基于DNA序列的相關(guān)技術(shù)教學(xué)課件

PCR原理與操作·聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PolymeraseChainReaction,簡(jiǎn)稱PCR)又稱無(wú)細(xì)胞分子克隆或特異性DNA序列體外引物定向酶促擴(kuò)增技術(shù)由美國(guó)科學(xué)家Dr.Muis發(fā)明,由于在理論和應(yīng)用上的跨時(shí)代意義,1993年H獲化學(xué)諾貝爾獎(jiǎng)。聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(polymerasechainreaction,PCR),是一種在體外快速擴(kuò)增特定基因或DNA序列的方法,故又稱為基因的體外擴(kuò)增法?；谧冃耘c復(fù)性原理的PCR技術(shù)PCR原理:由一對(duì)引物介導(dǎo),能在動(dòng)植物體外對(duì)特定基因(DNA片段進(jìn)行快速酶促擴(kuò)增,經(jīng)過(guò)n個(gè)熱循環(huán)擴(kuò)增,擴(kuò)增產(chǎn)物中所含特定基因數(shù)是原始模板數(shù)的2的n次方,使得宏觀檢測(cè)擴(kuò)增產(chǎn)物中的特定基因成為可能。靶DNA的擴(kuò)增引物2s引物1e引物互補(bǔ)鏈引物1互補(bǔ)鏈新引物w3te)不同長(zhǎng)度的鏈單位長(zhǎng)度的鏈引物2互補(bǔ)鏈C3引物1互補(bǔ)鏈目的片段(不同長(zhǎng)度的鏈未示出)錄合路鏈?zhǔn)綉?yīng)示龍圖DenaturationofdnaCycle1AnnealingofprimersElongationofprimersDenaturationofdnaCycle2↓AnnealingofprimersElongationofprimersDenaturationofdnaycle3Annealingofprimers↓ElongationofprimersCycles4,5,6,etc.23456782486280621234587802222232023周16384655361317不網(wǎng)長(zhǎng)度的觸單位長(zhǎng)的觸524288104857641s4304引之補(bǔ)引互補(bǔ)16T21613421772328845456E元!5sG80912日的片段nr3741B4拷貝PCR操作反應(yīng)體系:耐高溫的聚合酶Taq聚合酶:由棲熱水生桿菌中提純的天然酶或基因工程酶。能夠耐受髙溫,保持較強(qiáng)的聚合活性。保持酶活性的反應(yīng)緩沖液(buffer)DNA合成的原料:dNTP(與ddNTP.異同)DNA復(fù)制的模板:樣品DNA,防止交叉污染(采樣過(guò)程中和提取及處理過(guò)程中)標(biāo)準(zhǔn)的PcR反應(yīng)體系:引物:上下游引物10×擴(kuò)增緩沖液10u4種dNTP混合物各200umo/L引物模板DNA0.1~2ugTaqDNA聚合酶25uMg2+加雙或三蒸水至100u般為25u體系PCR引物設(shè)計(jì)的原則引物長(zhǎng)度:15-30bp,常用為20bp左右引物擴(kuò)增跨度:以200-500b為宜,特定條件下可擴(kuò)增長(zhǎng)至10kb的片引物堿基:G弋C含量以4060%宜,GC太少擴(kuò)增效果不佬G+C過(guò)多易出現(xiàn)非特異條帶。ATGC最好隨機(jī)分布,免5個(gè)以上的哌呤或嘧嚏核苷酸的成串排列,避免引物內(nèi)部的二級(jí)結(jié)構(gòu)和兩條引物間互釙,特別是3‘互補(bǔ),否則會(huì)形成引物二聚體,產(chǎn)生非特異的擴(kuò)增條帶。引物3‘端的堿基。特別是最末及倒數(shù)應(yīng)嚴(yán)格要求配對(duì),以免因木端堿基不配對(duì)而導(dǎo)政PCR失敗引物中有或能加上合適的酶如,被擴(kuò)增的靶序列最好有適宜的酶切位點(diǎn),這對(duì)酶切分析