高效液相色譜法課件

第十三章高效液相色譜法第一節(jié)概述高效液相色譜法：以氣相色譜為根底，在經(jīng)典液相色譜實驗和技術(shù)根底上建立的一種液相色譜法一、HPLC與經(jīng)典LC區(qū)別二、HPLC與GC差異三、高效液相色譜儀流程圖四、特點一、HPLC與經(jīng)典LC區(qū)別主要區(qū)別：固定相差異，輸液設備和檢測手段1．經(jīng)典LC：僅做為一種別離手段柱內(nèi)徑1~3cm，固定相粒徑>100μm且不均勻常壓輸送流動相柱效低〔H↑，n↓〕分析周期長無法在線檢測2．HPLC：別離和分析柱內(nèi)徑2~6mm，固定相粒徑<10μm〔球形，勻漿裝柱〕高壓輸送流動相柱效高〔H↓，n↑〕分析時間大大縮短可以在線檢測二、HPLC與GC差異相同：兼具別離和分析功能，均可以在線檢測主要差異：分析對象的差異和流動相的差異1．分析對象

GC：能氣化、熱穩(wěn)定性好、且沸點較低的樣品，高沸點、揮發(fā)性差、熱穩(wěn)定性差、離子型及高聚物的樣品不可檢測占有機物的20%

HPLC：溶解后能制成溶液的樣品，不受樣品揮發(fā)性和熱穩(wěn)定性的限制分子量大、難氣化、熱穩(wěn)定性差及高分子和離子型樣品均可檢測用途廣泛，占有機物的80%續(xù)前2．流動相差異GC：流動相為惰性氣體組分與流動相無親合作用力，只與固定相作用HPLC：流動相為液體流動相與組分間有親合作用力，為提高柱的選擇性、改善別離度增加了因素，對別離起很大作用流動相種類較多，選擇余地廣流動相極性和pH值的選擇也對別離起到重要作用選用不同比例的兩種或兩種以上液體作為流動相可以增大別離選擇性3．操作條件差異GC：加溫操作HPLC：室溫；高壓〔液體粘度大，峰展寬小〕三、高效液相色譜儀流程圖1．貯液罐（濾棒，可濾去顆粒狀物質(zhì)）2．高壓泵（輸液泵）3．進樣裝置4．色譜柱——分離5．檢測器——分析6．廢液出口或組分收集器7．記錄裝置續(xù)前四、HPLC的特點和應用“三高〞“一快〞“一廣〞高柱效——n=104片/米，柱效高〔遠高于一般LC〕高靈敏度高選擇性分析速度快應用范圍廣泛〔可分析80%有機化合物〕第二節(jié)根本理論和條件選擇熱力學理論：塔板理論——平衡理論基礎(chǔ)動力學理論：速率理論——Vander方程一、塔板理論二、速率理論三、HPLC法中別離條件的選擇一、塔板理論二、速率理論〔與GC比照〕1.續(xù)前2〕渦流擴散項及其影響next2.討論：1〕流動相流速對HPLC板高的影響〔與GC比照〕next圖示back續(xù)前3〕傳質(zhì)阻抗項及其影響圖示三、HPLC法中別離條件的選擇1.固定相與裝柱方法的選擇：選粒徑小的、分布均勻的球形固定相〔dp≤10μm〕首選化學鍵合相，勻漿法裝柱2.流動相及其流速的選擇：選粘度小、低流速的流動相——甲醇，1ml/min3.柱溫的選擇：選室溫250C左右第三節(jié)各類高效液相色譜法

一、液固吸附色譜法〔LSC〕二、液液分配色譜法〔LLC〕三、化學鍵合相色譜法〔BPC〕一、液固吸附色譜法〔LSC〕

流動相為液體，固定相為固體吸附劑1．別離機制：利用溶質(zhì)分子占據(jù)固定相外表吸附活性中心能力的差異別離前提：K不等或k不等續(xù)前2．固定相：與LC比，固定相粒徑不同〔<10μm〕〔2〕高分子多孔小球：YSG原理：吸附+分配蒹小孔凝膠作用特點：柱選擇性好，峰形好，柱效低適用：別離弱極性化合物（1）硅膠表孔硅膠（薄殼硅膠）全多孔硅膠無定形YWG5~6μm5×104球形YQG3~4μm8×108

堆積硅珠YQG3~4μm8×108理想

原理：吸附特點：峰易拖尾適用：分離極性化合物續(xù)前3．流動相：底劑〔烷烴〕+有機極性調(diào)節(jié)劑例：正己烷或庚烷+氯仿---4．影響k的因素：與固定相性質(zhì)和流動相性質(zhì)有關(guān)溶質(zhì)分子極性↑，洗脫能力↓，k↑，tR↑溶劑系統(tǒng)極性↑，洗脫能力↑，k↓，tR↓注：調(diào)節(jié)溶劑極性，可以控制組分的保存時間5．出柱順序：強極性組分后出柱，弱極性組分先出柱6．硅膠吸水量↑，LSC→LLC硅膠含水量較小吸附色譜硅膠極性較大硅膠含水量>17%分配色譜硅膠失活→載體吸附的水→固定液二、液液分配色譜法〔LLC〕1．別離機制：利用組分在兩相中溶解度的差異2．固定相：載體+固定液〔物理或機械涂漬法〕缺點：系統(tǒng)內(nèi)部壓力大，易流失，不實用固定液——極性→NLLC固定液——非極性→RLLC3．正相色譜——固定液極性>流動相極性〔NLLC〕極性小的組分先出柱，極性大的組分后出柱適于別離極性組分反相色譜——固定液極性<流動相極性〔RLLC〕極性大的組分先出柱，極性小的組分后出柱適于別離非極性組分三、化學鍵合相色譜法〔BPC〕〔一〕化學鍵合相〔二〕反相鍵合相色譜〔三〕正相鍵合相色譜〔四〕離子對色譜和離子抑制色譜〔一〕化學鍵合相利用化學反響將固定液的官能團鍵合在載體外表1．別離機制：分配+吸附〔以LLC為根底〕2．特點：1〕不易流失2〕熱穩(wěn)定性好3〕化學性能好4〕載樣量大5〕適于梯度洗脫〔二〕反相鍵合相色譜1．別離機制：疏溶劑理論正相——流動相與溶質(zhì)排斥力強，作用時間↑k↑，組分tR↑反相——流動相與溶質(zhì)排斥力弱，作用時間↓，k↓，組分tR↓2．固定相：極性小的烷基鍵合相C8柱，C18柱〔ODS柱——HPLC約80%問題〕3．流動相：極性大的甲醇-水或乙腈-水流動相極性>固定相極性底劑+有機調(diào)節(jié)劑〔極性調(diào)節(jié)劑〕例：水+甲醇，乙腈，THF續(xù)前4．流動相極性與k的關(guān)系：流動相極性↑，洗脫能力↓，k↑，組分tR↑5．出柱順序：極性大的組分先出柱極性小的組分后出柱6．適用：非極性~中等極性組分〔HPLC80%問題〕〔三〕正相鍵合相色譜1．別離機制：溶質(zhì)分子與固定相之間定向作用力、誘導力、或氫鍵作用力2．固定相：極性大的氰基或氨基鍵合相3．流動相：極性小〔同LSC〕底劑+有機極性調(diào)節(jié)劑例：正己烷+氯仿-甲醇，氯仿-乙醇續(xù)前4．流動相極性與k的關(guān)系：流動相極性↑，洗脫能力↑，組分tR↓，k↓5．出柱順序：結(jié)構(gòu)相近組分，極性小的組分先出柱極性大的組分后出柱6．適用：氰基鍵合相與硅膠的柱選擇性相似〔極性稍小〕別離物質(zhì)也相似氨基鍵合相與硅膠性質(zhì)差異大，堿性分析極性大物質(zhì)、糖類等〔四〕離子對色譜和離子抑制色譜1．反相離子對色譜法2．反相離子抑制色譜1．反相離子對色譜法〔IPC或PIC〕反相色譜中，在極性流動相中參加離子對試劑，使被測組分與其中的反離子形成中性離子對，增加k和tR，以改善別離1〕離子對試劑：烷基磺酸鈉→分析堿四丁基季胺鹽→分析酸2〕影響k的因素a．與m的極性有關(guān)〔同反相色譜〕b．與R的鏈長有關(guān)：R↑長，極性↓小，tR↑，k↑3〕適用：較強的有機酸、堿2．反相離子抑制色譜在反相色譜中，通過參加緩沖溶液調(diào)節(jié)流動相pH值，抑制組分解離，增加其k和tR，以到達改善別離的目的1〕離子抑制劑：弱酸、弱堿性物質(zhì)pH一定的緩沖溶液2〕k的影響因素：與流動相極性有關(guān)，還與pH值有關(guān)選擇流動相：應同時考慮極性及pH值酸性物質(zhì)——參加酸HActR↑，k↑堿性物質(zhì)——參加堿NH3·H2OtR↑，k↑調(diào)節(jié)pH范圍：3.0~8.0pH>8.0破壞鍵合相與載體的結(jié)合pH<3.0腐蝕柱子3〕適用：極弱酸堿物質(zhì)pH=3~7弱酸；pH=7~8弱堿；兩性化合物第四節(jié)影響別離的因素1．續(xù)前2．對流動相的要求：1〕與固定液不反響2〕對樣品有良好溶解度k=1~10k=2~5最理想的3〕與檢測器匹配：UV〔常用，測定波長應大于溶劑的截止波長〕熒光，電化學4〕使用粘度小、純度高的流動相〔甲醇，乙腈〕使用前過濾、脫氣續(xù)前

3．洗脫方式1〕等度洗脫〔恒組成溶劑洗脫〕以固定配比的溶劑系統(tǒng)洗脫組分〔一個泵〕類似GC的等溫度洗脫2〕梯度洗脫：在一定分析周期內(nèi)不斷變換流動相的種類和比例即不斷改變其極性〔兩個泵〕適于分析極性差異較大的復雜組分類似GC的程序升溫〔沸程較長樣品〕圖示第五節(jié)高效液相色譜儀1．泵：恒壓泵：流量精度不穩(wěn)恒流泵：常用2．進樣裝置1〕隔膜進樣〔高分子有機硅膠墊→進樣室〕GC系統(tǒng)壓力較小，可以HPLC系統(tǒng)壓力太大，必須停泵進樣〔早期〕2〕閥進樣：不必停泵，六通閥續(xù)前3．色譜柱：直徑4~6mm,柱長10~30cm柱效評價：色譜