xué)分析方面：實(shí)用文檔三、發(fā)現(xiàn)代謝組學(xué)4、安捷倫GC/MS在發(fā)現(xiàn)代謝組學(xué)中的應(yīng)用在解釋方面：

安捷倫MassProfiler專業(yè)軟件的通路分析功能，可以利用已知的或獨(dú)特的、用戶基于已有數(shù)據(jù)設(shè)定的通路進(jìn)行解釋，大大簡(jiǎn)化了這一過程實(shí)用文檔三、發(fā)現(xiàn)代謝組學(xué)5、LC/MS在發(fā)現(xiàn)代謝組學(xué)中的應(yīng)用在分析方面：

以下幾點(diǎn)對(duì)代謝譜分析非常重要：?良好的LC和MS重現(xiàn)性，以便對(duì)大量樣品進(jìn)行比對(duì)和校正?卓越的可靠性，最大限度地延長(zhǎng)正常運(yùn)行時(shí)間，分析大量樣品?高靈敏度，能夠檢測(cè)復(fù)雜樣品中的低水平代謝物，動(dòng)態(tài)范圍超過5個(gè)數(shù)量級(jí)實(shí)用文檔三、發(fā)現(xiàn)代謝組學(xué)5、LC/MS在發(fā)現(xiàn)代謝組學(xué)中的應(yīng)用在尋找特征方面：

安捷倫的MassHunterLC/MS工作站軟件包含獲得專利的分子特征提取算法，專為精確質(zhì)量LC/MS飛行時(shí)間數(shù)據(jù)而設(shè)計(jì)，能夠識(shí)別與單一化合物相關(guān)的協(xié)變離子。此外，它還能識(shí)別和解析常見的電噴霧干擾離子，如鈉加合離子或二聚體的形成。對(duì)這些離子鑒別和分組可以改善統(tǒng)計(jì)分析所用的定量估算，并從隨后的分析中除去偽數(shù)據(jù)實(shí)用文檔三、發(fā)現(xiàn)代謝組學(xué)5、LC/MS在發(fā)現(xiàn)代謝組學(xué)中的應(yīng)用在鑒定方面：

METLIN數(shù)據(jù)庫：安捷倫METLIN個(gè)人代謝物數(shù)據(jù)庫軟件是目前最全面的代謝物數(shù)據(jù)庫可以根據(jù)關(guān)鍵詞、分子式、化合物名稱，或KEGG、CAS、HMP或